Introduction
力の影響を受けやすい、遺伝的にコードされたFRETセンサーは、最近、生細胞の引張ベースの力を測定するタンパク質1、2、3、4の両端に印加されている方法を機械的な力への洞察を提供するための重要なツールとして浮上しています。これらのツールを使用して、研究者は、従来の蛍光顕微鏡を使用して、生きた細胞における非侵襲的に画像細胞内力することができます。これらのセンサは、弾性ペプチド3によって分離されたFRET対（ドナー及びアクセプター蛍光タンパク質、最も頻繁青色ドナーおよびアクセプタ黄色）から成ります。 C-またはN末端タグとは対照的に、このセンサーは、分子歪みゲージとして挙動、タンパク質を横切って伝達される機械的な力を測定するためにタンパク質の内部部位に挿入されます。 FRET-Pとの間の距離の増加にセンサ結果を横切って機械的張力を増加させ空気減少FRET 3で得られました。結果として、FRETは逆の引張力に関連しています。
これらの蛍光ベースのセンサは、焦点接着タンパク質（ビンキュリン3及びタリン4）、細胞骨格タンパク質（αアクチニン5）のために開発されており、細胞-細胞接合タンパク質（E-カドヘリン6、 図7は 、VEカドヘリン8、及びPECAM 8）。これらのバイオセンサーにおいて最も頻繁に使用され、よく特徴付け弾性リンカーはTSmodとして知られており、スパイダーシルクタンパク質の鞭毛から得られた40個のアミノ酸、（GPGGA）8、の反復配列から構成されています。 TSmod引張力3の1〜5 pNでのFRET応答と、線形弾性ナノスプリングとして動作することが示されています。鞭毛の異なる長さは、動的Rを変更するために使用することができますTSmod FRET力感度9のアンジュ。鞭毛に加えて、スペクトリンは、（HP35として知られている）5とビリンヘッドピースペプチド4を繰り返し、同様の力バイオセンサ4におけるFRET対の間に弾性ペプチドとして使用されてきました。最後に、最近の報告ではTSmodも圧縮力10を検出するために使用することができることを示しました。
我々は最近、内因性と同様に動作ミニNesprin2G（ 図2C）として知られている、以前に開発された切断型Nesprin2Gタンパク質に挿入TSmodを使用して、核-細胞骨格（LINC）複合タンパク質Nesprin2Gのリンカーの力センサを開発しましたNesprin-2G 11。 LINC複合体は核ラミナに細胞質細胞骨格をつなぐ、核の外側から内側につながる複数のタンパク質が含まれています。 Nesprin-2Gは、両方に結合する構造タンパク質であります細胞質内及び核周囲空間にSUNタンパク質へのアクチン細胞骨格。私たちのバイオセンサーを使用して、我々はNesprin-2Gは、NIH3T3線維芽細胞2におけるアクトミオシン依存テンションの対象であることを示すことができました。これは、その力は直接核LINC複合体中のタンパク質間で測定した初めてだったし、メカノにおける核の力の役割を理解するための重要なツールになる可能性があります。
以下のプロトコルは、哺乳動物細胞におけるNesprin張力センサ（Nesprin-TS）の発現を含むNesprin-2G力センサ、ならびにNesprin-を発現する細胞のFRET画像の取得および分析を使用する方法の詳細な方法を提供しますTS。スペクトル検出器を備えた倒立共焦点顕微鏡を使用して、スペクトルアンミキシング及びレシオメトリックFRETイメージングを用いて増感発光FRETを測定する方法の説明が提供されます。出力レシオメトリック画像は相対的な資格を作るために使用することができますntitative力の比較。このプロトコルは、線維芽細胞におけるNesprin-TSの発現に焦点を当てているが、それは、細胞株および初代細胞の両方を含む他の哺乳動物細胞に容易に適合可能です。また、画像取得およびFRET分析に関連するこのプロトコルは、容易に他のタンパク質のために開発された他のFRETベースの力のバイオセンサーに適用することができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Nesprin-2GセンサーDNA及び他のプラスミドDNAを得ます
- 商業的供給源からNesprin-2G TS（張力センサ）、Nesprin-2G HL（ヘッドレス）制御、mTFP1、ビーナス、およびTSmodを得ます。全てのDNAプラスミドを伝播し、先に12、13のように、そのようなDH5-αのような標準的な大腸菌株を使用して精製します。
Nesprin-2G及び他のプラスミドDNAと2トランスフェクト細胞
- 温度（37°C）とCO 2（5％）の調節と、標準的な細胞培養インキュベーター中で6ウェル細胞培養皿に70〜90％コンフルエンスにNIH 3T3線維芽細胞を成長させます。細胞増殖培地については、10％ウシ胎児血清を補充したダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）を使用します。
