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Bioengineering

Forster अनुनाद ऊर्जा स्थानांतरण (झल्लाहट) -Force Biosensors का उपयोग के लिए एक प्रोटोकॉल परमाणु LINC परिसर भर में यांत्रिक बलों को मापने के लिए

Published: April 11, 2017 doi: 10.3791/54902
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biomedical Engineering, Virginia Commonwealth University

Introduction

सेना के प्रति संवेदनशील, आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग झल्लाहट सेंसर हाल ही में, जीवित कोशिकाओं में तन्य आधारित बलों को मापने कैसे यांत्रिक बलों प्रोटीन 1, 2, 3, 4 में लागू कर रहे हैं में अंतर्दृष्टि प्रदान करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण के रूप में उभरा है। इन उपकरणों के साथ, शोधकर्ताओं ने पारंपरिक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग कर जीवित कोशिकाओं में गैर invasively छवि intracellular बलों कर सकते हैं। ये सेंसर एक झल्लाहट जोड़ी (दाता और स्वीकर्ता फ्लोरोसेंट प्रोटीन, सबसे अधिक बार एक नीले और पीले रंग दाता स्वीकर्ता) एक लोचदार पेप्टाइड 3 के द्वारा अलग से मिलकर बनता है। इसके विपरीत सी या एन टर्मिनल टैगिंग करने के लिए, यह सेंसर एक प्रोटीन यांत्रिक बल प्रोटीन पर आसानी से ट्रांसमिट को मापने के लिए एक आंतरिक साइट में डाला जाता है, एक आणविक तनाव गेज के रूप में व्यवहार। झल्लाहट पी के बीच एक वृद्धि की दूरी में सेंसर परिणाम भर में यांत्रिक तनाव में वृद्धिहवा, कम झल्लाहट 3 में जिसके परिणामस्वरूप। नतीजतन, झल्लाहट विपरीत रूप से तन्य शक्ति से संबंधित है।

ये फ्लोरोसेंट आधारित सेंसर फोकल आसंजन प्रोटीन (vinculin 3 और Talin 4), cytoskeletal प्रोटीन (α-actinin 5), और सेल सेल जंक्शन प्रोटीन के लिए विकसित किया गया है (ई-Cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, और PECAM 8)। सबसे अधिक इस्तेमाल और अच्छी तरह से विशेषता इन biosensors में लोचदार लिंकर TSmod रूप में जाना जाता है और 40 अमीनो एसिड, (GPGGA) 8, जो मकड़ी रेशम प्रोटीन flagelliform से निकाला गया था की एक दोहराव अनुक्रम के होते है। TSmod एक रेखीय लोचदार नैनो वसंत के रूप में तन्य शक्ति 3 से 5 पी.एन. के लिए 1 के लिए झल्लाहट जवाबदेही के साथ, व्यवहार करने के लिए दिखाया गया है। flagelliform के विभिन्न लंबाई गतिशील आर को बदलने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताTSmod झल्लाहट बल संवेदनशीलता 9 की Ange। इसके अलावा flagelliform करने के लिए, spectrin दोहराता 5 और villin टोप पेप्टाइड (HP35 के रूप में जाना जाता है) 4 समान बल biosensors 4 में झल्लाहट जोड़े के बीच लोचदार पेप्टाइड्स के रूप में इस्तेमाल किया गया है। अंत में, एक ताजा रिपोर्ट से पता चला कि TSmod भी संपीड़न बलों 10 पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता।

हमने हाल ही में TSmod एक पहले से विकसित छोटा कर दिया Nesprin2G प्रोटीन के रूप में मिनी Nesprin2G (चित्रा 2C) है, जो अंतर्जात की तरह ही बर्ताव में जाना जाता है में डाला का उपयोग करके nucleo-cytoskeleton (LINC) जटिल प्रोटीन Nesprin2G के संयोजक के लिए एक बल सेंसर विकसित Nesprin-2 जी 11। LINC जटिल है कि बाहर से नाभिक के अंदर करने के लिए नेतृत्व, परमाणु पटल को cytoplasmic cytoskeleton जोड़ने कई प्रोटीन होता है। Nesprin-2 जी एक संरचनात्मक प्रोटीन के लिए बाध्य किया जाता है दोनोंकोशिका द्रव्य में और perinuclear अंतरिक्ष में रवि प्रोटीन actin cytoskeleton। हमारे बायोसेंसर का उपयोग करना, हम दिखाने के लिए कि Nesprin-2 जी NIH3T3 fibroblasts 2 में actomyosin पर निर्भर तनाव के अधीन है में सक्षम थे। यह पहली बार है कि बल सीधे परमाणु LINC परिसर में एक प्रोटीन भर में मापा गया था था, और यह mechanobiology में नाभिक पर बल की भूमिका को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण बनने की संभावना है।

नीचे प्रोटोकॉल कैसे Nesprin-2 जी बल सेंसर का उपयोग करने Nesprin तनाव सेंसर (Nesprin-टीएस) स्तनधारी कोशिकाओं में की अभिव्यक्ति है, साथ ही अधिग्रहण और Nesprin- व्यक्त कोशिकाओं की झल्लाहट छवियों का विश्लेषण सहित, की एक विस्तृत कार्यप्रणाली प्रदान करता है टीएस। एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर से लैस एक औंधा कोंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, कैसे अवगत उत्सर्जन को मापने के लिए के विवरण के वर्णक्रमीय unmixing का उपयोग कर चिंता और ratiometric झल्लाहट इमेजिंग प्रदान की जाती है। उत्पादन ratiometric छवियों रिश्तेदार योग्यता के रूप में बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताntitative बल तुलना। इस प्रोटोकॉल fibroblasts में Nesprin-टीएस की अभिव्यक्ति पर ध्यान केंद्रित है, लेकिन यह आसानी से दोनों सेल लाइनों और प्राथमिक कोशिकाओं सहित अन्य स्तनधारी कोशिकाओं, के लिए अनुकूल है। इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के रूप में यह छवि अधिग्रहण और झल्लाहट विश्लेषण से संबंधित है आसानी से अन्य झल्लाहट आधारित बल biosensors कि अन्य प्रोटीन के लिए विकसित किया गया है करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता।

