Abstract
Рак молочной железы является основной причиной, связанной с раком смертности у женщин во всем мире. метастаз печени участвует в свыше 30% случаев с метастазами рака молочной железы, а также приводит к плохим результатам медиана выживаемости только 4,8 - 15 месяцев. Текущие модели на грызунах метастазирования рака молочной железы, в том числе ксенотрансплантата первичной опухолевых клеток и спонтанных моделях опухолей, редко метастазирует в печень. Внутриутробная и внутриселезеночное модели инъекций действительно приводят метастазов в печени, однако эти модели могут быть искажены сопутствующей метастазирования вторичного сайта, либо нарушенным иммунитетом вследствие удаления селезенки, чтобы избежать роста опухоли в месте инъекции. Для того, чтобы удовлетворить потребность в улучшенных моделей метастазов в печени, мышиного воротной вены методом впрыска, который обеспечивает клетки опухоли во-первых, так и непосредственно в печень была разработана. Эта модель обеспечивает опухолевые клетки печени без осложнений сопутствующих метастазов в других органах или удаление селезенки. неавтоматическогоimized портал протокола вены использует небольшие объемы инъекции 5 - 10 мкл, ≥ 32 калибровочных игл и гемостаза марли в месте инъекции, чтобы контролировать потери крови. Воротной вены инъекции подход в BALB / с самок мышей с использованием трех сингенных опухоли молочной железы линии различной степени испытывали метастатический потенциал; 4T1 клетки на высоком метастатическим, умеренно-метастатических D2A1 клетки и низким метастатическим D2.OR клетки. Концентрации ≤ результатов 10000 клеток / инъекции в латентности ~ 20 - 40 дней для развития метастазов в печени с более высоким метастатическим 4Т1 и D2A1 линий и> 55 дней для менее агрессивной D2.OR линии. Эта модель представляет собой важный инструмент для изучения груди метастазирования рака печени, и могут быть применимы к другим видам рака, которые часто метастазирует в печень, включая колоректальный рак поджелудочной железы и аденокарциномы.
Introduction
Рак молочной железы метастазы в печень
Печень является общим местом метастазирования рака молочной железы, а также костей и легких 1-3. Метастазов в печени у больных раком молочной железы является независимым прогностическим фактором для очень плохих исходов 4,5, а медиана выживаемости больных раком молочной железы с диапазонами метастазов в печени от 4,8 до 15 месяцев 6-9. В отличие от этого , больных раком молочной железы с легкого или метастазов в кости имеют средние показатели выживаемости 9 до 27,4 месяцев 8,9 и 16,3 до 56 месяцев 8,10-12, соответственно. Метастазирование представляет собой многоэтапный процесс, называемый метастатического каскада, который начинается с распространением опухолевых клеток в первичной опухоли и заканчивается смертности пациентов из - за посевом и выроста циркулирующих опухолевых клеток в отдаленный орган 13-15. Моделях грызунов метастаз показали, что метастатический каскад удивительно неэффективным, только 0,02 - 10%циркулирующих опухолевых клеток , устанавливающих откровенного метастазирование 16,17. Одним из основных узких мест метастатической неэффективности продиктован уникальной микросреды ткани на вторичных участках, называемых метастатических нишах 18, подчеркивая важность понимания по конкретным участкам метастазирования. Метастатический ниша является уникальным для сайта рецидива, и, в частности, характеризуется отложением различных белков внеклеточного матрикса 19,20, инфильтрацией различных популяциях клеток иммунной системы , а также 21-23 измененном гомеостаза ткани , включая дизрегуляции производства многочисленных цитокинов, хемокины и факторы роста 15,18,24,25. Таким образом, понимание ткани специфической нише метастатическим предшествует понимание того, как целевой метастазирования. Тем не менее, надежные модели метастазов в печени отсутствуют. Кроме того, улучшенные модели метастазов в печени будет иметь важное значение для определения новых целей и эффективных методов лечения больных раком молочной железы Wiй метастазы в печень.
Основанная модели , чтобы изучить Рак молочной железы метастазы в печени
В настоящее время имеющиеся модели для изучения метастазирование рака молочной железы в печень включают ксенотрансплантатов раковых клеток человека в иммунных мышей скомпрометирована. Эти модели , как правило , используют хорошо изученные человеческие клеточные линии рака молочной железы , такие как MCF-7 и MDA-MB-231 и Ню, RAG1 - / - или SCID иммунные скомпрометированы мышиные хозяев 26-29. Ксенотрансплантата модели обеспечивают преимущество с участием клеточных линий рака человека происходит, однако, учитывая недавнюю оценку для иммунных клеток в метастазирования 30-32 и в терапевтической резистентности 33-35, исследование метастазирования в полностью иммунокомпетентных хозяина имеет первостепенное значение. Модели для изучения груди метастазирования рака печени в иммунокомпетентных хозяев включают ортотопической инъекции сингенных опухолевых клеток (например, 4T1 и D2A1 клеточных линий) в жировой ткани молочных желез, с или без хирургическогорезекцию первичной опухоли, и последующая оценка метастаз 36-38. Следует отметить, что скорость метастазов в печени из моделей ортотопической трансплантации является очень низким или несуществующим по сравнению с другими метастазами , таких как легкие 39,40, или происходит после того, как установлено метастаз легких, что затрудняет исследование печени конкретных метастазирования 37,39 ,
Опухолевые эксплантов из спонтанных генетически модифицированных моделей рака молочной железы может быть повторно введен в молочных жировым наивных хозяев как сингенных опухолевых клеток. Например, недавно было сообщено , что спонтанные опухоли от K14 Cre ECAD F / F P53 F / F мышей, которые модель инвазивный рак молочной железы очаговая, развиваются опухоли , когда ортотопически вводят в дикого типа хозяев. После хирургической резекции этих опухолей , как только они достигают 15 мм 2, 18% мышей прогрессировали до метастазов в печени 40,41. Третий подход к модели метастазов в печень используетспонтанное метастазирование в генетически модифицированных мышей. На сегодняшний день сообщения о спонтанных мышиных моделях рака молочной железы, что метастаз легко распространился на печень являются редкостью. Исключение составляют H19-Igf2, р53 Fp / Fp MMTV-Cre Wap-Cre, а K14 Cre ECAD F / F P53 F / F генетически модифицированных моделей мышей, где метастаз печени развивается в низкий процент мышей 38,41- 43. Таким образом, в то время как с помощью генной инженерии мышиные модели способствуют изучению всех этапов метастатического каскада, предоставляя мощные и клинически значимые модели, они ограничены в связи с низкими показателями метастазирования 38 печени.