- 細胞培養フード中で、培地を除去し、減血清細胞培地の約1 mLで各ウェルをリンスします。各ウェルに減少し、血清細胞培地の800μLを追加そしてインキュベーター中で6ウェルチャンバーを置きます。
- 脂質キャリア溶液35μLと1.5mlチューブに還元血清細胞培地のピペット700μL「はlipomix」を形成します。ピペッティングにより混和します。 「L」でチューブにラベルを付けます
- 6本の1.5 mLチューブに収集し、各チューブに還元血清細胞培地の1 6を介してピペット100μLそれらを標識します。
- mVenus 5.ピペット1μgのチューブ内チューブ3,4ピペット1 mTFPμgの内管1と2ピペット2 Nesprin-HLμgのにステップ1、ピペット2 Nesprin 2G-TSのμgのからのプラスミドDNA濃度を用いてチューブ6に再使用しないでくださいピペットチップをDNAの異なる種類をピペットとき。
- 各標識されたチューブ（1-6）に「L」チューブからlipomixのピペット100μLとを繰り返しピペッティングにより混合します。各チューブのためのクリーンなピペットを使用してください。 10〜20分間インキュベートします。
- 70〜90％コンフルエントで6ウェルチャンバーの各標識されたチューブからウェルに200μLを加えます細胞。対応するDNAを用いて、各ウェルの上部にラベルが追加されました。 4~6時間インキュベーター中で6ウェルチャンバーを置きます。
- 培地を吸引し、洗浄するために減血清細胞培地の1~2ミリリットルを加えます。 、減血清細胞培地を吸引し、各ウェルにトリプシン2 mlを加え、そしてインキュベーター（5〜15分）で6ウェル皿を置きます。
- 細胞は、インキュベーター内でリン酸緩衝食塩水（PBS）に溶解した20μgの/ mlの濃度でフィブロネクチンの層で被覆6ガラス底観察皿を取り外しています。細胞培養フード（約20分）で被覆する皿に表面を可能にします。
- 細胞が剥離された後DMEMを2mLを添加することによってトリプシンを中和します。
- ウェル標識15 mL遠心管にそれぞれの内容を転送し、スイングローター遠心機で5分間90×gでスピンダウン。上清を吸引し、ピペット混合によるDMEM 1,000μLの各細胞ペレットを再懸濁。
- からフィブロネクチン混合物を吸引ガラス皿とピペットガラス皿に各細胞懸濁液を1,000μL。
- 細胞をガラス皿（〜15分）の底に沈殿した後、各ウェルの細胞インキュベーター内の場所に+ 10％FBS + 1％ペニシリン - ストレプトマイシンDMEMの別の1 mLを加え。細胞が付着し、少なくとも18〜24時間センサーを発現することを可能にします。
注：細胞は、（ 材料の表を参照）は、市販のカチオン性脂質トランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトされます。代替的に、安定な細胞株は、毒素に対する耐性を付与する遺伝子を有するプラスミドを用いて選択することができる（Nesprin-TSと-HLためのpcDNAプラスミドはジェネティシン耐性を発現する細胞は、（ 材料の表を参照）を提供するDNAリポジトリウェブサイト上で利用可能です）。また、ウイルス感染法（レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）をトランスフェクトすることが困難である細胞内センサーを発現させるために利用することができます。 - Nesprin-TSに加えて、ゼロためNesprin HLと追加の細胞をトランスフェクトステップ2.1から2.12に記載のようにCE制御、。 TSmodもゼロ力制御として使用することができ、Nesprin-HLと同様のFRETを示すべきです。
- スペクトル指紋（ステップ4参照）を生成するmTFP1と金星で細胞をトランスフェクトします。
注：mTFP1と金星は、典型的にはNesprin-TSより高いレベルで発現し、そのようなものとして、DNAのより低い量は、同様の発現レベルを達成するために、トランスフェクトされる必要があるかもしれません。
3.トランスフェクション効率を確認してください
- おおよそ18〜24時間のトランスフェクションを完了した後、図中の細胞（通常5~30％）の総数に蛍光細胞の数を比較することにより、トランスフェクション効率を調べるために、倒立蛍光顕微鏡を使用します。
- 462ナノメートル（mTFP1）または525 nmの（金星）と492 nmの（mTFP1）または525 nmの（金星）付近に中心発光フィルターの近くに励起周波数を備えた蛍光顕微鏡を使用します。
注：また、GFPフィルターセットはmTFP1の組み合わせをキャプチャしましますNUSの排出量およびトランスフェクション効率の確認が可能になります。
- 462ナノメートル（mTFP1）または525 nmの（金星）と492 nmの（mTFP1）または525 nmの（金星）付近に中心発光フィルターの近くに励起周波数を備えた蛍光顕微鏡を使用します。
- トランスフェクション後48時間以内に画像生細胞。