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Protocol

1. प्राप्त Nesprin-2 जी सेंसर डीएनए और अन्य प्लाज्मिड डीएनए

  1. एक वाणिज्यिक स्रोत से Nesprin-2 जी टी एस (तनाव सेंसर), Nesprin-2 जी HL (बिना सिर) नियंत्रण, mTFP1, शुक्र, और TSmod प्राप्त करें। सभी डीएनए प्लास्मिड प्रचार और जैसा कि पहले 12, 13 में वर्णित उन्हें, इस तरह के DH5-α के रूप में मानक ई कोलाई उपभेदों, का उपयोग कर शुद्ध।

2. Nesprin-2 जी और अन्य प्लाज्मिड डीएनए के साथ Transfect प्रकोष्ठों

  1. NIH 3T3 fibroblasts कोशिकाओं के तापमान (37 डिग्री सेल्सियस) और सीओ 2 (5%) विनियमन के साथ एक मानक सेल संस्कृति इनक्यूबेटर में एक 6-अच्छी तरह से सेल संस्कृति डिश में 70-90% संगम तक बढ़ता है। कोशिकाओं की वृद्धि मध्यम के लिए, Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 10% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक का उपयोग करें।
  2. एक सेल संस्कृति हुड में, मध्यम हटाने और एक कम-सीरम सेल माध्यम के लगभग 1 एमएल के साथ अच्छी तरह से प्रत्येक कुल्ला। कम सीरम सेल मध्यम के 800 μL प्रत्येक अच्छी तरह से में जोड़ेऔर इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से चैम्बर जगह।
  3. लिपिड वाहक समाधान के 35 μL के साथ एक 1.5 एमएल ट्यूब में कम सीरम सेल माध्यम की पिपेट 700 μL "lipomix" के रूप में। pipetting द्वारा मिक्स। एक "एल" के साथ ट्यूब लेबल करें
  4. छह 1.5 एमएल ट्यूबों को इकट्ठा और प्रत्येक ट्यूब में के माध्यम से 6. पिपेट 100 कम सीरम सेल माध्यम की μL उन्हें 1 लेबल।
    1. प्लाज्मिड डीएनए एकाग्रता ट्यूब में ट्यूब 3 और 4 पिपेट 1 mTFP की माइक्रोग्राम में ट्यूबों 1 और 2 पिपेट 2 Nesprin-HL की माइक्रोग्राम में चरण 1, पिपेट 2 Nesprin 2 जी-टी एस के माइक्रोग्राम से उपयोग करना 5. पिपेट 1 माइक्रोग्राम mVenus की ट्यूब 6. में फिर से उपयोग न करें विंदुक युक्तियाँ जब डीएनए के विभिन्न प्रकार pipetting।
  5. प्रत्येक लेबल ट्यूब (1-6) में "L" ट्यूब से lipomix पिपेट 100 μL और दोहराया pipetting द्वारा मिश्रण। प्रत्येक ट्यूब के लिए एक साफ पिपेट का प्रयोग करें। 10-20 मिनट के लिए सेते हैं।
  6. 200 μL 70-90% संगामी के साथ 6 अच्छी तरह से कक्ष में एक अच्छी तरह से करने के लिए प्रत्येक लेबल ट्यूब से जोड़ेकोशिकाओं। इसी डीएनए के साथ प्रत्येक अच्छी तरह के शीर्ष लेबल जोड़ा। 4-6 घंटे के लिए एक इनक्यूबेटर में 6 अच्छी तरह से चैम्बर रखें।
  7. मध्यम Aspirate और कुल्ला करने के लिए कम-सीरम सेल मध्यम के 1-2 एमएल जोड़ें। कम सीरम सेल मध्यम Aspirate, अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ट्रिप्सिन के 2 एमएल जोड़ने के लिए, और इनक्यूबेटर (5-15 मिनट) में 6 अच्छी तरह से पकवान जगह।
  8. कोशिकाओं इनक्यूबेटर में अलग है, कोट 6 गिलास नीचे के 20 माइक्रोग्राम / एमएल की एकाग्रता फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) में भंग में फ़ाइब्रोनेक्टिन की एक परत के साथ बर्तन को देखने। कोट करने के लिए व्यंजन सेल संस्कृति हुड (लगभग 20 मिनट) में सतह की अनुमति दें।
  9. एक बार कोशिकाओं अलग हैं DMEM के 2 एमएल जोड़कर ट्रिप्सिन बेअसर।
  10. अच्छी तरह से एक लेबल 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब के लिए प्रत्येक की सामग्री स्थानांतरण और एक झूलते रोटर अपकेंद्रित्र में 5 मिनट के लिए 90 XG पर नीचे स्पिन। सतह पर तैरनेवाला Aspirate और पिपेट मिश्रण द्वारा DMEM के 1,000 μL में प्रत्येक कोशिका गोली फिर से रोक देते हैं।
  11. से फ़ाइब्रोनेक्टिन मिश्रण Aspirateकांच व्यंजन और पिपेट गिलास बर्तन पर प्रत्येक कोशिका निलंबन के 1,000 μL।
  12. कोशिकाओं गिलास बर्तन के नीचे (~ 15 मिनट) के लिए व्यवस्थित करने के बाद, सेल इनक्यूबेटर में अच्छी तरह से और जगह प्रत्येक के लिए DMEM के एक और 1 एमएल + 10% एफबीएस + 1% कलम strep जोड़ें। कोशिकाओं में कम से कम 18-24 घंटे के लिए देते हैं और सेंसर व्यक्त करने के लिए अनुमति दें।
    नोट: कोशिकाओं वाणिज्यिक धनायनित लिपिड अभिकर्मक अभिकर्मकों (सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे हैं। वैकल्पिक रूप से, स्थिर सेल लाइनों एक जीन एक विष के लिए प्रतिरोध प्रदान करने के साथ एक प्लाज्मिड का उपयोग करके चुना जा सकता है (Nesprin-टीएस और -HL के लिए pcDNA प्लास्मिड डीएनए भंडार वेबसाइट पर उपलब्ध है (सामग्री की तालिका देखें) प्रदान Geneticin प्रतिरोध व्यक्त कोशिकाओं )। साथ ही, वायरल संक्रमण के तरीकों (lentivirus, रेट्रो वायरस, या adenovirus) कोशिकाओं है कि transfect करने के लिए कड़ी मेहनत कर रहे हैं में सेंसर व्यक्त करने के लिए उपयोग किया जा सकता।
  13. Nesprin-TS के अलावा, Nesprin HL शून्य के लिए के साथ अतिरिक्त कोशिकाओं transfectce नियंत्रण, कदम 2.1-2.12 में वर्णित के रूप; TSmod भी एक शून्य-शक्ति के नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता और Nesprin-HL के समान झल्लाहट प्रदर्शन करना चाहिए।
  14. mTFP1 और वीनस के साथ Transfect कोशिकाओं वर्णक्रमीय उंगलियों के निशान (चरण 4 देखें) उत्पन्न करने के लिए।
    नोट: mTFP1 और वीनस आम तौर पर Nesprin-TS से उच्च स्तर पर व्यक्त करते हैं, और इस प्रकार, डीएनए की कम मात्रा समान अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करने के लिए ट्रांसफ़ेक्ट करना पड़ सकता है।