Несколько моделей метастазирование обходят начальные шаги метастатического каскада включая распространение опухолевых клеток из первичной опухоли и intravasation. Эти модели позволяют расследование поздних стадий метастатического каскада, от транссудации к созданию опухолей на вторичных сайтов. INTracardiac модель инъекции обеспечивает выход опухолевых клеток в левый желудочек, который распределяет опухолевые клетки в кровеносную систему через аорту. Внутриутробная инъекции требует ультразвуковой визуализации руководствовались в месте инъекции или другие методы визуализации, такие как биолюминесценции люциферазы меченой клетки для подтверждения успешного инъекции. Инъекции опухолевых клеток с помощью левого желудочка , может привести к кости, мозга, легких, и / или метастазов в печени, среди других органов 44-48. Из-за метастазов полиорганной, эти мыши часто должны быть умерщвлены до развития явных признаков метастазов в печени, отрицая возможность полностью исследовать метастатического роста в печени. Альтернативный подход, который значительно минимизирует развитие нескольких площадок метастазирования является внутриселезеночное модель инъекции. Внутриселезеночное инъекции обеспечивает опухолевые клетки через селезеночной вены , которая соединяется с верхней брыжеечной вены , чтобы стать воротной вены 49,50. Животные могут быть проверены для outgrowth метастатических очагов в печени , так как образование метастазов в других местах редко, и , как результат, общее состояние здоровья животного поддерживается 49,50. Тем не менее, важно отметить , что внутриселезеночный модель требует спленэктомии , чтобы избежать селезеночной опухолей 49,50, процедура , которая влияет на иммунную функцию. Например, инфаркт ишемия реперфузии характеризуется инфильтрацией Ly6C + моноцитов подмножеств , которые исходят из селезенки и отвечают за фагоцитарной и протеолитической активности во время заживления ран после ишемии 51,52. С спленэктомии, происходит заметное сокращение популяции моноцитов , которые помогают в заживлении ран 52. Кроме того, спленэктомии было показано , чтобы уменьшить рост первичной опухоли и метастаз легкого в модели рака немелкоклеточного рака легкого, в частности , за счет снижения числа циркулирующих и внутри опухоли CCR2 + CD11b + Ly6C + моноцитов миелоID клетки 53. Кроме того, спленэктомия следующие внутриселезеночное инъекции раковых клеток толстой кишки приводит к снижению уровня противоопухолевых естественных клеток - киллеров в брыжеечных лимфатических узлов и повышенной метастаз печени 54. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что спленэктомия ставит под угрозу роль иммунной системы с последующими последствиями для метастатической судьбы клеток.
Воротной вене Инъекции Модель печени метастазами
Для исследования молочной железы метастазирования рака в печень в полностью иммунокомпетентных хозяина в условиях, когда мышей не подвергаются риску из-за метастазов полиорганной, была разработана модель инъекции воротной вены. Внутрипортальной модели для инъекций использовались ранее для изучения метастазов печени колоректальной 55,56 и меланому 16 клеточных линий; Здесь мы опишем применение внутрипортальной инъекции для моделирования сингенную молочной метастазов опухолевых клеток. Эта модель может быть использована для изученияпоздние стадии метастатического каскада, включая экстравазации клеток рака молочной железы и посевом, опухолевых клеток решения судьбы относительно смерти / пролиферации / дремоты и выроста в откровенных поражений. В этой модели сингенных молочной линии опухолевых клеток инъецируют через воротную вену иммунокомпетентных самок мышей линии BALB / C, способ , который обеспечивает опухолевые клетки , во - первых , и непосредственно в печень без удаления селезенки. Для разработки этой модели, использование четырех молочных линий опухолевых клеток, которые варьируются в их метастатической способности от низкого до высокого использовались: D2.OR, D2A1 и 4T1, и использовали D2A1 маркированный зеленого флуоресцентного белка (GFP-D2A1) до исследовать раннее время-очков после инъекции опухолевых клеток. 4T1 является весьма метастатическим клеточная линия происходит от 410.4 опухоли, спонтанно возникшей в ВОМЖМ + BALB / C самки мыши 36,37 и метастазирует в легкие, печень, мозг и кости из жировой ткани молочных желез первичных опухолей 39,57,58. Опухолевые клетки D2A1 WERе также первоначально получена от спонтанной опухоли молочной железы , возникающего в BALB / C хозяина после пересадки D2 гиперпластических альвеолярных клубеньковых клеток, и подтверждено, что метастатические из первичной опухоли в легких 59,60. D2.OR опухолевые клетки являются неметастатической сестра линии к D2A1 линии и, хотя они избегают первичной опухоли и прийти вторичных сайтов, они редко устанавливают отдаленные метастазы 60,61.
