Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/54902
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

Introduction

قوة الحساسة، وقد ظهرت أجهزة الاستشعار الحنق المشفرة وراثيا في الآونة الأخيرة بوصفها أداة هامة لقياس القوى القائم على الشد في الخلايا الحية، وتوفير نظرة ثاقبة كيف القوات الميكانيكية يتم تطبيقها عبر البروتينات 1، 2، 3، 4. مع هذه الأدوات، يمكن للباحثين صورة غير جراحية القوات داخل الخلايا في الخلايا الحية باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية. تتكون هذه المجسات من الحنق الزوج (المانحة والفلورسنت متقبل البروتينات، في معظم الأحيان متبرع الأزرق والأصفر متقبل) مفصولة الببتيد مرنة 3. وعلى النقيض من C- أو علامات N-الطرفية، يتم إدخال هذا الاستشعار إلى موقع داخلي من البروتين لقياس قوة ميكانيكية تنتقل عبر البروتين، ويتصرف باعتباره قياس الضغط الجزيئي. زيادة التوتر الميكانيكية عبر نتائج الاستشعار عن زيادة المسافة بين الحنق فالهواء، مما أدى إلى انخفاض الحنق 3. ونتيجة لذلك، يرتبط الحنق عكسيا مع قوة الشد.

وقد وضعت هذه المجسات على أساس الفلورسنت للبروتينات التنسيق التصاق (فينكولين 3 و تالين 4)، والبروتينات هيكل الخلية (α-actinin 5)، والبروتينات خلية خلية تقاطع (E-كادهيرين 6 و 7 و VE كادهيرين 8، وPECAM 8). ومن المعروف رابط مرونة الأكثر استخداما وتتميز بشكل جيد في هذه المستشعرات الحيوية كما TSmod ويتكون من سلسلة متكررة من 40 الأحماض الأمينية، (GPGGA) 8، والتي كانت مستمدة من سوطي الشكل العنكبوت بروتين الحرير. وقد تبين TSmod أن يتصرف باعتباره الخطي مرنة نانو الربيع، مع الاستجابة الحنق إلى 1-5 السندات الإذنية من قوة الشد 3. أطوال مختلفة من سوطي الشكل يمكن استخدامها لتغيير دينامية صآنج من حساسية TSmod الحنق القوة 9. بالإضافة إلى سوطي الشكل، إسبكترن يكرر 5 و villin خوذة الببتيد (المعروف باسم HP35) 4 وقد استخدمت مثل الببتيدات مرنة بين الحنق أزواج في أجهزة الاستشعار قوة مماثلة 4. وأخيرا، أظهر تقرير صدر مؤخرا أن TSmod يمكن أيضا أن تستخدم لكشف قوات الضغط 10.

نحن وضعت مؤخرا جهاز استشعار القوة لرابط للنواة-الهيكل الخلوي (لينك) بروتين معقد Nesprin2G باستخدام TSmod إدراجها في بروتين Nesprin2G اقتطاع التي سبق وضعها المعروفة باسم مصغرة Nesprin2G (الشكل 2C)، الذي يتصرف على نحو مماثل لالذاتية Nesprin-2G 11. يحتوي المجمع ينك البروتينات المتعددة التي تؤدي من الخارج إلى داخل النواة، ربط الهيكل الخلوي حشوية إلى الصفيحة النووية. Nesprin-2G هو البروتين الهيكلي ملزمة لكل منالهيكل الخلوي الأكتين في السيتوبلازم والبروتينات SUN في الفضاء حول النواة. باستخدام جهاز الاستشعار البيولوجي لدينا، كنا قادرين على إظهار أن Nesprin-2G يخضع لتوتر تعتمد على أكتوميوزين في الخلايا الليفية NIH3T3 2. وكانت هذه هي المرة الأولى التي تقاس تلك القوة مباشرة عبر البروتين في مجمع ينك النووي، وأنه من المرجح أن تصبح أداة هامة لفهم دور القوة على نواة في ميكانيكا الأحياء.

وينص البروتوكول أدناه منهجية مفصلة لكيفية استخدام جهاز استشعار القوة Nesprin-2G، بما في ذلك تعبير عن التوتر استشعار Nesprin (Nesprin-TS) في خلايا الثدييات، فضلا عن اقتناء وتحليل الصور الحنق من الخلايا معربا عن Nesprin- TS. باستخدام مجهر متحد البؤر مقلوب مجهزة للكشف الطيفي، وصفا لكيفية قياس الانبعاثات توعية الحنق تستخدم unmixing الطيفي ويرد ratiometric التصوير الحنق. الصور ratiometric الانتاج يمكن ان تستخدم في صنع منه النسبيمقارنات القوة ntitative. في حين يركز هذا البروتوكول على التعبير عن Nesprin-TS في الخلايا الليفية، وقابل للتكيف بسهولة لخلايا الثدييات الأخرى، بما في ذلك خطوط الخلايا والخلايا الأولية. وعلاوة على ذلك، هذا البروتوكول من حيث صلته الحصول على الصور وتحليلها الحنق يمكن بسهولة أن تتكيف مع أجهزة الاستشعار القوة القائم على الحنق الأخرى التي تم وضعها للبروتينات أخرى.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. الحصول Nesprin-2G الاستشعار DNA وغيره من البلازميد DNA

  1. الحصول Nesprin-2G TS (جهاز استشعار التوتر) السيطرة، Nesprin-2G HL (بلا رأس)، mTFP1، فينوس، وTSmod من مصدر تجاري. نشر جميع البلازميدات DNA وتنقيتها باستخدام معيار E. سلالات القولونية، مثل DH5-α، كما هو موضح سابقا 12 و 13.