3. परासंक्रमण प्रभावशीलता सत्यापित करें

  1. मोटे तौर पर अभिकर्मक पूरा करने के बाद 18-24 घंटे, ध्यान में रखते हुए कोशिकाओं (आमतौर पर 5-30%) की कुल संख्या के फ्लोरोसेंट कोशिकाओं की संख्या की तुलना द्वारा अभिकर्मक की दक्षता की जांच के लिए एक औंधा फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
    1. एक फ्लोरोसेंट 462 एनएम (mTFP1) या 525 एनएम (वीनस) और एक उत्सर्जन फिल्टर 492 एनएम (mTFP1) या 525 एनएम (वीनस) के पास केंद्रित के पास एक उत्तेजना आवृत्ति के साथ सुसज्जित माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, GFP फिल्टर सेट mTFP1 का एक संयोजन पर कब्जा और ve होगानुस उत्सर्जन और अभिकर्मक दक्षता की पुष्टि के लिए अनुमति देगा।
  2. अभिकर्मक के बाद 48 घंटे के भीतर छवि जीवित कोशिकाओं।
    1. वैकल्पिक रूप से, 48 ज 8 के बाद 5 मिनट, पीबीएस में दुकान के लिए, और दृश्य (कैल्शियम और मैग्नीशियम के साथ पीबीएस में) 4% paraformaldehyde में कोशिकाओं को ठीक।
      नोट: परे 48 घंटे, संकेत गुणवत्ता और ताकत decays। कोशिकाओं फिक्सिंग 8 व्यक्त की जा रही झल्लाहट सहित अपने राज्य, को बरकरार रखता है; हालांकि, कोशिकाओं केवल, पीबीएस में imaged किया जाना चाहिए के रूप में बढ़ते मध्यम झल्लाहट 14 प्रभावित कर सकता है। फिक्स्ड कोशिकाओं केवल अन्य निश्चित कोशिकाओं की तुलना में किया जा सकता है, के रूप में वहाँ अभिव्यक्ति में बदलाव हो सकता है।
      सावधानी: Paraformaldehyde विषैला होता है। उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) पहनें।

स्पेक्ट्रल unmixing के लिए mTFP1 और शुक्र fluorophores के 4. कब्जा स्पेक्ट्रल उँगलियों के निशान

  1. एक सेल संस्कृति हुड में, इमेजिंग mediu के साथ सेल मध्यम की जगहमीटर (HEPES-बफ़र) 10% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ पूरक।
  2. एक तापमान नियंत्रित (37 डिग्री सेल्सियस) कोंफोकल माइक्रोस्कोप चरण में देखने बर्तन रखें।
  3. 1.4 की एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ 60x बढ़ाई पर तेल उद्देश्य से अधिक mTFP1-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के साथ कांच को देखने के पकवान रखें।
    ध्यान दें: तेल बारीकी से कांच के अध का अपवर्तनांक सदृश 60x उद्देश्य पर एक लेजर स्कैनिंग माइक्रोस्कोप पर प्रयोग किया जाता है। तेल ऑब्जेक्टिव लेंस के शीर्ष पर रखा और गिलास coverslip के साथ सीधे संपर्क में आता है।
  4. पता लगाएँ mTFP1 एक 458 एनएम उत्तेजना स्रोत और एक उत्सर्जन बैंडपास फिल्टर 500 एनएम पर केन्द्रित साथ कोशिकाओं को व्यक्त।
  5. दृश्य के क्षेत्र में एक फ्लोरोसेंट सेल के साथ, वर्णक्रमीय का पता लगाने मोड ( "लैम्ब्डा मोड" यहां इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर में) का चयन करें और वर्णक्रमीय छवि (चित्रा 3-1) पर कब्जा; 458 10 एनएम वेतन वृद्धि (चित्रा 3-3) का उपयोग कर एनएम से परे सभी आवृत्तियों शामिल हैं। एक उज्ज्वल fluoresc का चयन करेंईएनटी क्षेत्र (आरओआई) सेल (20 पिक्सेल त्रिज्या) पर।
    नोट: mTFP1-व्यक्त लागत पर लाभ के वर्णक्रम आकार सेल भर में अपेक्षाकृत स्थिर रहना चाहिए। आकार काफी भिन्न होता है, तो लेजर फिर से समायोजित करने और संकेत से शोर अनुपात में सुधार करने के लिए सेटिंग्स प्राप्त करें।
  6. क्लिक करके वर्णक्रमीय डेटाबेस के लिए सामान्यीकृत तीव्रता जोड़े फ्लोरोसेंट लागत पर लाभ मतलब है, "डेटाबेस के स्पेक्ट्रा बचाने के।"
  7. लेजर शक्ति का अनुकूलन और इस तरह के लाभ है कि एक अच्छा संकेत करने वाली शोर अनुपात हासिल की है। सेटिंग्स विभिन्न उपकरणों के लिए अलग अलग होंगे। एक पृष्ठभूमि संदर्भ के रूप में गैर फ्लोरोसेंट, untransfected कोशिकाओं का उपयोग करना, जब तक कोशिकाओं उज्ज्वल है लाभ और शक्ति में वृद्धि, लेकिन नहीं डिटेक्टर (संतृप्ति बिंदु) के गतिशील रेंज से परे है। पृष्ठभूमि कोशिकाओं औसत के बाद पता लगाने योग्य प्रतिदीप्ति नहीं होना चाहिए।
  8. निम्नलिखित अपवादों के साथ वीनस-ट्रांसफ़ेक्ट कोशिकाओं के लिए प्रक्रिया को दोहराएं:
    1. सुनिश्चित करें कि उत्तेजना आवृत्ति 515 एनएम पर है और बैंडपास फिल्टर ce है कि530 एनएम के पास ntered जब वीनस-व्यक्त कोशिकाओं का पता लगाने।
    2. में "स्पेक्ट्रल मोड," 515 के बजाय एनएम 458 एनएम के एक उत्तेजना आवृत्ति का उपयोग करें।