Кроме того, важно избегать использования широко используемых препаратов управления боли, включая нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) во время или после хирургической процедуры. НПВС имеют противоопухолевую активность в некоторых видов рака молочной железы 62-65, а некоторые классы НПВС увеличивают риск гепатотоксичности 66,67, потенциально ставя под угрозу исследование метастаза печени и метастатический печени нишу. Кроме того, исследования показывают, что НПВС оказывают непосредственное влияние на микросреду ткани, уменьшая про-метастатического добracellular матричные белки тенасцину-C 68 и фибриллярный коллаген 62,65. В качестве альтернативы, использование опиоидного производного, бупренорфин, был использован из - за его эффективности в управлении грызун боли 69 и из - за отсутствия доказательств , что опиоиды имеют противоопухолевую активность 70. Эта модель инъекции воротной вены была оптимизирована для небольших объемов инъекции 5 - 10 мкл, чтобы избежать ненужного повреждения печени. Модель была также оптимизирована для включения иглы с меньшим диаметром (≥ 32 калибра) и использования гемостатической марли сразу после инъекции, чтобы свести к минимуму потери крови во время процедуры. В отличие от этих оптимизированных параметров закачки, количество клеток должно быть определено на индивидуальной основе, на основе онкогенного потенциала клеточной линии. Тем не менее, начиная с ≤ 10000 клеток / инъекций для долгосрочных исследований рекомендуется. Для более коротких конечных точек (например, 24 ч после инъекции) значительно больше опухолевых клеток (например,1 х 10 5 - 1 × 10 6) , может быть использован , если оправдано. Таким образом, инъекции модель воротной вены подробно описаны здесь представляет собой полезный инструмент для изучения метастазов рака молочной железы в печень и обходит ряд ограничений других моделей метастазов в печени. Эта модель облегчает изучение опухолевых клеток экстравазации, посевом, ранние судьбы решений выживания, пролиферации и покоя, и метастатическим выроста в иммунокомпетентных мышиных хозяев.
Protocol
Все процедуры на животных в этой статье были рассмотрены и одобрены Oregon Health & Science University Институциональные уходу и использованию животных комитета.
1. Подготовка хирургической области и инструменты
- Приготовьте ножницы, пинцет и кровоостанавливающего автоклавированием при 124 ° С в течение 30 мин, 1 - 2 дня до проведения запланированных операций. Обеспечить доступ к автоклавного или стерильно постельных принадлежностей, клетки, и пищи для послеоперационного восстановления.
- Готовят асептический хирургическую область, предпочтительно в колпаке с ламинарным потоком.
- Протрите все поверхности хирургической области с 10% хлорной извести, в том числе грелку, источник света, анестезию НКТ и носового конуса, а также какой-либо другой части хирургического набора, которые будут находиться в непосредственной близости от хирургического вмешательства в то время как она выполняется ,
- В асептической хирургической области, место очищено грелку с Салфетка стерильная, источник света, анестезии и трубки, головная часть инсулина шприцы, 1 мл шприцы, бупивакаина, искусственные слезы, стерильный физиологический раствор, 2 х 2 "стерильные марлевые тампоны, 4 х 4" стерильной марли, кровоостанавливающее марли разрезают на 0,5 - 1 см 2 шт, ножницы, пинцеты, кровоостанавливающего, 4-0 викрил швами с тонкой игле, и 50 мл 2% хлоргексидина глюконата в качестве автоклавного контейнера.
- Убедитесь в том, что есть место в этом пространстве для подготовленных опухолевых клеток, хранящихся на льду.
- На скамейке, прилегающей к хирургической области, подготовить область восстановления со второй грелку и чистые клетки со стерильным постельных принадлежностей.
Примечание: Эта область может также дома такие предметы, как шарик стерилизатор.
2. Инъекции воротной вене
- Один час до запланированных инъекций, лечения BALB / с самок мышей в возрасте 8 - 15 недель с 100 мкл 0,015 мг / мл бупренорфина, подкожно, для лечения боли.
Примечание: Этот протокол инъекции может быть применен к любому штамму женской или мужской мыши в любом возрасте, с использованием соответствующихклеточные линии для изменений штамма. - Подготовка опухолевых клеток для инъекций, основанные на протоколах для линии клеток или опухоли эксплантов выбора. Проверьте все линии опухолевых клеток перед введением на наличие мышиных патогенов, чтобы уменьшить риск введения таких патогенных микроорганизмов в животных колонии.
- Для сингенных опухолевых клеточных линий BALB / C включая D2A1, D2.OR и опухолевых клеток 4Т1, оттаивание клеток в 10 см культуре ткани планшете за 3 дня до инъекции таким образом, что на следующий день клетки при ~ 90 - 100% сплошности.