2. خلايا Transfect مع Nesprin-2G وغيره من البلازميد DNA

  1. تنمو NIH 3T3 الخلايا الليفية إلى خلايا 70-90٪ التقاء في 6 جيدا طبق زراعة الخلايا في حاضنة الثقافة الخلية القياسية مع درجة الحرارة (37 درجة مئوية) وتنظيم CO 2 (5٪). على المدى المتوسط ​​نمو الخلايا، استخدم Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين.
  2. في غطاء ثقافة الخلية، وإزالة المتوسطة وشطف كل جيدا مع ما يقرب من 1 مل من وسيلة خلية خفض المصل. إضافة 800 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل إلى كل بئرووضع غرفة 6 جيدا في الحاضنة.
  3. ماصة 700 ميكرولتر من خلية متوسطة خفض المصل في أنبوب 1.5 مل مع 35 ميكرولتر من محلول الدهون الناقل لتشكيل "lipomix". مزيج من قبل pipetting. تسمية الأنبوب مع "L."
  4. جمع ست أنابيب 1.5 مل وتسمية لهم من 1 إلى 6. ماصة 100 ميكرولتر من المتوسطة خلية خفض المصل في كل أنبوب.
    1. عن طريق تركيز الحمض النووي البلازميد من الخطوة 1، ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin 2G-TS في أنابيب 1 و 2. ماصة 2 ميكروغرام من Nesprin-HL في أنابيب 3 و 4. ماصة 1 ميكروغرام من mTFP في أنبوب 5. ماصة 1 ميكروغرام من mVenus في أنبوب 6. لا إعادة استخدام نصائح ماصة عندما pipetting لأنواع مختلفة من الحمض النووي.
  5. ماصة 100 ميكرولتر من lipomix من أنبوب "L" في كل أنبوب المسمى (1-6)، ومزيج من قبل pipetting المتكررة. استخدام ماصة نظيفة لكل أنبوب. احتضان لمدة 10-20 دقيقة.
  6. إضافة 200 ميكرولتر من كل أنبوب المسمى لبئر في غرفة 6 جيدا مع متموجة 70-90٪الخلايا. تسمية الجزء العلوي من كل بئر مع DNA المقابل المضافة. مكان الغرفة 6 جيدا في حاضنة لمدة 4-6 ساعة.
  7. نضح المتوسطة وإضافة 1-2 مل من المتوسط ​​خلية خفض المصل لشطف. نضح المتوسطة خلية انخفاض مصل، إضافة 2 مل من التربسين إلى كل بئر، ووضع صحن 6 جيدا في الحاضنة (5-15 دقيقة).
  8. في حين فصل الخلايا في الحاضنة، ومعطف 6 الزجاج أسفل يشاهدون أطباق بطبقة من فبرونيكتين في تركيز 20 ميكروغرام / مل حل في المياه المالحة الفوسفات مخزنة (PBS). السماح للأطباق لطلاء السطح في الخلية هود الثقافة (حوالي 20 دقيقة).
  9. تحييد التربسين بإضافة 2 مل من DMEM مرة يتم فصل الخلايا.
  10. نقل محتويات كل بئر إلى أنبوب الطرد المركزي 15 مل وصفت وتدور باستمرار في 90 x ج لمدة 5 دقائق في يتأرجح الطرد المركزي الدوار. نضح طاف وإعادة تعليق كل بيليه خلية في 1000 ميكرولتر من DMEM بواسطة ماصة الاختلاط.
  11. نضح الخليط فبرونيكتين منأطباق الزجاج وماصة 1000 ميكرولتر من كل تعليق الخلية على أطباق الزجاج.
  12. بعد تسوية الخلايا في الجزء السفلي من الأطباق الزجاجية (~ 15 دقيقة)، إضافة 1 مل أخرى من DMEM + 10٪ FBS + 1٪ القلم بكتيريا على كل جانب ومكان في حاضنة الخلية. السماح للخلايا لنعلق والتعبير عن الاستشعار عن 18-24 ساعة على الأقل.
    و transfected الخلايا باستخدام الموجبة الكواشف ترنسفكأيشن الدهون التجارية (انظر جدول المواد): ملاحظة. بدلا من ذلك، خطوط الخلايا مستقرة يمكن اختيار باستخدام البلازميد مع الجينات التي تمنح مقاومة السم (متوفرة على موقع على شبكة الانترنت DNA مستودع البلازميدات pcDNA لNesprin-TS و-HL (انظر جدول المواد) توفير الخلايا معربا عن المقاومة geneticin ). بالإضافة إلى ذلك، طرق العدوى الفيروسية (الفيروسة البطيئة، الارتجاعي، أو اتش) يمكن استخدامها للتعبير عن جهاز استشعار في الخلايا التي يصعب ل transfect.
  13. بالإضافة إلى Nesprin-TS، transfect خلايا إضافية مع HL Nesprin صفر لالسيطرة م، كما هو موضح في الخطوات 2،1-2،12. ويمكن أيضا أن تستخدم TSmod كعنصر تحكم صفر القوة وينبغي أن يحمل الحنق على غرار Nesprin-HL.
  14. خلايا Transfect مع mTFP1 وفينوس لتوليد البصمات الطيفية (راجع الخطوة 4).
    ملاحظة: mTFP1 وفينوس تعبير عن عادة عند مستويات أعلى من Nesprin-TS، وعلى هذا النحو، قد تحتاج إلى transfected لتحقيق مستويات التعبير مماثلة كميات أقل من الحمض النووي.