5. कब्जा अमिश्रित छवियाँ

  1. करने के लिए कैप्चरिंग मोड स्विच "स्पेक्ट्रल unmixing।"
  2. (चित्रा 3, तीर-2) unmixing चैनलों में वीनस और mTFP1 के वर्णक्रम उंगलियों के निशान जोड़ें।
  3. उत्तेजना लेजर वापस एक 458 एनएम आर्गन स्रोत के लिए सेट करें।
  4. 60x तेल उद्देश्य से ऊपर Nesprin-TS देखने पकवान रखें।
  5. पर्याप्त रूप से उज्ज्वल अभिव्यक्ति के साथ एक फ्लोरोसेंट सेल पर ध्यान केंद्रित करने के बाद, संकेत करने वाली शोर अनुपात का अनुकूलन करने के लाभ और लेजर बिजली समायोजित करें।
    नोट: के बाद से Nesprin-टीएस की झल्लाहट दक्षता 20% के पास है, अमिश्रित वीनस छवि अमिश्रित mTFP1 छवि की तुलना में काफी अधिक धुंधला होना चाहिए। एक बार एक स्वीकार्य शक्ति और लाभ सेटिंग iteratively निर्धारित किया गया है, इन मानकों सभी छवियों को कैप्टन के लिए स्थिर रहना चाहिएका आश्वासन दिया।
  6. अपेक्षाकृत समान चमक के साथ Nesprin-टीएस कोशिकाओं के 15-20 छवियों की एक न्यूनतम कैद और अत्यधिक पिक्सेल संतृप्ति से बचने के (सभी संतृप्त पिक्सल छवि प्रसंस्करण के दौरान हटा दिया जाता है)।
  7. समान इमेजिंग मानकों का प्रयोग करके Nesprin-HL कोशिकाओं के साथ छवि कैप्चरिंग प्रक्रिया को दोहराएं।

6. छवि प्रसंस्करण और अनुपात छवि विश्लेषण

  1. का उपयोग करते हुए खुले स्रोत ImageJ (फिजी) सॉफ्टवेयर (http://fiji.sc/), खुले देशी प्रारूप BioFormats रीडर का उपयोग कर छवियों।
  2. पूर्व प्रक्रिया छवियों और पहले से स्थापित प्रोटोकॉल 15 का उपयोग कर अनुपात छवियों की गणना।

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Representative Results

ऊपर प्रोटोकॉल के बाद, प्लाज्मिड डीएनए डीएनए रिपोजिटरी से हासिल कर लिया और ई कोलाई कोशिकाओं में तब्दील हो गया। ई कोलाई सेंसर डीएनए व्यक्त पौंड / एम्पीसिलीन प्लेटों से चयनित और एक तरल पौंड शोरबा में परिलक्षित किया गया। वैक्टर की प्रवर्धन के बाद, डीएनए प्लास्मिड एक मानक, व्यावसायिक रूप से उपलब्ध डीएनए अलगाव किट का उपयोग TRIS-EDTA बफर में शुद्ध कर रहे थे। एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करना, शुद्ध डीएनए माइक्रोग्राम / एमएल (चित्रा 1 ए, दिन 1-2) का एक मानक एकाग्रता में मात्रा निर्धारित किया गया था।

NIH3T3 fibroblasts का उपयोग करना, कोशिकाओं एक 6 अच्छी तरह से प्लास्टिक सेल संस्कृति डिश में 70-90% संगम हो रहे थे। NIH3T3 कोशिकाओं में प्लाज्मिड डीएनए सम्मिलित करने के लिए, एक लिपिड की मध्यस्थता प्लाज्मिड अभिकर्मक प्रदर्शन किया था। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मक अभिकर्मक (सामग्री की तालिका देखें) डीएनए के लिए लिपिड पोत के रूप में इस्तेमाल किया गया था। दो प्रतिकृतिNesprin-टीएस और Nesprin-HL सेंसर 4 सेल कुओं (चित्रा 1 बी) में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे थे। झल्लाहट इमेजिंग के लिए तैयारी में, mTFP1 और वीनस के एकल फ्लोरोफोरे निर्माणों NIH3T3 कोशिकाओं (चित्रा 1 बी) में ट्रांसफ़ेक्ट कर रहे थे। अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं उच्च आवर्धन, उल्टे कोंफोकल सूक्ष्मदर्शी के साथ संगत व्यंजन को देखने के गिलास नीचे करने के लिए स्थानांतरित कर दिया गया।