- клеток после опухоль оттепели мыть клетки 1 день один раз с 1x фосфатным буферным раствором (PBS) и Trypsinize опухолевых клеток с использованием сливающийся 2 мл 0,05% трипсина при 37 ° С в течение 5 мин. Добавить 8 мл полной среды (DMEM высокий уровень глюкозы, 10% фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина, и 1x пенициллина / стрептомицина) и прохождение 1:10 в свежую 10-см чашку с 10 мл полной среды.
- В день инъекции, мыть клетки один раз с 1x PBS и тrypsinize, как описано выше.
- Ресуспендируют трипсином клетки в 8 мл полной среды, спина в течение 5 мин при 1500 XG, удалите СМИ и ресуспендируют в 5 мл 1x PBS.
- Граф клеток на гемоцитометра с использованием трипанового синего для оценки жизнеспособности. Ресуспендируют клетки для инъекций в 1X PBS в заранее определенной концентрации и объема.
Примечание: 5 - 10 мкл рекомендуется как меньшие объемы впрыска предотвратить ненужное повреждение печени. - Сохранить клетки на льду в течение всего срока инъекций. После завершения инъекции, возвращают образец клеток в лабораторию и место в культуре в полной среде в течение 1 дня, чтобы обеспечить жизнеспособность.
- Место мыши под анестезией с 2 - 2,5% изофлуран (2-хлор-2- (дифторметокси) -1,1,1-трифтор-этан) поставляется в кислороде. Поддерживать температуру тела с помощью грелки. Обеспечить полное обезболивание путем оценки для реакции на носок щепотку, а затем поддерживать anesthe2 в ООО - 2,5% изофлуран.
Примечание: Важно, чтобы контролировать животных частоту дыхания и регулировать изофлуран скорости потока соответственно в течение всей процедуры. - Поместите небольшое количество искусственных слез или ветеринаром мази на каждый глаз, чтобы избежать чрезмерного высыхания глаз во время хирургической процедуры.
- Поместите мышь в положении лежа на спине, на спине с живота подвергается.
- Удалить волосы на вентральной левой стороне грызуна от второго ребра пространства вплоть до паховой молочной железы сосок на 4 - м протиранием области с химической удаления волос. Дайте депиляторный сидеть в течение 1 - 2 мин , а затем полностью удалить с марлей и H 2 O. Этот шаг можно сделать 1 - 2 дня заранее , чтобы сэкономить время , если многочисленные операции планируются.
- Возьмите одну 2 х 2 "стерильной марлевой губки (смоченной в 2% Хлоргексидин) и протирать мышь на месте удаления волос. Стерилизовать все окружающее пространство, в том числе за хвост, чтобы свести к минимуму бактериальное продаминирование инструментов.
- Протрите место удаления волос и окрестностей вниз спиртовой подготовительную площадку.
- Повторите 2% хлоргексидин и алкоголь шаги еще раз и закончить с окончательным Хлоргексидин вытирать в общей сложности три 2% хлоргексидин и двух промываний спирт Prep колодки. Есть ли протирать такие окончательное хлоргексидина, что химическое вещество не капает вокруг хирургического участка, чтобы избежать попадания хлоргексидин на внутренние органы. Примечание: Применение больших количеств хлоргексидина и спирта на кожу и окружающие мех, может привести к существенному снижению температуры тела. Не протирайте избыточного объема во время этапов 2.7-2.9. Поддержание температуры тела с грелку.
- Использование стерильных перчаток и стерилизованного скальпель стерильным лезвием, сделать один 1-дюймовый разрез в коже между средним и сагиттальной плоскостях на левой стороне мыши, начиная чуть ниже ребер и заканчивая чуть выше плоскости четвертого паховых молочная железа сосков.
- Использование автоклавного или гранула стерилизованные ножницы и пинцет, сделать подобный 1-дюймовый разрез в брюшину. Избегайте резки в жировой ткани молочных желез и обеспечить, чтобы не порезать кишечник, печень, или диафрагму.
- Поместите 4 х 4 "марлевым тампоном, пропитанным стерильным физиологическим раствором на левой стороне мыши, где был сделан надрез, таким образом, что внутренние органы могут быть размещены на марлю и не вступают в контакт с окружающими участками кожи или хирургической области.
- Подготовка опухолевых клеток с помощью пипетки вверх и вниз несколько раз, как опухолевые клетки будут оседать в процессе подготовки мыши. Готовят 25 мкл съемную иглу шприца и 32 калибра иглу с опухолевыми клетками. Нажмите на шприц, пока опухолевые клетки не находятся на острие иглы и поршень находится в соответствующем объеме для инъекций; избежать инъекции пузырьков воздуха.
- Протрите наружную поверхность иглы со стерильным спирта площадку для удаления каких-либо внешних опухолевых клеток. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать уколов.
- Держите медианный SIDе разреза, в том числе кожи и брюшную подкладке, в сторону с пинцетом и использовать стерильный ватный тампон, чтобы аккуратно придерживая большие и маленькие кишок наружу, размещая их на стерильной марлей, смоченной в стерильном физиологическом растворе. Вытащите большие и малые кишечники, пока воротной вены не визуализируется.
- Накройте внутренние органы в солевом пропитанной марли для поддержания внутренней влаги и стерильность.