- あるいは、5分間、PBS中の店舗、および48時間後8ビューの（カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS）で4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定。
注：48時間を超えて、信号の品質と強度が減衰します。細胞を固定する8を発現さFRETを含め、その状態を保持し、媒体を装着すると、FRET 14に影響を与える可能性がしかし、細胞のみ、PBSで画像化されるべきです。発現の変化があってもよいように固定された細胞のみが、他の固定された細胞と比較することができます。
注意：パラホルムアルデヒドは有毒です。適切な個人用保護具（PPE）を着用してください。
- あるいは、5分間、PBS中の店舗、および48時間後8ビューの（カルシウムおよびマグネシウムを含むPBS）で4％パラホルムアルデヒドで細胞を固定。
スペクトルアンミキシング4. mTFP1のキャプチャスペクトル指紋と金星フルオロフォア
- 細胞培養フード内で、撮像mediuと細胞培地を交換10％ウシ胎児血清を補充したM（HEPES緩衝化）。
- 温度制御（37°C）共焦点顕微鏡のステージに表示皿を置き。
- 1.4の開口数60X倍率でオイル対物上mTFP1トランスフェクト細胞とガラス視聴皿を置き。
注記：オイルは密接ガラス基板の屈折率に似せて60X対物レンズでレーザ走査型顕微鏡に使用されます。油は、対物レンズの上に置かれ、カバーガラスと直接接触しています。 - mTFP1は、458 nmの励起源から500nmに中心発光帯域通過フィルタで発現細胞見つけ。
- 視野中の蛍光細胞と、（ここで使用されるソフトウェア中の「ラムダモード」）スペクトル検出モードを選択して分光画像（ 図3-1）を取り込みます。 10nmの増分（ 図3-3）を使用して458 nmで超えるすべての周波数を含みます。明るいfluorescを選択細胞（20ピクセル半径）でENT領域（ROI）。
注：mTFP1発現ROIのスペクトル形状は、セルを横切って比較的一定のままであるべきです。形状が大きく変化する場合、信号対雑音比を改善するために、レーザおよび利得設定を再調整します。 - クリックすることで、スペクトルのデータベースに、蛍光ROIが意味する正規化強度を追加「データベースにスペクトルを保存します。」
- レーザパワーを最適化し、良好な信号対雑音比が達成されるように得ます。設定が異なる機器によって異なります。背景参照として非蛍光、非トランスフェクト細胞を使用してではなく、検出器（飽和点）のダイナミックレンジを超えて、細胞が明るくなるまで利得及び電力を増加させます。背景細胞は平均化した後に検出可能な蛍光を持つべきではありません。
- 以下の例外を除いて金星トランスフェクト細胞のためのプロセスを繰り返します。
- 励起周波数は515 nmであることを確認し、帯域通過フィルタは、CEであることビーナス発現細胞の位置を特定する際に530 nm付近ntered。
- 「スペクトルモード」の代わりに458 nmで515 nmの励起周波数を使用します。
5.キャプチャ未撹拌の画像
- 撮影モードの切り替え「スペクトルアンミキシング。」
- アンミキシングチャネル（ 図3、矢印-2）に金星とmTFP1のスペクトル指紋を追加します。
- バック458 nmのアルゴンソースへの励起レーザを設定します。
- 60X油客観上記Nesprin-TS見て料理を置きます。
- 十分に明るい式を有する蛍光細胞に焦点を当てた後、信号対雑音比を最適化するゲインとレーザパワーを調整します。
注：Nesprin-TSのFRET効率が20％近くにあるので、非混合ビーナス画像は非混合mTFP1画像よりも実質的に調光器であるべきです。許容可能なパワーとゲイン設定が反復的に決定された後は、これらのパラメータは、すべての画像CAPTのために一定のままでなければなりませんured。 - 比較的近い明るさでNesprin-TS細胞の15-20画像の最小値をキャプチャし、（すべての飽和画素が画像処理中に除去される）過度の画素の飽和を避けます。
- 同じ撮像パラメータを用いNesprin-HL細胞を用いた撮影処理を繰り返します。
6.画像処理および比画像解析
- オープンソースのImageJ（フィジー）ソフトウェア（http://fiji.sc/）を使用して、BioFormats Readerを使用してネイティブ形式の画像を開きます。
- 前処理画像と以前に確立されたプロトコル15を使用して比画像を計算します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
上記のプロトコルに従って、プラスミドDNAは、DNAリポジトリから取得し、 大腸菌細胞に形質転換しました。センサDNAを発現する大腸菌は、LB /アンピシリンプレートから選択し、液体LBブロス中で増幅しました。ベクターの増幅後、DNAプラスミドは、標準的な、市販のDNA単離キットを使用して、TRIS-EDTA緩衝液に精製しました。分光光度計を用いて、精製されたDNAは、/ mlの（ 図1A、日1-2）の標準濃度に定量しました。