कोंफोकल इमेजिंग के लिए आगे बढ़ने से पहले, एक सरल औंधा व्यापक क्षेत्र फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप अभिकर्मक दक्षता सत्यापित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एक ठेठ क्षेत्र के देखने में 0.25, कई कोशिकाओं के एक संख्यात्मक एपर्चर के साथ एक 10X उद्देश्य का उपयोग Nesprin-TS (चित्रा 2) व्यक्त किया। आम तौर पर, सेंसर परमाणु लिफाफा के आसपास स्थानीय, Nesprin-2 जी 2 के अंतर्जात स्थानीयकरण के साथ संगत। कोई-शक्ति के नियंत्रण सेंसर, Nesprin-HL, एक समान अभिव्यक्ति पैटर्न 2 का पालन किया।

(चित्रा 3, तीर-2 और चित्रा 4 ए)। फिंगरप्रिंटिंग के बाद, पर कब्जा पैरामीटर unmixing मोड पर स्विच किया गया था, mTFP1 और वीनस स्पेक्ट्रा घटकों (चित्रा 4D) के रूप में भरी हुई है। कच्चे छवियों प्रेतसंबंधी संकल्प लिया छवि के ढेर (चित्रा 4) के रूप में प्राप्त हुए थे।

अंत में, प्रेतसंबंधी संकल्प लिया छवि के ढेर के प्रसंस्करण के लिए ImageJ ओपन सोर्स सॉफ्टवेयर में आयात किया गया। छवियों पूर्व प्रोसेस किया गया है, और अनुपात छवियों स्थापित प्रक्रियाओं 15 के उपयोग से गणना कर रहे थे।

(चित्रा 5) के बीच था। हालांकि कोशिकाओं के बीच भिन्नता है, दो स्थितियों के बीच झल्लाहट में परिवर्तन इतना नाटकीय है कि आगे के विश्लेषण के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है। हालांकि, अन्य शर्तों अक्सर मिनी हैमल झल्लाहट में परिवर्तन, वे अलग-अलग छवियों के बीच नेत्रहीन discernable नहीं हो सकता है, बल्कि आवश्यकता डेटा कुल में विश्लेषण किया जाए। निर्धारित करने के लिए इन परिवर्तन महत्वपूर्ण होंगे, प्रत्येक छवि के लिए औसत झल्लाहट अनुपात गणना और नेत्रहीन हिस्टोग्राम का एक सेट के रूप में व्यक्त है। शर्तों के बीच हिस्टोग्राम की तुलना करके, यह प्रयोगात्मक समूहों के बीच झल्लाहट में सूक्ष्म परिवर्तन देखने के लिए आसान हो जाता है। चित्रा 6A और 6B में, प्रत्येक व्यक्ति के सेल की झल्लाहट हिस्टोग्राम खड़ी हिस्टोग्राम में एक रंग का प्रतिनिधित्व कर रहे। Calyculin एक का इलाज कोशिकाओं (चित्रा 6B) दिखा रहे हैं मायोसिन अवरोध करनेवाला ML7 (चित्रा 6A) के साथ इलाज कोशिकाओं को एक बाई ओर स्थानांतरित झल्लाहट हिस्टोग्राम रिश्तेदार।