3. التحقق من ترنسفكأيشن الكفاءة

  1. ما يقرب من 18-24 ساعة بعد الانتهاء من ترنسفكأيشن، استخدام المجهر الفلورسنت المقلوب لفحص كفاءة ترنسفكأيشن بمقارنة عدد الخلايا الفلورسنت إلى العدد الكلي للخلايا في عرض (عادة 5-30٪).
    1. استخدام المجهر الفلورسنت مجهزة تردد الإثارة قرب 462 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس) وتصفية الانبعاثات تركزت قرب 492 نانومتر (mTFP1) أو 525 نانومتر (فينوس).
      ملاحظة: بدلا من ذلك، سوف GFP تصفية مجموعات التقاط مجموعة من mTFP1 وهاءانبعاثات جامعة سنغافورة الوطنية، وسيسمح للتأكيد على كفاءة ترنسفكأيشن.
  2. صورة الخلايا الحية خلال 48 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
    1. بدلا من ذلك، إصلاح الخلايا في 4٪ امتصاص العرق (في PBS مع الكالسيوم والمغنيسيوم) لمدة 5 دقائق، ومتجر في برنامج تلفزيوني، وعرض بعد 48 ساعة 8.
      ملاحظة: ما وراء 48 ساعة، وجودة الإشارة والقوة يضمحل. تحديد الخلايا يحافظ على دولتهم، بما في ذلك الحنق الذي أعرب 8؛ ومع ذلك، ينبغي تصوير الخلايا فقط في برنامج تلفزيوني، وتصاعد المتوسطة قد تؤثر الحنق 14. لا يمكن إلا أن خلايا ثابتة يمكن مقارنة الخلايا الثابتة الأخرى، كما قد يكون هناك تغيير في التعبير.
      تحذير: امتصاص العرق هي سامة. ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE).

4. التقاط الطيفي بصمات mTFP1 والزهرة Fluorophores للالطيفي Unmixing

  1. في غطاء ثقافة الخلية، استبدل المتوسطة الخلية مع جامعة المدينة العالمية التصويرم (HEPES مخزنة) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني.
  2. ضع الأطباق عرض في (37 ° C) المرحلة المجهر مبائر التحكم في درجة حرارته.
  3. وضع صحن زجاج العرض مع خلايا transfected mTFP1 على مدى الهدف النفط في 60X التكبير مع الفتحة العددية 1.4.
    ملاحظة: يستخدم زيت على المجهر الليزر على الهدف 60X تشبه عن كثب معامل الانكسار الركيزة الزجاج. يوضع الزيت على أعلى عدسة الهدف، ويأتي في اتصال مباشر مع ساترة الزجاج.
  4. حدد موقع mTFP1 معربا عن الخلايا مع مصدر الإثارة 458 نانومتر وعامل تصفية ممر الموجة الانبعاثات تركزت في 500 نانومتر.
  5. مع خلية الفلورسنت في مجال الرؤية، تحديد وضع الكشف الطيفي ( "لامبدا الوضع" في البرمجيات المستخدمة هنا) والتقاط الصورة الطيفية (الشكل 3-1). يشمل جميع الترددات وراء 458 نانومتر باستخدام 10 بزيادات نانومتر (الشكل 3-3). حدد fluoresc مشرقمنطقة الأنف والحنجرة (ROI) على الخلية (20 بكسل نصف القطر).
    ملاحظة: الشكل الطيفي للmTFP1، معربا عن ROI يجب أن تبقى ثابتة نسبيا عبر الخلية. إذا كان شكل اختلافا كبيرا، وإعادة ضبط الليزر والحصول على إعدادات لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
  6. إضافة ROI الفلورسنت يعني، وكثافة طبيعية لقاعدة البيانات الطيفية بالنقر على "حفظ الأطياف إلى قاعدة البيانات."
  7. تحسين قوة الليزر واكتساب بحيث يتم التوصل إلى جيدة نسبة الإشارة إلى الضوضاء. سوف تختلف إعدادات لمعدات مختلفة. استخدام غير الفلورسنت، وخلايا untransfected كمرجع الخلفية، وزيادة الربح والسلطة حتى الخلايا مشرقة، ولكن ليس خارج النطاق الديناميكي للكشف (نقطة التشبع). لا ينبغي أن يكون خلايا خلفية مضان كشفها بعد المتوسط.
  8. كرر العملية للخلايا transfected فينوس مع الاستثناءات التالية:
    1. تأكد من أن وتيرة الإثارة هو في 515 نانومتر، وأن ممر الموجة مرشح هو مntered قرب 530 نانومتر عند تحديد خلايا فينوس، معربا عن.
    2. في "وضع الطيفي"، استخدم تردد الإثارة من 515 نانومتر بدلا من 458 نانومتر.