NIH3T3線維芽細胞を用いて、細胞を6ウェルプラスチック細胞培養皿に70〜90％コンフルエンスまで増殖させました。 NIH3T3細胞へのプラスミドDNAを挿入するために、脂質媒介プラスミドトランスフェクションを行いました。市販のトランスフェクション試薬（ 材料の表を参照されたい）DNA脂質容器として使用しました。の2つの複製Nesprin-TSとNesprin-HLセンサ4つの細胞ウェル（ 図1B）にトランスフェクトしました。 FRET画像化の準備のために、mTFP1と金星の単一蛍光体構築物は、NIH3T3細胞（ 図1B）にトランスフェクトしました。トランスフェクション後、細胞を高倍率と互換性のガラス底視聴皿、倒立型共焦点顕微鏡に移しました。
共焦点画像に進む前に、単純な反転広視野蛍光顕微鏡は、トランスフェクション効率を確認するために使用しました。 0.25の開口数で10倍対物レンズを使用して、典型的な視野における多くの細胞がNesprin-TSに（ 図2）を発現しました。一般的に、センサはNesprin-2G 2の内因性の局在と一致し、核膜の周りに局在します。無力制御センサ、Nesprin-HLは、同様の発現パターン2に従いました。
最後に、スペクトル分解画像スタックは、処理のためにImageJのオープンソースソフトウェアにインポートしました。画像は、前処理し、そして比画像は、確立された手順15を使用して計算しました。
図1： 実験時間ベースのフローチャートです。 （A）を取得SENSで開始またはプラスミドDNA、 大腸菌ベクターは、DNAで形質転換し、選択し、及び（日1-2）増幅されます。濃縮大腸菌 LBブロスから、プラスミドDNAを単離し、（3日目）を定量しました。精製されたDNAプラスミドを使用して、NIH3T3線維芽細胞を、6ウェルフォーマット（B）にトランスフェクトし、倒立共焦点顕微鏡（3日目）と互換性のあるガラスボトムディッシュ上に転写されます。トランスフェクションの成功を確認するために、細胞は、適切なフィルターセット（4日目）を備えた広視野蛍光顕微鏡下で観察されます。トランスフェクションの成功次第、細胞は、スペクトル検出器を備えた共焦点顕微鏡上に結像されます。スペクトルアンミキシングを使用して、mTFP1と金星チャネルは、取得中に分離し、スペクトル分解画像スタック（日4-5）として保存されています。最後に、画像がImageJの中で前処理され、かつ比-画像が計算されます。 PLEASEこの図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2： トランスフェクトNIH3T3線維芽細胞の代表画像。 （A）GFPのフィルターセットを用いNesprin-TSを発現するトランスフェクトされたNIH3T3線維芽細胞の10X倍率。 （B）パートA.センサー式からバウンディングボックスの分解図では、核膜をたどり、多くの場合、細胞質内に延びています。 （C）Nesprin-TSと-HLコントロールとどのように彼らはアクチンとSUN結合ドメインに結合します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3：S共焦点ソフトウェアを使用してpectral指紋チュートリアル。強調表示された領域の関心着色十字線によって描写に20ピクセル半径から得られた正規化発光スペクトル。画像をキャプチャする（矢印1）スペクトル検出モード。スペクトルデータベースに正規化されたスペクトルを追加するために設定する（矢印2）「スペクトルアンミキシング」。 （矢印-3）励起周波数。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： ライブスペクトルアンミキシングと共焦点ソフトウェアの出力。 （A）クリティカル撮像パラメータは、ライブ、非混合画像を再現します。 （矢印-1）励起周波数。 （アロー-2）は、スペクトルアンミキシングモードをライブ。 （B）非混合ビーナスチャネル内核画像。 （
図5： パターン化およびパターン化されていないマディンダービーイヌ腎臓（MDCK）細胞におけるNesprin-TS FRET比画像。安定Nesprin-TSを発現するMDCK細胞を、10μmの幅のフィブロネクチン線（A）またはパターン化されていないポリジメチルシロキサン（PDMS）膜（B）上で画像化しました。核膜は、視覚的にマスクされ、FRET比に加工しました。着色スケールバーは、パターン化されていないとパターニング核のためのFRET比の振幅を表します。e.jove.com/files/ftp_upload/54902/54902fig5large.jpg」ターゲット= 『_空白』>この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図6：Nesprin-TS を発現する細胞および集計データのヒストグラム解析から処理レシオメトリックFRETフォト。 （A）代表、ML7ミオシン阻害剤で治療Nesprin-TSのFRET比画像の正規化された積層ヒストグラムは、個々の細胞の核によって色分け。 （B）代表、カリキュリンA、細胞収縮性の活性化剤で処理Nesprin-TSのFRET比画像の正規化された積層ヒストグラム。伝説は、ヒストグラム上のその場所にそれぞれ分析した核を相関させます。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nesprin-2G、核LINC複合体中のタンパク質を横切る機械的張力の生細胞イメージングの方法及び実証は、上記に概説しました。前にこの作業を、そのようなマイクロピペット吸引、フローサイトメトリー、磁気ビーズ、および顕微鏡レーザアブレーションのような種々の技術が、細胞核に歪みを適用するために、そのバルク材料特性16、17、18を測定するために使用されてきました。 しかし、我々の最近の仕事まで、何の研究では、直接引張力が生きた細胞2にLINC複雑なタンパク質に直接転送されていることを示していませんでした。
以前に、我々の研究室では、ミニNesprin2Gとして知らNesprin2Gの修正版は、TSmod（ 図2C）2として知られているFRET力プローブを発現するように操作され得ることを実証しました。 TSmodは、以前に動的ための引張を測定することが示されました生細胞および種々の耐荷重タンパク質3、4、6、8 CES。それはさらに、そのミニNesprin-2Gは、その局在化、細胞骨格上の既知の効果、及び核位置11、19を救出する能力に関して内因性Nesprin-2Gと区別できなかったことが示されました。 TSmod（Nesprin-TS）ミニNesprin-2Gタンパク質を用いて、センサを発現するNIH3T3線維芽細胞は、アクチン2に結合することができないNesprin-HL、に対する張力の基線レベルを有することが示されました。さらに、ミオシンの阻害剤または活性化剤を使用して、細胞収縮の調節はNesprin-TS 2によって検出することができます。
このプロトコルの重要なステップの数があります。 Nesprin-HL（DNA又は発現細胞）とNesprin-TSを混乱するreadiありません両方とも同様に核膜に局在し、紛らわしい結果につながるようLYは、検出されました。 Nesprin-HLが無力制御であるため、測定されたFRETは平均Nesprin-TSよりも高くなければなりません。慎重に、単離されたDNA構築物および慎重ラベリング細胞の配列を決定することをお勧めします。第二に、慎重に信号対雑音比を改善し、漂白を最小限にするために、共焦点顕微鏡で検出器利得とレーザパワーを最適化することが重要です。適切にFRETを測定するために、これらのパラメータは、画像取得中一定に保たなければなりません。中央値発現細胞が検出器のダイナミックレンジの外に落下する傾向があるので、また、薄暗いまたは非常に明るい発現する細胞を検出器利得または電力を最適化することは、準最適です。センサの高濃度に発現する特定の細胞が困難おそらくFOへに関してより興味深い領域である核膜を、解決すること、核質及び小胞体に蛍光を発する傾向がありますRCE。若干低い発現レベルを有する細胞を選択すると、センサーのローカリゼーションのこの問題を解決する傾向があります。
レシオメトリックスペクトルイメージングはFRETを測定するための比較的簡単で迅速な方法であるが、それが原因アクセプタ信号ブリードスルー20にFRET効率のない出力単位を行います。 FRET効率の単位がなければ、較正力測定にFRET比インデックスを変換することは不可能です。この制限のため、唯一の相対定量力の比較を行うことができます。 FRET効率は、蛍光寿命イメージング顕微鏡法（FLIM）またはアクセプター光退色などのより複雑な方法によって決定することができます。以前3,8に記載のように（PNレベル）の絶対力は、FRET効率から推定することができます。
以前の方法とは対照的に、核または核基づいOの変位の機械的特性を測定しますN外部Nesprin-TSは、核膜16、17、18の構成要素に非侵襲的プロービング張力の利点を有するからFRETを測定する、力を適用しました。センサは、個々Nesprin-2G分子上の歪みと相関する蛍光シグナルを出力します。生細胞を扱うときは対照的に、マイクロピペット吸引は、繊細なツールを使用する必要があります。共焦点レーザーアブレーションは、地元の細胞の損傷を引き起こし、パルスレーザ源が必要です。細胞骨格を介して核膜への転送力サイトメトリー、磁気ねじれそれはNesprin-2G張力センサと結合されるようにした場合を除き、特定のタンパク質に作用する力を測定するために使用することができません。