आकृति 1
चित्रा 1: प्रायोगिक समय आधारित फ़्लो चार्ट। (ए) का अधिग्रहण किया Sens के साथ शुरूया प्लाज्मिड डीएनए, ई कोलाई वैक्टर डीएनए के साथ, चयनित तब्दील कर रहे हैं, और प्रवर्धित (दिन 1-2)। ध्यान केंद्रित किया कोलाई पौंड शोरबा से, प्लाज्मिड डीएनए अलग है और मात्रा निर्धारित (3 दिन)। शुद्ध डीएनए प्लास्मिड का उपयोग करना, NIH3T3 fibroblasts एक छह अच्छी तरह प्रारूप (बी) में ट्रांसफ़ेक्ट और कांच के नीचे व्यंजन है कि एक औंधा कोंफोकल माइक्रोस्कोप (3 दिन) के साथ संगत कर रहे हैं पर स्थानांतरित कर रहे हैं। अभिकर्मक की सफलता की पुष्टि करने के लिए, कोशिकाओं उचित फिल्टर सेट (4 दिन) के साथ सुसज्जित एक widefield फ्लोरोसेंट खुर्दबीन के नीचे देखा जाता है। एक सफल अभिकर्मक पर निर्भर है, कोशिकाओं एक कोंफोकल एक वर्णक्रमीय डिटेक्टर के साथ सुसज्जित खुर्दबीन पर imaged कर रहे हैं। वर्णक्रमीय unmixing का उपयोग करना, mTFP1 और वीनस चैनलों अधिग्रहण के दौरान अलग होती है और के रूप में प्रेतसंबंधी संकल्प लिया छवि के ढेर (दिन 4-5) को बचा लिया। अन्त में, छवियों ImageJ में preprocessed रहे हैं, और अनुपात-छवियों की गणना की जाती है। मिसालase यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: ट्रांसफ़ेक्ट NIH3T3 तंतुकोशिकाएं के एक प्रतिनिधि छवि। (ए) ट्रांसफ़ेक्ट NIH3T3 fibroblasts एक GFP filterset का उपयोग कर Nesprin-TS व्यक्त करने का 10X आवर्धन। (बी) के भाग ए सेंसर अभिव्यक्ति से बाउंडिंग बॉक्स के एक विस्फोट दृश्य परमाणु लिफाफा अनुसरण करता है और अक्सर कोशिका द्रव्य में फैली हुई है। (सी) Nesprin-टीएस और -HL नियंत्रण और कैसे वे एक्टिन और रवि बाध्यकारी डोमेन के लिए बाध्य। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
3 चित्र: एसpectral फिंगरप्रिंटिंग ट्यूटोरियल Confocal सॉफ्टवेयर का उपयोग करना। सामान्यीकृत उत्सर्जन स्पेक्ट्रा प्रकाश डाला क्षेत्रों के- ब्याज रंग क्रॉसहेयर द्वारा पृथक किए गए में 20 पिक्सेल त्रिज्या से प्राप्त। (तीर-1) छवि पर कब्जा करने के स्पेक्ट्रल का पता लगाने मोड। (तीर-2) "स्पेक्ट्रल unmixing" वर्णक्रमीय डेटाबेस के लिए सामान्यीकृत स्पेक्ट्रा जोड़ने के लिए सेटिंग। (तीर-3) उत्तेजना आवृत्ति। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्र 4: लाइव स्पेक्ट्रल unmixing और कोंफोकल सॉफ्टवेयर का उत्पादन। (ए) गंभीर इमेजिंग मापदंडों को लाइव, अमिश्रित छवियों पुन: पेश करने। (तीर-1) उत्तेजना आवृत्ति। (तीर-2) वर्णक्रमीय unmixing मोड जीते। अमिश्रित वीनस चैनल में (बी) नाभिक छवि। ( ओंग> सी) नाभिक अमिश्रित mTFP1 चैनल में छवि। (डी) वीनस और mTFP1 का संयुक्त छवि। (तीर-3) सेल जहां Nesprin-TS व्यक्त की जा रही है की परमाणु झिल्ली। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्र 5: पैटर्न वाली और unpatterned Madin-डार्बी कुत्ते गुर्दे (MDCK) कोशिकाओं में Nesprin-TS झल्लाहट अनुपात छवियों। MDCK कोशिकाओं है कि स्थिरतापूर्वक व्यक्त Nesprin-TS 10 सुक्ष्ममापी चौड़ा फ़ाइब्रोनेक्टिन लाइनों (ए) या unpatterned polydimethylsiloxane (PDMS) झिल्ली (बी) पर imaged किया गया। परमाणु झिल्ली नेत्रहीन नकाबपोश और झल्लाहट अनुपात में प्रोसेस किया गया। रंगीन पैमाने बार unpatterned और नमूनों नाभिक के लिए झल्लाहट अनुपात आयाम का प्रतिनिधित्व करता है।e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्र 6: प्रसंस्कृत से Ratiometric झल्लाहट छवियाँ Nesprin-TS-जताते कोशिकाओं और संकलित डेटा का हिस्टोग्राम विश्लेषण। (ए) एक प्रतिनिधि, ML7 मायोसिन अवरोध करनेवाला, अलग-अलग सेल नाभिक से रंग कोडित के साथ इलाज किया Nesprin-टीएस की झल्लाहट अनुपात छवियों की सामान्यीकृत खड़ी हिस्टोग्राम। (बी) के एक प्रतिनिधि, Calyculin ए, सेल सिकुड़ना का एक उत्प्रेरक के साथ इलाज किया Nesprin-टीएस की झल्लाहट अनुपात छवियों की सामान्यीकृत खड़ी हिस्टोग्राम। कथा हिस्टोग्राम पर इसके स्थान पर प्रत्येक का विश्लेषण किया नाभिक संबद्ध करता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

एक विधि और Nesprin-2 जी, परमाणु LINC परिसर में एक प्रोटीन भर में यांत्रिक तनाव का लाइव सेल इमेजिंग के प्रदर्शन, ऊपर उल्लिखित किया गया था। यह काम करने से पहले, इस तरह के micropipette आकांक्षा, चुंबकीय-मनका cytometry, और सूक्ष्म लेजर पृथक रूप में विभिन्न तकनीकों,, सेल नाभिक पर तनाव लागू करने के लिए और इसके थोक सामग्री गुण 16, 17, 18 को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, हमारे हाल ही काम जब तक, कोई अध्ययन सीधे दिखाया था कि तन्य बलों जीवित कोशिकाओं 2 में एक LINC जटिल प्रोटीन पर सीधे स्थानांतरित कर रहे हैं।

इससे पहले, हमारे प्रयोगशाला प्रदर्शन किया है कि Nesprin2G, के रूप में मिनी Nesprin2G जाना जाता है, का एक संशोधित संस्करण एक झल्लाहट बल TSmod (चित्रा 2C) 2 के रूप में जाना जांच व्यक्त करने के लिए इंजीनियर किया जा सकता है। TSmod पहले से गतिशील के लिए तन्य को मापने के लिए दिखाया गया थाजीवित कोशिकाओं में और विभिन्न भार असर प्रोटीन 3, 4, 6, 8 में सीईएस। आगे यह भी दिखाया गया था कि मिनी Nesprin-2 जी अपने स्थानीयकरण के संबंध में अंतर्जात Nesprin-2 जी पृथक किया गया था, cytoskeleton, और क्षमता पर भी जाना जाता है प्रभाव परमाणु स्थिति 11, 19 को बचाने के लिए। TSmod (Nesprin-टीएस) के साथ मिनी Nesprin-2 जी प्रोटीन का उपयोग करना, यह दिखाया गया था कि NIH3T3 fibroblasts सेंसर व्यक्त Nesprin-HL, करने के लिए तनाव रिश्तेदार की एक आधारभूत स्तर जो actin 2 करने के लिए बाध्य नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, inhibitors या मायोसिन की activators का उपयोग कर सेलुलर सिकुड़ना के मॉड्यूलेशन Nesprin-TS 2 द्वारा पता लगाया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम की एक संख्या हैं। Nesprin-HL (डीएनए या व्यक्त कोशिकाओं) के साथ Nesprin-TS भ्रमित readi नहीं हैly, का पता चला के रूप में दोनों इसी तरह परमाणु झिल्ली को स्थानीय बनाना, और भ्रामक परिणाम प्राप्त होंगे। चूंकि Nesprin-HL एक नहीं-शक्ति के नियंत्रण है, मापा झल्लाहट औसतन Nesprin-TS से अधिक होना चाहिए। सावधान रहना करने के लिए, अनुक्रमण पृथक डीएनए निर्माणों और ध्यान से लेबल कोशिकाओं की सलाह दी है। दूसरा, यह ध्यान से कोंफोकल माइक्रोस्कोप पर डिटेक्टर लाभ और लेजर शक्ति अनुकूलन करने के लिए संकेत करने वाली शोर अनुपात में सुधार के लिए और विरंजन कम करने के लिए महत्वपूर्ण है। ठीक से झल्लाहट मापने के लिए, इन मानकों छवि अधिग्रहण के दौरान स्थिर रहना चाहिए। इसके अलावा, मंद या बहुत उज्ज्वल व्यक्त कोशिकाओं के लिए डिटेक्टर लाभ या शक्ति के अनुकूलन क्योंकि मंझला व्यक्त कोशिकाओं डिटेक्टर के गतिशील रेंज के बाहर गिर जाते हैं जाएगा, करने से इनकी है। कुछ कोशिकाओं है कि सेंसर की एक उच्च एकाग्रता व्यक्त यह मुश्किल केन्द्रक झिल्ली, जो संभवतः संबंध के लिए करने के लिए के साथ और अधिक दिलचस्प क्षेत्र है हल करने के लिए कर रही है, nucleoplasm और जालिका प्रतिदीप्त के लिए करते हैंrce। थोड़ा कम अभिव्यक्ति के स्तर के साथ कोशिकाओं का चयन सेंसर स्थानीयकरण के इस समस्या को हल करने के लिए जाता है।