- Попросите помощника, а также носить стерильные перчатки, держите кишечник, завернутые в солевом пропитанной марли аккуратно из пути с помощью стерильного хлопка наконечником тампоном, чтобы полностью раскрыть воротной вены. Кроме того, может возникнуть необходимость использовать автоклавного кровоостанавливающего или пинцет, чтобы удерживать ткани в сторону от средней части разреза.
- Вставьте иглу, загруженной с опухолевыми клетками ~ 3 - 5 мм в портальную вену ~ 10 мм ниже печени под углом <5 ° к вене, с конической и цилиндрической лицевой стороной вверх. Медленно введите полный объем, содержащий опухолевые клетки. Разрешить крови течь мимо иглы чСвинец в течение нескольких секунд, чтобы избежать обратного потока опухолевых клеток из вены. Сведение к минимуму перемещения иглы в вену во время инъекции. Опять же, будьте осторожны, чтобы избежать уколов.
Примечание: Визуализация воротной вене делается без увеличения, однако стерео микроскоп может быть использован, если предпочтительнее. - Удалите иглу, одновременно помещая стерильного ватного наконечника аппликатора на вены с давлением. С помощник все еще держа кишок в сторону поместить одну часть 0,5 - 1 см 2 гемостатической марли над местом инъекции на вены.
Примечание: Гемостатическое порошок также пытался для этого шага в протоколе, но не был эффективен в предотвращении венозной потери крови после инъекции. - Держите кровоостанавливающее марлю в месте инъекции с давлением со стерильным ватным наконечником аппликатора в течение 5 мин.
- Оценка закрытие вены, осторожно поднимая кровоостанавливающее марлю, если марлевых прилипает к окружающей ткани, небольшое количество Sterilе солевой раствор может быть использован, чтобы впитать и поднимите марлю.
- Если потеря крови происходит в это время, поместите дополнительный кусок гемостаза марли на участке с давлением в течение еще 5 мин. Когда поток крови полностью прекратилось, удалите марлю с помощью мыши.
Примечание: Потеря крови во время хирургической процедуры должны быть тщательно оценены, и если общий допустимый объем потери крови или превышаются (на основе нормативных стандартных операционных процедур для плат организационного обзора следователя) мышь должна быть умерщвлены в то время как под наркозом сердечной перфузии. - После того, как место инъекции считается неповрежденным, без крови, оставляя место инъекции, поместите внутренние органы аккуратно обратно в брюшную полость.
- Шовный брюшную подкладке, а затем кожу стерильной 4-0 викрил швом и тонкой игле, используя простой непрерывный или прерывистый шаблон шовного. Как правило, закрытие надрез требует 10-15 наложения швов.
- Вводят 100 мкл BUPIvacaine (5 мг / мл) вдоль участка разреза для местного лечения боли с использованием инсулиновый шприц. Вводят 0,5 мл стерильного физиологического раствора, подкожно с помощью шприца на 1 мл с 26-го калибра иглы для гидратации. Хирургии занять 15 - 25 минут, чтобы закончить.
- Для поддержания стерильных условий на протяжении операции, убедитесь, что все инструменты и материалы, вступая в контакт с мышью, в том числе в перчатке, очищаются надлежащим образом перед контактом. Там, где возможно использование стерильных материалов и перчатки, или минимально использовать 70% раствор этанола или 10% раствор хлорной извести для очистки.
- Если несколько операций запланированы на одной сессии римейк начальную хирургическую область со свежей стерильной драпировки, инсулиновые шприцы, 1 мл шприцы, стерильный физиологический раствор, 2 х 2 "стерильный марлевые тампоны, 4 х 4" стерильной марли, кровоостанавливающее марли нарезать 0,5 - 1 см 2 шт, 4-0 викрил швы с коническим иглой и 2% хлоргексидина. Бусина-стерилизовать ножницы, пинцет и кровоостанавливающего между ними операций и позволяютдля адекватного охлаждения перед повторным использованием.
3. Восстановление, мониторинг здоровья, грызунов и оконечная Анализы
- После того, как хирургическая процедура будет завершена, сохранить мышей на грелку для восстановления в постельных свободных, чистых клетках в течение как минимум 20 мин. Мыши, как правило, берут 2 - 4 мин, чтобы проснуться от наркоза.
- Не возвращать животное, которое перенес операцию на сожительство с другими животными, пока она полностью не оправилась от наркоза. Не оставляйте животное без присмотра приходя в сознание, и контролировать, пока животное не восстановила способность поддерживать себя в грудины лежачее.
- Дайте мышам 0,05 - 0,1 мг / кг бупренорфина для лечения боли каждые 6-12 ч после операции, на срок до 72 часов.
- Проверьте швы ежедневно, чтобы гарантировать, что они остаются нетронутыми в процессе заживления. В случае, когда шовный материал развязались, поместите мышь под наркозом, удалите оставшиеся швы, и заменить. В случае инфекции или Inflammвания консультации сотрудников ветеринара.
Примечание: Инфекция или воспаление не сталкивался с этим протоколом. - Для исследований метастазирования, выполнять ежедневные проверки здоровья до внешних признаков метастатического заболевания не наблюдаются в том числе, но не ограничиваясь ими:> 10% веса потери / усиления, scruffiness, потеря внимания к обстановке, брюшные отеки / асцит, светлые глаза и уши, или сутулой положение.
Примечание: Ежедневные проверки состояния здоровья особенно важны при разработке модели для использования с новой клеточной линии или концентрации клеток, пока график метастазирования не очень хорошо понял. - В исследовании конечной точки, усыпить мышей CO 2 ингаляции с последующим смещением шейных позвонков.