5. التقاط صور غير المخلوطة

  1. تبديل وضع الالتقاط إلى "الطيفي Unmixing".
  2. إضافة بصمات طيفية من فينوس وmTFP1 في القنوات unmixing (الشكل 3، ارو 2).
  3. تعيين الليزر الإثارة مرة أخرى إلى مصدر الأرجون 458 نانومتر.
  4. ضع صحن عرض Nesprin-TS فوق الهدف النفط 60X.
  5. بعد التركيز على خلية الفلورسنت مع التعبير مشرق بما فيه الكفاية، وضبط الكسب وقوة الليزر لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء.
    ملاحظة: منذ كفاءة الحنق من Nesprin-TS بالقرب من 20٪، ويجب أن تكون الصورة فينوس غير مخلوطة باهتة إلى حد كبير من الصورة mTFP1 غير مخلوطة. مرة واحدة وقد تم تحديد ووضع السلطة والمكاسب مقبول تكرارا، يجب أن تظل هذه المعايير المستمر لجميع صور الكابتنمحكم.
  6. القبض على ما لا يقل عن 15-20 الصور خلايا Nesprin-TS مع سطوع مماثل نسبيا، وتجنب الإفراط في التشبع بكسل (تتم إزالة كافة بكسل المشبعة خلال معالجة الصور).
  7. تكرار عملية التقاط صورة مع خلايا Nesprin-HL باستخدام معلمات التصوير متطابقة.

تجهيز 6. صورة ونسبة تحليل الصور

  1. استخدام المصدر المفتوح يماغيج (فيجي) والبرمجيات (http://fiji.sc/)، وفتح شكل صور أصلية باستخدام BioFormats القارئ.
  2. قبل عملية الصور وحساب نسبة الصور باستخدام البروتوكولات المعمول بها سابقا 15.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

بعد بروتوكول أعلاه، تم الحصول عليها DNA البلازميد من مستودع DNA وتحويلها إلى خلايا E. القولونية. وقد تم اختيار E. القولونية التعبير عن DNA استشعار من LB / لوحات الأمبيسلين وتضخيمها في مرق LB السائل. بعد التضخيم من ناقلات، وتنقية البلازميدات DNA إلى عازلة تريس، EDTA باستخدام معيار، وهي متاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي. باستخدام مقياس الطيف الضوئي، وكميا DNA تنقيته الى تركيز القياسية من ميكروغرام / مل (الشكل 1A، أيام 1-2).

استخدام الخلايا الليفية NIH3T3، ما نمت الخلايا إلى 70-90٪ التقاء في طبق زراعة الخلايا البلاستيك 6-جيدا. لإدراج DNA البلازميد في الخلايا NIH3T3، تم إجراء البلازميد ترنسفكأيشن بوساطة الدهون. تجاريا كانت تستخدم متاح كاشف ترنسفكأيشن (انظر جدول المواد) مثل سفينة الدهون لDNA. اثنين من مكرراتو transfected أجهزة الاستشعار Nesprin-TS وNesprin-HL إلى 4 آبار الخلية (الشكل 1B). في إطار التحضير للتصوير الحنق، و transfected يبني fluorophore واحدة من mTFP1 وفينوس إلى خلايا NIH3T3 (الشكل 1B). بعد ترنسفكأيشن، تم نقل الخلايا إلى الزجاج أسفل عرض أطباق متوافقة مع التكبير العالية، والمجاهر متحد البؤر مقلوب.

وقبل الشروع في التصوير متحد البؤر، تم استخدام مقلوب واسعة المجال المجهر الفلورسنت بسيط للتحقق من كفاءة ترنسفكأيشن. باستخدام الهدف 10X مع الفتحة العددية 0.25، العديد من الخلايا في مجال الرؤية النموذجية أعرب عن Nesprin-TS (الشكل 2). عموما، واستشعار المترجمة حول الغلاف النووي، بما يتفق مع الترجمة الذاتية من Nesprin-2G 2. واستشعار مراقبة أي قوة، Nesprin-HL، اتباع نمط التعبير مماثل 2.