जबकि ratiometric वर्णक्रमीय इमेजिंग झल्लाहट को मापने के लिए एक अपेक्षाकृत सरल और त्वरित तरीका है, यह स्वीकर्ता संकेत ब्लीड के माध्यम से 20 के कारण झल्लाहट दक्षता की नहीं उत्पादन इकाइयों है। झल्लाहट दक्षता की इकाइयों के बिना, यह एक कैलिब्रेटेड बल माप में झल्लाहट अनुपात सूचकांक कन्वर्ट करने के लिए संभव नहीं है। इस सीमा के कारण, केवल रिश्तेदार मात्रात्मक बल तुलना की जा सकती है। झल्लाहट दक्षता ऐसे प्रतिदीप्ति-जीवन इमेजिंग माइक्रोस्कोपी (flim) या स्वीकर्ता photobleaching के रूप में और अधिक जटिल तरीकों, द्वारा निर्धारित किया जा सकता है। (पीएन स्तर पर) निरपेक्ष बल, झल्लाहट दक्षता से अनुमान लगाया जा सकता जैसा कि पहले 3, 8 का वर्णन किया।

पिछले तरीकों के विपरीत नाभिक के यांत्रिक गुणों या नाभिक आधारित ओ के विस्थापन को मापने के लिएn बाह्य लागू किया बलों, झल्लाहट को मापने से Nesprin-TS केन्द्रक झिल्ली 16, 17, 18 के एक घटक पर गैर invasively जांच तनाव का लाभ दिया है। सेंसर एक फ्लोरोसेंट संकेत है कि व्यक्ति Nesprin-2 जी अणुओं पर तनाव के साथ जोड़ा जाता आउटपुट। इसके विपरीत, micropipette आकांक्षा जब जीवित कोशिकाओं के साथ काम नाजुक उपकरणों के प्रयोग की आवश्यकता है। कोंफोकल लेजर पृथक स्थानीय सेलुलर नुकसान का कारण बनता है और एक स्पंदित लेजर स्रोत की आवश्यकता है। cytoskeleton के माध्यम से परमाणु झिल्ली पर स्थानान्तरण बलों cytometry चुंबकीय घुमा और, विशिष्ट प्रोटीन पर बलों मापने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता जब तक कि यह Nesprin-2 जी तनाव सेंसर के साथ मिलकर किया गया।

यह प्रदर्शन किया गया है जबकि उस actin आधारित तन्य बलों Nesprin-2 जी, LINC परिसर का एक घटक के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं, यह अनजान बनी हुई है कितना तन्य या संपीड़न बलों लगाए गए कर रहे हैंअन्य संरचनात्मक LINC प्रोटीन पर, इस तरह के सन -1 या सूर्य-2। भविष्य काम इन ख्यात लोड असर LINC प्रोटीन में झल्लाहट बल जांच क्लोनिंग आगे प्रोटीन के स्तर का संकल्प के साथ परमाणु यांत्रिकी स्पष्ट करना पर निर्देशित किया जाएगा। एक और मुद्दा यह है कि में प्रस्तुत करता है झल्लाहट में परिवर्तन तनाव में परिवर्तन से संबंधित नहीं हो सकता है बल्कि Nesprin-2 जी oligomerization या Nesprin-2 जी के गठनात्मक परिवर्तन में या तो बदलाव को प्रतिबिंबित करता है। सेलुलर पीएच में परिवर्तन सेंसर की प्रतिदीप्ति को प्रभावित करने और मापा झल्लाहट बदल सकते हैं। Nesprin-2 जी HL सेंसर इन परिवर्तनों में से कुछ के लिए एक अच्छा नियंत्रण का प्रतिनिधित्व करता है (के रूप में इस सेंसर के साथ मनाया झल्लाहट परिवर्तन की संभावना सबसे अधिक असंबंधित मजबूर करने के लिए कर रहे हैं), और आणविक झल्लाहट नियंत्रण निर्माणों (नीचे देखें) oligomerization आकलन करने के लिए विकसित किया जा सकता। साथ ही, nesprin-2 जी टी एस की अभिव्यक्ति एक सीएमवी प्रमोटर, जो overexpression में जो परिणाम के द्वारा संचालित है, और अभिव्यक्ति की इस उच्च स्तरीय संभावित जैविक कलाकृतियों प्रेरित कर सकते हैं। ग के साथ हाल के अग्रिमोंlustered नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) अनुरूपता निर्देशित मरम्मत के लिए अनुमति दी है (एचडीआर) जीनोम 21 में बड़े डीएनए अनुक्रम डालने के लिए दृष्टिकोण। यह दृष्टिकोण अंतर्जात Nesprin-2 जी (या अन्य प्रोटीन) को संशोधित करने के TSmod शामिल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। यह उचित अंतर्जात प्रमोटर का उपयोग कर, overexpression कलाकृतियों के लिए क्षमता को कम करने के बल सेंसर की अभिव्यक्ति प्रदान करेगा।