Примечание: Альтернативные методы эвтаназии, утвержденных комитетом по надзору следователей могут быть использованы, в том числе с перфузией 1x PBS в то время как под наркозом. Кровоснабжение печени осуществляется cannulating воротной вены, отрезая нижнюю полую вену, и толкая 1x PBS-гогрубая сосудистая сеть печени со скоростью 4 мл / мин в течение 1 - 2 мин, чтобы удалить циркулирующей крови и лейкоциты.
Примечание: В зависимости от конечной точки для исследования, линии клеток и используемой концентрации, оверт метастаз печени может быть или может не быть очевидными при аутопсии. Микрометастатической повреждения могут быть выявлены с гистологическим анализом печени. Endpoints будет варьироваться в зависимости от дизайна исследования. - Экстракт печени с ножницами и пинцетом сначала удалением желчного пузыря, а затем вырезать через нижнюю полую вену превосходит печень. Вырезать через полую вену, воротной вены и печеночной артерии уступает печени.
- Удалите всю печень мягко и промыть 5x в 1x PBS.
- Отделите печень в влево, вправо, срединных и хвостатых долей.
- Формалин затруднительное печени в 10% нейтральном забуференном формалине в течение 48 часов при встряхивании при комнатной температуре. Процесс тканей с помощью ряда спиртов в увеличении концентрации и ксилол; парафин встраивать неподвижную ткань 71 Примечание: В качестве альтернативы, печень может быть быстро замораживают путем размещения ткани в cryomold с оптимальной температурой резания (ОКТ) формулы и замораживание на гранул сухого льда, погруженных в 95% этаноле.
- Используя микротом, срезанные в блок тканей парафином таким образом, что размер матч головки ткани выявлено.
- Вырезать пять 4-микронных серийных срезов, это представляет собой первый уровень для анализа.
- Разрезать 250 микрон ткани, выбросить эти разделы в отходах.
- В 250 микрон сократить второй уровень пяти 4-микронных серийных срезах.
- Повторите по мере необходимости для раздела через весь печени. Гематоксилином и эозином пятно первая часть каждого уровня для оценки для метастазирования 72.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для быстро замораживают ткани использовать криостат вырезать секции.
Примечание: Обнаружение микрометастатической болезни потребуется специальное окрашивание опухолевых клеток.
- Удалить мышей из исследования, если есть рост опухоли в разрез сидетье, так как это указывает на утечку опухолевых клеток в брюшную полость после инъекции.
Примечание: Эта проблема не наблюдается.
Representative Results
Модель инъекции воротной вены, в которых опухолевые клетки доставляются непосредственно в печень с помощью хирургической процедуры, позволяет инъекции опухолевых клеток в портальную вену. Под антисептических условиях, в наркозом мыши, а ~ 1-дюймовый хирургический надрез на левой стороне мыши между средним и сагиттальной плоскостях, начиная чуть выше плоскости четвертого паховых молочных желез соском железы и заканчивая чуть ниже ребер , Большие и малые кишечники осторожно протягивают через разрез , чтобы обеспечить визуализацию воротной вены (рис 1А). Точная анатомический идентификация воротной вены и успешной инъекции внутри портала может быть подтверждена путем практиковать протокол впрыска тушью или аналогичным красителем. Правильное инъекции через воротную вену приведет к чернилам , они будут немедленно и специально доставлены в печень, и не приведет к тушью распространения в легкие (FIGURe 1В). Кроме того, с помощью D2A1 молочной железы мышей опухолевые клетки , маркированные с GFP, рассеивание опухолевых клеток по всему печени проявляется на девяносто минут после инъекции, подтвердив портальной вены доставки инъекционного в печень (рис 1C). При большем увеличении становится очевидным , что через 90 мин после инъекции опухолевых клеток обнаруживаются в синусоиды, а также в пределах паренхимы печени в непосредственной близости от портальных триад, где воротной вены кровь поступает в печень (фиг.1С). Эти данные свидетельствуют о том, что активная ячейка опухоли кровоизлияние происходит в 90 мин после инъекции опухолевых клеток. Взятые вместе, эти данные подтверждают, что модель инъекции воротной вены доставляет объем впрыска непосредственно в печень, с использованием чернил или опухолевых клеток, диспергированных в печени и без заметного переноса объема впрыска в легкие.
Для оценки устойчивости вены модели впрыска портала, три Separсъела сингенных молочной железы мышей линии опухолевых клеток были протестированы в взрослых самок мышей линии BALB / C. Эти опухоли молочной железы линии были выбраны на основе их характеризующейся поведения в молочных моделях жировой ткани и включают в себя весьма агрессивно и метастатического 4Т1 клеточную линию, тем менее агрессивную метастатического D2A1 линию, а также низкий / неметастатической D2.OR линии 37,61,73 , 74. 2000 и 10000 клеток на инъекцию были протестированы без каких-либо заметных различий во времени до развития явных признаков метастазирования с этими концентрациями низких клеток. Для этих исследований суррогатные маркеры метастазирования были использованы такие, как отсутствие груминга, бледность, и потеря веса, чтобы оправдать аутопсии, на которых наличие или отсутствие метастазов в печени были подтверждены путем визуальной оценки печени и других органов для подтверждения доставки внутри портала , Эти данные подтверждают предыдущие сообщения о том, что клеточные линии 4Т1 и D2A1 представляют более агрессивные опухоли молочной железы линии, так как наблюдаются короче метастазирование свободного выживаемость по сравнению с мышей, которым вводилис менее агрессивной D2.OR линии (фиг.2А). Мышей , которым вводили 4T1 или D2A1 опухолевые клетки развитом откровенного метастазов в печени по ~ 30 - 40 дней после инъекции, а некоторые развитые метастазирование уже через 18 дней после инъекции (рис 2А), в то время как только одна мышь вводили D2.OR клетки имели развитая откровенное метастаз печени к концу исследования, которое было 60 - 65 дней после инъекции клеток опухоли. Метастазы были впоследствии подтверждены секционирования через печень в уровне 250 мкм и анализ гематоксилином и эозином (Н & Е) (окрашенные срезы Рисунок 2B-D).