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> بعد تأكيد كفاءة ترنسفكأيشن من Nesprin أجهزة الاستشعار TS وHL، معربا عن الخلايا الحية يبني fluorophore واحدة (mTFP1 أو فينوس) تم تصويرها مع متحد البؤر المقلوب مجهر. باستخدام طريقة الكشف الطيفي، وسجلت mTFP1 وفينوس البصمات الطيفية في قاعدة البيانات unmixing الطيفية (الشكل 3، ارو 2 والشكل 4A). وبعد أخذ البصمات، وتحول المعلمة القبض على وضع unmixing، مع أطياف mTFP1 وفينوس تحميل كمكونات (الشكل 4D). تم الحصول على الصور الخام ومداخن صورة الطيفي (الشكل 4).

وأخيرا، تم استيرادها من مداخن صورة الطيفي في يماغيج البرمجيات مفتوحة المصدر للمعالجة. الصور تم قبل معالجة، وحسبت الصور نسبة استخدام إجراءات المعمول بها (15).

الطبقة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> منذ أن نسبة الحنق هو القياس النسبي، يجب على كل تجربة مقارنة اثنين أو أكثر من الشروط. بالإضافة إلى ذلك، لأن إعدادات الليزر والكاميرا كاشف يمكن أن تؤثر الحنق، ينبغي الحصول عليها عن الأوضاع في دورة التصوير نفسها. في كثير من الأحيان، ونحن نستخدم ضبط قوة حساسة مقطوعة الرأس أو أبتر، الذي يمثل عنصر تحكم صفر القوة، كما سطر قاعدة لتجاربنا. بسبب الحنق نسبة الصور يمكن أن تكون صاخبة، فإنه غالبا ما يكون ضروريا لالتقاط صور متعددة (5-20) لكل حالة. لالظروف التي توجد فيها اختلافات كبيرة في الحنق، وهذا سيكون ملحوظ بصريا في الصور نسبة الحنق. وكان الفرق الأكثر دراماتيكية في الحنق للاستشعار التوتر Nesprin بين الخلايا unpatterned وممدود (الشكل 5). وعلى الرغم من وجود تفاوت بين الخلايا، وتغيير في الحنق بين شرطين مأساوي بحيث قد لا تكون هناك حاجة إلى مزيد من التحليل. ومع ذلك، وظروف أخرى وغالبا ما يكون مصغرةيغير القانون النموذجي للتحكيم في الحنق. قد لا يكون ملحوظ بصريا بين الصور الفردية، وإنما تتطلب أن يتم تحليل البيانات في مجموع المباراتين. لتحديد ما إذا كانت هذه التغييرات مهمة، فإن نسبة الحنق متوسط ​​لكل صورة غير المحسوبة وأعربت بصريا على أنها مجموعة من رسوم بيانية. من خلال مقارنة بيانية بين الظروف، يصبح من السهل أن نرى تغييرات دهاء في الحنق بين المجموعات التجريبية. في الشكل 6A و 6B، يتم تمثيل رسوم بيانية الحنق من كل خلية فردية من لون في الرسم البياني مكدسة. خلايا Calyculin A المعاملة (الشكل 6B) تظهر على نحو اليسار، تحول الحنق الرسم البياني بالنسبة لخلايا تعامل مع الميوسين المانع ML7 (الشكل 6A).