アクチンベースの引張力がNesprin-2G、LINC複合体の成分に転送されることが実証されているが、それは引張または圧縮力が作用しているどのくらいの未知のままで他の構造LINCタンパク質へ、例えばSUN-1又はSUN-2。今後はさらに、タンパク質レベルの分解能で核機構を解明するために、これらの推定上の荷重支持LINCタンパク質にFRET力プローブをクローニングすることに向けられます。それ自身を示すもう一つの問題は、FRETの変化が張力の変化に無関係ではなく、むしろNesprin-2Gのオリゴマー化またはNesprin-2Gのコンホメーション変化のいずれかで変更を反映することができるということです。携帯pHの変化は、センサの蛍光に影響を与え、測定FRETを変更することができます。 （このセンサを用いて観察FRET変化が最も可能性が高い無関係力にあるように）Nesprin-2G HLセンサは、これらの変更のいくつかのための良好な制御を示し、分子間FRETコントロール構築物（下記参照）、オリゴマー化を評価するために開発することができます。また、nesprin-2G TSの発現は、過剰発現をもたらすCMVプロモーターによって駆動され、発現のこの高いレベルは、潜在的に生物学的アーティファクトを誘導することができます。 Cでの最近の進歩lustered定期interspaced短いパリンドローム反復（CRISPR）は、相同性指向修理のために許可されている（HDR）はゲノム21に大きなDNA配列を挿入するために近づきます。このアプローチはTSmodを含むように、内因性Nesprin-2G（又は他のタンパク質）を変更するために使用することができます。これは、過剰発現のアーティファクトの可能性を減らすこと、適切な内因性のプロモーターを用いた力センサーの発現を提供します。
TSmodおよび他の弾性FRETプローブはまた、この資料に記載されたものと同様のプロトコールで使用することができる他のタンパク質のための新たなセンサを開発するために使用することができます。新たな力センサの開発に大きな懸念は、FRETセンサー用の内部挿入部位を決定しています。まず、挿入部位は、機械的負荷を受けるタンパク質の領域内になければなりません。これらの領域は、細胞骨格に接続されたタンパク質は、タンパク質と相互作用する場所を調べることによって識別することができます。第二に、挿入大きな（〜50 kDaの）のTSmodが研究されているタンパク質の生物学的機能を破壊してはなりません。 Nesprin-2Gの以前に開発された「ミニ」形態は、SUN-結合KASHドメインに架橋アクチン結合CHドメインはTSmodの挿入は、おそらくないであろうことを示唆し、創傷単層11にNesprin-2G核移動のため19に十分であったことを示しましたタンパク質の機能を破壊します。センサーの生物学的機能の確認は、（力センサは、内因性タンパク質の枯渇細胞における特定の機能を救出することを示すことができた）タンパク質の機能のための機能的アッセイを必要とします。第三に、タンパク質のオリゴマー化の変化は、強制的に関連しないFRET変化をもたらすタンパク質間のFRET（称される分子間FRET 22）を 、変更することができます。このの慎重な分析は、多くの場合、具体的オリゴマー化を報告し、特殊な分子間FRETの構造を必要とします。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
この作品は、トーマスF.と（12月に）ケイト・ミラー・ジェフレスメモリア信託（DEC）はNIH助成金R35GM119617によってサポートされていました。共焦点顕微鏡イメージングはVCUナノキャラクタリゼーションコア（NCC）施設で行いました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5 mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35 mm Dish with 20 mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein, plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15 mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515 nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, Pt 22 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, Pt 2 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, Pt 22 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), New York, N.Y. 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, Pt 2 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