В дополнение к обнаружению откровенных метастатических очагов в печени мышей, модель воротной вены также может быть использован для изучения ранних событий в метастатического каскада, включая обнаружение одиночных клеток / кластеров клеток после транссудации и формирования микро-метастатических поражений. Мультиплекс иммунофлюоресценции окрашивания был использовандля обнаружения 4T1, D2A1 и D2.OR молочной опухолевых клеток в печени, когда они присутствуют в виде отдельных клеток или микроорганизмов метастатических поражений, а Н & Е не является достаточным, чтобы подтвердить наличие небольших поражений. На фиг.3А показана репрезентативная BALB / C печени мышей с мнимого микрометастатической очагов опухолевых клеток D2A1 , которые являются положительными для эпителиального кератина CK18, отрицательным для маркера CD45 пан-иммунной, так и отрицательные для гепатоцитов маркера Heppar-1. Гепатоцитов также пятно положительным для CK18, что требует использования Heppar-1 в этом окрашиванием панели. Важно отметить, что эпителий желчных протоков и печени клетки - предшественники окрасить положительно для CK18, требует тщательного дискриминации между опухолевыми клетками и желчных протоков, особенно при оценке перипортальных регионов (рис 3А). Альтернатива мультиплекс иммунофлюоресценции для идентификации отдельных клеток и распространяемые микрометастатической фокусов использовать сингенных молочных желез опухолевых линий с меткой расширенной зеленого флуоресцентногобелок (EGFP) и / или люциферазы и выполнять IHC для тега (Рисунок 1С). Из - за иммуногенности EGFP, люциферазы, а также другие белки, необходимо использовать модели мыши, которые толеризованной к этим белкам, например, нового иммунокомпетентных "сияющего головы" мыши , которые экспрессируют EGFP и люциферазы в передней доле гипофиза 75. Для идентификации macrometastatic поражений непомеченным сингенных линий , таких как линии опухоли D2A1, мультиплекс иммунофлюоресценции CK18 / Heppar-1 / CD45 идеально (рис 3B).
Рисунок 1: воротной вене Инъекции Обеспечивает опухолевых клеток непосредственно в печень. A) инъекции портальной вены; надрез делается между средним и левым сагиттальной плоскостях, сверху плоскостью четвертого паховых молочной железы сосок и заканчивая чуть ниже Р.И.б клетка. Б) BALB / C печени с PBS инъекций (слева). После инъекции чернил Индии через портальную вену, печень (средний), но не легких (справа) принимает чернила. С) Представительные шлифа изображения D2A1 молочной железы мыши опухолевых клеток , помеченных GFP в / с печени мышей Balb через 90 мин после инъекции 1 × 10 6 опухолевых клеток через воротную вену. Печени формалином парафиновых, разрезали и окрашивали анти-GFP антител для обнаружения опухолевых клеток. Верхняя панель показывает темно-коричневые запятнанные опухолевые клетки (стрелки), рассеянных по всему печени, звездочка обозначает неспецифическое окрашивание гепатоцитов вокруг центральных вен; Шкала бар = 300 мкм. Нижние панели показывают репрезентативные изображения опухолевых клеток через 90 мин после инъекции по-прежнему тесно связаны с сосудистой сетью; Шкала бар = 50 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: разрастание опухоли молочной железы мышей линий клеток в печени После воротной вене инъекций. A) Каплана-Мейера кривая , показывающая Безметастатическая уровень выживаемости мышей , которым вводили 2,000-10,000 4T1, D2A1 или опухоли молочной железы мыши D2.OR клеток. Мышам вводили опухолевые клетки и мониторинг на наличие признаков метастазирования включая отсутствие груминга, светлые глаза, и изменения веса. Метастазы было подтверждено во время аутопсии и H & E на гистологических срезах печени. N = 2 4T1 2000 клеток; 2 4T1 10000 клеток. N = 2 D2A1 2000 клеток; 3 D2A1 10000 клеток. N = 3 D2.OR 2000 клеток; 3 D2.OR 10000 клеток. Представитель H & E изображения B) 4Т1 поражения на 21 -й день после инъекции 10000 клеток, C) D2A1 поражений на 26 -й день после инъекции 10000 опухолевых клеток, и D) D2.OR поражения в59 дней после инъекции 10000 клеток; масштабные линейки = 75 мкм. Аналогичные повреждения наблюдаются при впрыскивали 2000 4T1 или D2A1 опухолевых клеток. Нет поражений не были обнаружены с 2000 D2.OR клеток. Никаких признаков метастазирования в других органах или в хирургическом месте разреза не было видно в любой мыши на этих исследованиях. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Обнаружение одиночных клеток и метастатических поражениях в печени мышей с использованием Multiplex иммунофлюоресценции. А) Представитель мультиплекс иммунофлюоресценции опухолевых клеток D2A1 в / с печени мышей Balb через 90 мин после инъекции с использованием модели инъекции воротной вены. Окрашивание проводили с помощью мультиплексного набора. Слева направо показывает DAPI; CD45 отметить лейкоциты; Heppar-1 омрачатьК гепатоциты; и CK18 отметить опухолевые клетки, гепатоциты и эпителий желчных протоков. Merged изображение показывает предполагаемую кластер CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 опухолевых клеток , тесно связанных с порталом триады. Стрелка = опухолевые клетки D2A1, звездочка = эпителий желчных протоков; Шкала бар = 25 мкм. Б) Представитель откровенное D2A1 метастатического поражения с использованием той же панели окрашивания , как и в A. опухолевые клетки являются CK18 + , тогда как соседние гепатоциты CK18 + Heppar-1 +; Шкала бар = 25 мкм. Изображения были захвачены на микроскоп с 20 х 0,8, 40 х 1,3 и 60 х 1.4 Цели и ПЗС-камеры, с помощью программного обеспечения микроскопа. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Discussion