شكل 1
الشكل 1: استنادا الزمني التجريبية تدفق الرسم البياني. (A) بدءا من السيناتور المكتسبةأو DNA البلازميد، يتم تحويل E. القولونية ناقلات مع DNA، المختارة، وتضخيم (أيام 1-2). من تتركز مرق كولاي LB، يتم عزل DNA البلازميد وكميا (يوم 3). استخدام البلازميدات DNA النقاء، و transfected الخلايا الليفية NIH3T3 في شكل ستة جيدا (B) ونقل على أطباق أسفل الزجاج التي تتوافق مع مجهر متحد البؤر مقلوب (يوم 3). للتحقق من نجاح ترنسفكأيشن، وينظر إلى الخلايا تحت المجهر الفلورسنت widefield مجهزة مجموعات مرشح المناسبة (يوم 4). وحدات بناء على ترنسفكأيشن ناجحة، يتم تصوير الخلايا على المجهر متحد البؤر مجهزة للكشف الطيفي. باستخدام unmixing الطيفي، يتم فصل قنوات mTFP1 وفينوس خلال اقتناء وحفظ كما الطيفي مداخن صورة (أيام 4-5). وأخيرا، فإن preprocessed الصور في يماغيج، وتحسب للصور النسبة. التنوير القائلبورصة عمان انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: صورة ممثل Transfected NIH3T3 الخلايا الليفية. (A) 10X التكبير من الخلايا الليفية NIH3T3 transfected معربا عن Nesprin-TS باستخدام filterset GFP. (B) وجهة نظر انفجرت من المربع المحيط من التعبير جزء A. الاستشعار يتبع الغلاف النووي، وغالبا ما يمتد إلى السيتوبلازم. (C) Nesprin-TS ومراقبة -HL وكيف ربط الأكتين والمجالات ملزمة أحد الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: Spectral البصمات دروس عن طريق متحد البؤر البرمجيات. أطياف الانبعاث تطبيع الحصول عليها من نصف قطر 20 بكسل في المناطق المصالح أبرز رسمه مرمى الملونة. (السهم-1) طريقة الكشف الطيفي لالتقاط صورة. (ارو 2) "الطيفي Unmixing" الإعداد لإضافة أطياف تطبيع إلى قاعدة البيانات الطيفية. (ارو 3) وتيرة الإثارة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4): لايف الطيفي Unmixing وإخراج متحد البؤر البرمجيات. (A) معلمات التصوير الحرجة لإنتاج الحية والصور غير مخلوطة. (السهم-1) وتيرة الإثارة. (ارو 2) يعيش وضع unmixing الطيفي. صورة (B) النوى في قناة فينوس خالصة. ( أونج> C) نوى الصورة في قناة mTFP1 غير مخلوطة. (D) صورة جنبا إلى جنب من فينوس وmTFP1. (ارو 3) الغشاء النووي للخلية حيث يتم أعرب Nesprin-TS. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الشكل 5: Nesprin-TS الحنق صور النسبة في منقوشة وunpatterned الكلى مدين، داربي الناب (MDCK) الخلايا. تم تصوير الخلايا MDCK التي تعبر عن ثابت Nesprin-TS على 10 خطوط واسعة ميكرون فبرونيكتين (A) أو polydimethylsiloxane unpatterned (PDMS) الأغشية (B). والأغشية النووية بصريا ملثمين ومعالجتها في نسب الحنق. ويمثل الشريط على نطاق واللون والحنق نسبة السعة لنوى unpatterned ونقوش.e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (6)
الشكل 6: معالجة الصور Ratiometric الحنق من Nesprin-TS-معربا عن الخلايا وتحليل الرسم البياني للبيانات المجمعة. (A) ممثل، تطبيع الرسم البياني مكدسة من الحنق الصور نسبة Nesprin-TS تعامل مع ML7 المانع ميوسين، ونا مميزا من قبل نواة الخلية الفردية. (B) ممثل، تطبيع الرسم البياني مكدسة من الحنق الصور نسبة Nesprin-TS تعامل مع Calyculin A، المنشط من انقباض الخلايا. أسطورة يرتبط كل نواة تحليلها لموقعها على الرسم البياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك طريقة ومظاهرة من تصوير الخلايا الحية من التوتر الميكانيكية عبر Nesprin-2G، وهو بروتين في مجمع ينك النووي، وقد ورد أعلاه. قبل هذا العمل، تقنيات مختلفة، مثل الطموح micropipette، المغناطيسي حبة الخلوي، والمجهري ليزر الاجتثاث، وقد استخدمت لتطبيق الضغط على نواة الخلية وقياس خصائص المواد حجمها 16 و 17 و 18. ومع ذلك، حتى عملنا مؤخرا، قد تظهر عدم وجود دراسات مباشرة أن القوات الشد يتم نقل مباشرة على بروتين معقد لينك في الخلايا الحية 2.

سابقا، أظهرت مختبرنا أن نسخة معدلة من Nesprin2G، والمعروفة باسم مصغرة Nesprin2G، يمكن هندسيا للتعبير عن التحقيق الحنق القوة المعروفة باسم TSmod (الشكل 2C) 2. وقد تبين TSmod سابقا لقياس الشد حيوي لالمجال الاقتصادي الموحد في الخلايا الحية وفي مختلف البروتينات الحاملة 3، 4، 6، 8. وقد تبين أيضا أن مصغرة Nesprin-2G كان يمكن تمييزه عن الذاتية Nesprin-2G فيما يتعلق التعريب لها، الآثار المعروفة في الهيكل الخلوي، والقدرة على انقاذ المواقع النووية 11، 19. استخدام البروتين مصغرة Nesprin-2G مع TSmod (Nesprin-TS)، تبين أن الخلايا الليفية NIH3T3 معربا عن جهاز استشعار لديها مستوى خط الأساس للتوتر بالنسبة لNesprin-HL، والتي لا يمكن ربط الأكتين 2. علاوة على ذلك، تعديل من انقباض الخلوية باستخدام مثبطات أو منشطات الميوسين يمكن الكشف عنها بواسطة Nesprin-TS 2.