TSmod और अन्य लोचदार झल्लाहट जांच भी अन्य प्रोटीन है, जो तब इस आलेख में वर्णित है कि के रूप में एक समान प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता के लिए नए सेंसर विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। किसी भी नए बल सेंसर के विकास के साथ एक प्रमुख चिंता का विषय झल्लाहट सेंसर के लिए आंतरिक प्रविष्टि साइट का निर्धारण किया जाता है। सबसे पहले, प्रविष्टि की साइट प्रोटीन यांत्रिक लोड के अधीन के एक क्षेत्र में होना चाहिए। इन क्षेत्रों की जांच जहां cytoskeletal से जुड़े प्रोटीन प्रोटीन के साथ बातचीत से पहचाना जा सकता। दूसरा, प्रविष्टिबड़े की (~ 50 केडीए) TSmod को बाधित नहीं करना चाहिए प्रोटीन की जैविक समारोह का अध्ययन किया जा रहा है। Nesprin-2 जी का एक पहले विकसित "मिनी" फ़ॉर्म से पता चला कि actin बाध्यकारी सीएच डोमेन रवि बाध्यकारी KASH डोमेन के लिए पाट घायल monolayers 11, 19 में Nesprin-2 जी परमाणु आंदोलन के लिए पर्याप्त थे, सुझाव है कि TSmod की प्रविष्टि की संभावना नहीं होगा प्रोटीन समारोह को बाधित। सेंसर की जैविक क्रिया की पुष्टि प्रोटीन समारोह के लिए एक कार्यात्मक परख (जिसमें बल सेंसर अंतर्जात प्रोटीन की समाप्त हो कोशिकाओं में एक विशेष समारोह को बचाने के लिए दिखाया जा सकता है) की आवश्यकता है। तीसरा, प्रोटीन oligomerization में परिवर्तन प्रोटीन के बीच झल्लाहट (करार दिया आणविक झल्लाहट 22) है, जो झल्लाहट परिवर्तन है कि मजबूर करने के लिए संबंधित नहीं हैं में परिणाम होगा बदल सकते हैं। इस का एक सावधान विश्लेषण अक्सर विशेष आणविक झल्लाहट निर्माणों कि विशेष रूप से oligomerization रिपोर्ट की आवश्यकता है।

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Acknowledgments

इस काम के थॉमस एफ और केट मिलेर जेफ्फ्रेस मेमोरी ट्रस्ट (डीईसी) और एनआईएच द्वारा समर्थित किया गया R35GM119617 (डीईसी के लिए) प्रदान करते हैं। कोंफोकल माइक्रोस्कोप इमेजिंग VCU नेनोसामग्री विशेषता कोर (एनसीसी) सुविधा पर प्रदर्शन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Nesprin-TS DNA Addgene 68127 Retrieve from https://www.addgene.org/68127/
Nesprin-HL DNA Addgene 68128 Retrieve from https://www.addgene.org/68128/
mTFP1 DNA Addgene 54613 Retrieve from https://www.addgene.org/54613/
mVenus DNA Addgene 27793 Retrieve from https://www.addgene.org/27793/
TSmod DNA Addgene 26021 Retrieve from https://www.addgene.org/26021/
Competent Cells Bioline BIO-85026
Liquid LB Media ThermoFisher 10855001 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001
Solid LB Bacterial Culture Plates Sigma-Aldrich L5667 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en&region=US
Ampicillin Sigma A9518
Spectrophotometer Biorad 273 BR 07335 SmartSpec Plus
quartz cuvette Biorad 1702504 Cuvette for SmartSpec Plus
DNA isolation kit Macherey-Nagel 740412.5 NucleoBond Xtra Midi Plus
6-well cell culture dish Falcon-Corning 353046 Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish
Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media Gibco 11995-065 DMEM(1x)
Bovine Serum Life Technologies 16170-078
reduced serum cell media Gibco 31985-070 Reduced Serum Medium, "optimem"
Lipid Carrier Solution invitrogen 11668-019 Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000"
1.5 mL sterile plastic tube Denville c2170
Trypsin Gibco 25200-056 0.25% Trypsin-EDTA (1x)
glass-bottom microscope viewing dish In Vitro Scientific D35-20-1.5-N 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass
Fibronectin ThermoFisher 33016015 fibronectin human protein, plasma
Phosphate Buffered Saline (PBS) Gibco 14190-144 Dulbecco's Phosphate Buffered Saline
15 mL sterile centrifuge tube Greiner bio-one 188261
swinging rotor centrifuge  Thermo electron Centra CL2 Swinging rotor thermo electron 236
cell culture biosafety hood Forma Scientific 1284
climate controlled cell culture incubator ThermoFisher 3596
inverted LED widefield fluorescent microscope Life technologies EVOS FL
Clear HEPES buffered imaging media Molecular Probes A14291DJ
Fetal bovine Serum Life technologies 10437-028
Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources  Zeiss  LSM 710-w/spectral META detector
Outgrowth Media Newengland Biolabs B9020s
NIH 3T3 Fibroblasts ATCC CRL-1658

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Arsenovic, P. T., Bathula, K., Conway, D. E. A Protocol for Using Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force Biosensors to Measure Mechanical Forces across the Nuclear LINC Complex. J. Vis. Exp. (122), e54902, doi:10.3791/54902 (2017).

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