Balb / с портала мыши модель инъекции вены позволяет исследовать поражений молочной железы в печени при отсутствии искажающего метастазирования полиорганной и в полностью иммунокомпетентных хозяина. Наш протокол является продвижение ранее опубликованных хирургических процедур , которые позволяют доступ к воротной вены для инъекции опухолевых клеток непосредственно в печень 16,55,56. Один продвижение мы сделали это , чтобы значительно уменьшить число инжектированных опухолевых клеток от ≥ 1 × 10 5 клеток / нагнетательных 16,55,56 вниз до ≤ 10000 опухолевых клеток / инъекцию. Мы также расширили модель для изучения метастазов рака молочной железы в печень. Используя этот протокол, два молочных линий раковых клеток с известными метастатическим потенциалом развиваются метастазы в печень с короткой задержкой, чем более покоящейся молочной линии опухолевых клеток. Кроме того, в ранние моменты времени, опухолевые клетки распределены по всей паренхимы печени в виде одиночных или небольших групп одного CELLS после инъекции опухолевых клеток. Модель готова для решения вопросов метастатической эффективности, включая клетки экстравазации опухоли, выживаемости клеток, покоем и пролиферации - все фенотипы, которые вносят вклад в развитие микро-метастатического и откровенного метастазами в печени.
Важно учитывать множество аспектов протокола инъекции портальной вены до начала исследования. Тщательно решая на клеточных линиях, концентрации клеток, общего числа клеток, так и для конечных точек интереса на основе небольших разведочных исследований настоятельно рекомендуется. Кроме того, использование иммунокомпетентных хостов и сингенных клеточных линий, имеет огромное значение для понимания взаимодействия хост-опухолевых клеток. Недавно разработанный "светящегося голова" мышь , которая выражает EGFP и люциферазы из передней доли гипофиза является важным инструментом для устранения ответов хозяина на экзогенный EGFP и люциферазы, белки часто используются , чтобы пометить опухоли молочной железы линии 75
Важно отметить, что модель инъекции воротной вены не копирует полный метастатического каскада, но ограничивается изучением опухолевых клеток транссудации, опухолевая клетка-ниша взаимодействий следующий транссудации и опухолевого роста. Модели, которые точно копируют полную метастатического каскада в печень, как это происходит у больных, срочно необходимы. Дополнительное ограничение модели инъекционного воротной вены является то , что она путает влияния операции на хозяина, с заживлением раны, воздействующие прогрессирование заболевания 76,77.
Модель инъекции воротной вены представляет собой улучшение на другой инъекциимодели для изучения метастазов в печени, в том числе внутрисердечной и внутриселезеночное моделей. В частности, модель инъекции воротной вены позволяет исследовать более широкого диапазона прогрессирования заболевания, чем модель внутрисердечного, которая часто ограничена сопутствующим метастазами в других тканях. Кроме того, модель портальной вены не осложнена удаление селезенки, как это делается в внутриселезеночный модели.
Модель инъекции воротной вены может оказаться полезным инструментом для изучения метастазов в печени в целом. метастаз печени является наиболее частым местом метастазирования в аденокарциномы в целом, с особенно высокими показателями в поджелудочной железы (85% метастазов в печень), толстой и прямой кишки аденокарциномы (> 70%), а также желудка и пищевода (> 30 %) 1. Хотя спонтанные и Ортотопическая первичные модели опухоли поджелудочной железы и толстой кишки аденокарциномы более легко метастазировать в печень 78,79, воротной вены модель инъекции может прове полезно для понимания метастатического процесса этих видов рака, как контролируемые поставки опухолевых клеток позволяет биохимические, молекулярные и гистологические оценки в определенное время после прибытия опухолевых клеток. Таким образом, портал модель инъекции вену представляет собой важное улучшение по сравнению имеющихся моделей метастазов в печень рака молочной железы, а также могут быть применены к области метастазов в печени в целом.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
References
- Hess, K. R., et al.
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Johnson, R. L., Fleet, J. C.