وهناك عدد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول. الخلط بين Nesprin-TS مع Nesprin-HL (DNA أو الخلايا معربا عن) ليس readiلاي الكشف، على حد سواء توطين على غرار الغشاء النووي، وسوف يؤدي إلى نتائج مربكة. منذ Nesprin-HL هو السيطرة لا قوة، يجب أن يكون الحنق قياس أعلى من Nesprin-TS في المتوسط. أن نكون حذرين، والتسلسل معزولة يبني DNA والخلايا وصفها بدقة وينصح. ثانيا، من المهم تحسين بعناية كسب كاشف وقوة الليزر على المجهر متحد البؤر لتحسين نسبة الإشارة إلى الضوضاء وتقليل التبييض. لقياس الحنق بشكل صحيح، يجب أن تظل هذه المعايير المستمر خلال الحصول على الصور. وعلاوة على ذلك، وتحسين مكاسب كاشف أو الطاقة للخلايا التعبير خافت أو مشرقة جدا هو الأمثل، لأن متوسط ​​معربا عن الخلايا سوف تميل إلى الانخفاض خارج نطاق ديناميكي للكشف. بعض الخلايا التي تعبر عن تركيز عال من أجهزة الاستشعار تميل إلى يتألق في جبلة النواة والشبكة الإندوبلازمية، مما يجعل من الصعب حل الغشاء النووي، والذي هو من المفترض المنطقة أكثر إثارة للاهتمام فيما يتعلق FORCE. تحديد الخلايا مع مستويات التعبير انخفاض طفيف يميل إلى حل هذه المشكلة من أجهزة الاستشعار الترجمة.

بينما التصوير الطيفي ratiometric هو وسيلة بسيطة نسبيا وسريعة لقياس الحنق، فإنه لا وحدة لا إخراج الكفاءة الحنق بسبب إشارة متقبل تنزف من خلال (20). بدون وحدة من الكفاءة الحنق، فإنه ليس من الممكن تحويل مؤشر نسبة الحنق في قياس قوة معايرة. ونتيجة لهذا الحد، لا يمكن تحقيقه إلا النسبية مقارنات القوة الكمية. كفاءة الحنق يمكن تحديده من خلال أساليب أكثر تعقيدا، مثل المجهر مضان العمر التصوير (FLIM) أو photobleaching من المتقبلة. القوة المطلقة (على مستوى السندات الإذنية) يمكن تقدير من الحنق الكفاءة، كما هو موضح سابقا 3 و 8.

وعلى النقيض من الطرق السابقة لقياس الخواص الميكانيكية للنواة أو تشريد النواة تستند سن قوات تطبيقها خارجيا، وقياس الحنق من Nesprin-TS لديه ميزة عدم جراحية التوتر التحقيق على مكونات الغشاء النووي 16 و 17 و 18. استشعار إخراج إشارة الفلورسنت التي يرتبط مع الضغط على جزيئات Nesprin-2G الفردية. في المقابل، micropipette الطموح يتطلب استخدام الأدوات الحساسة عند العمل مع الخلايا الحية. يسبب متحد البؤر الاستئصال بالليزر تلف الخلايا المحلي ويتطلب مصدر ليزر نابض. التواء المغناطيسي الخلوي قوات نقل على الغشاء النووي عبر الهيكل الخلوي والتي لا يمكن استخدامها لقياس القوى على بروتينات معينة، إلا إذا كان لا بد من جانب استشعار التوتر Nesprin-2G.

بينما ثبت أن القوات الشد القائم الأكتين ونقلها إلى Nesprin-2G، وهو مكون من مجمع لينك، فإنه لا يزال غير معروف كم هي تمارس الشد أو قوات الضغطعلى البروتينات ينك الهيكلية الأخرى، مثل SUN-1 أو SUN-2. سيتم توجيه العمل المستقبلي في استنساخ تحقيقات الحنق القوة في هذه البروتينات لينك المفترضة الحاملة لزيادة توضيح الميكانيكا النووية لقرار على مستوى البروتين. وثمة مسألة أخرى الذي يطرح نفسه الآن هو أن تغيرات في الحنق قد تكون لا علاقة لها تغيرات في التوتر، بل تعكس إما التغييرات في Nesprin-2G oligomerization أو تغييرات بتكوين لNesprin-2G. التغيرات في درجة الحموضة الخلوية يمكن أن تؤثر في مضان من أجهزة الاستشعار وتغيير الحنق قياس. يمثل جهاز استشعار Nesprin-2G HL مراقبة جيدة لبعض هذه التغييرات (كما التغيرات الحنق لاحظت مع هذا الاستشعار هي الأكثر علاقة المرجح أن يجبر)، والجزيئات ثوابت تحكم الحنق يمكن تطويرها لتقييم oligomerization (انظر أدناه). بالإضافة إلى ذلك، هو الدافع وراء التعبير عن nesprin-2G TS من قبل المروج CMV، مما يؤدي إلى overexpression، وهذا المستوى العالي من التعبير يحتمل أن تحفز التحف البيولوجية. التطورات الحديثة مع جوقد سمحت مصقول interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) لإصلاح الموجه التماثل (HDR) نهج لإدراج تسلسل DNA أكبر في الجينوم 21. ويمكن استخدام هذا النهج لتعديل الذاتية Nesprin-2G (أو غيرها من البروتينات) لتشمل TSmod. وسيوفر هذا التعبير من أجهزة الاستشعار القوة باستخدام PROMOTOR الذاتية المناسب، مما يقلل من احتمالات التحف overexpression.

ويمكن أيضا TSmod وغيرها من تحقيقات الحنق مرونة استخدامها لتطوير أجهزة استشعار جديدة للبروتينات أخرى، والتي يمكن أن تستخدم بعد ذلك في بروتوكول مماثل لتلك التي وصفها في هذه المقالة. ومصدر القلق الرئيسي مع تطور أي جهاز استشعار القوة الجديد هو تحديد الموقع الإدراج الداخلي للاستشعار الحنق. أولا، يجب أن يكون موقع الإدراج في المنطقة من البروتين تعرض للتحميل الميكانيكية. هذه المناطق يمكن تحديدها من خلال دراسة حيث تتفاعل البروتينات المتصلة هيكل الخلية مع البروتين. الثاني، والإدراج من الكبيرة (~ 50 كيلو دالتون) TSmod يجب ألا يعطل الوظيفة البيولوجية للبروتين التي تجري دراستها. وأظهر التي سبق وضعها "مصغرة" شكل من أشكال Nesprin-2G أن المجالات CH-أكتين سدها إلى المجال كاش SUN ملزم كافية للحركة النووية Nesprin-2G في الطبقات الوحيدة الجرحى 11، 19، مما يدل على أن إدخال TSmod من المحتمل أن لا تعطيل وظيفة البروتين. تأكيدا على وظيفة بيولوجية من أجهزة الاستشعار يتطلب فحص وظيفي لوظيفة البروتين (الذي استشعار القوة يمكن أن تظهر لإنقاذ وظيفة محددة في الخلايا المنضب من البروتين الذاتية). ثالثا، يمكن أن التغييرات في oligomerization البروتين يغير من الحنق بين البروتينات (وهو ما يسمى الحنق الجزيئات 22)، والذي من شأنه أن يؤدي إلى تغييرات الحنق التي لا ترتبط القوة. تحليل دقيق لهذا غالبا ما يتطلب يبني الحنق الجزيئات المتخصصة التي تبلغ تحديدا oligomerization.

وقد مكنت أجهزة استشعار القوة المستندة إلى الحنق معشوقة = "jove_content"> التحليل المكاني والزماني من القوى الميكانيكية مع الدقة بروتين معين. على الرغم من أن هذا البروتوكول تفاصيل استخدام أجهزة الاستشعار التوتر Nesprin-2G، فإنه ينطبق على عدد من أجهزة الاستشعار الحالية المتاحة للبروتينات في الالتصاقات البؤرية وتقاطعات خلية خلية. فإن استخدام هذه المجسات لNesprin-2G وغيرها من البروتينات الحاملة توفر نظرة كبيرة في آليات الخلية وميكانيكا الأحياء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل توماس F. وكيت ميلر جيفريس ميموريال ترست (لDEC) وNIH منح R35GM119617 (لDEC). تم إجراء التصوير المجهر متحد البؤر في مرفق جامعة فرجينيا كومنولث المواد النانوية توصيف الأساسية (NCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nesprin-TS DNA Addgene 68127 Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA Addgene 68128 Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA Addgene 54613 Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA Addgene 27793 Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA Addgene 26021 Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells Bioline BIO-85026
Liquid LB Media ThermoFisher 10855001 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates Sigma-Aldrich L5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin Sigma A9518
Spectrophotometer Biorad 273 BR 07335 SmartSpec Plus
quartz cuvette Biorad 1702504 Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit Macherey-Nagel 740412.5 NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish Falcon-Corning 353046 Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media Gibco 11995-065 DMEM(1x)
Bovine Serum Life Technologies 16170-078
reduced serum cell media Gibco 31985-070 Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution invitrogen 11668-019 Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube Denville c2170
Trypsin Gibco 25200-056 0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish In Vitro Scientific D35-20-1.5-N 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin ThermoFisher 33016015 fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube Greiner bio-one 188261
swinging rotor centrifuge  Thermo electron Centra CL2 Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood Forma Scientific 1284
climate controlled cell culture incubator ThermoFisher 3596
inverted LED widefield fluorescent microscope Life technologies EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media Molecular Probes A14291DJ
Fetal bovine Serum Life technologies 10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources  Zeiss  LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media Newengland Biolabs B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts ATCC CRL-1658

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
  2. Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
  3. Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
  4. Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
  5. Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
  6. Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
  7. Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
  8. Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
  9. Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
  10. Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
  11. Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
  12. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
  13. Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
  14. Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
  15. Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
  16. Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
  17. Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
  18. Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
  19. Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
  20. Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
  21. Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
  22. LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).

Tags

الهندسة الحيوية، العدد 122، ميكانيكا الأحياء، الحنق، أجهزة الاستشعار، Nesprin-2G، مجمع ينك النووي، الهيكل الخلوي الأكتين، وميكانيكا خلية
بروتوكول لعن طريق نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق) أجهزة الاستشعار لقياس -Force القوات الميكانيكية عبر مجمع ينك النووية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arsenovic, P. T., Bathula, K.,… More

Arsenovic, P. T., Bathula, K., Conway, D. E. A Protocol for Using Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex. J. Vis. Exp. (122), e54902, doi:10.3791/54902 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter