Abstract
Bröstcancer är den vanligaste orsaken till cancerrelaterad dödlighet hos kvinnor över hela världen. Levermetastaser är involverad i uppemot 30% av fallen med bröstcancer metastaser, och resulterar i dåliga resultat med medianöverlevnadsgrad av endast 4,8-15 månader. Nuvarande gnagarmodeller av bröstcancermetastaser, inklusive primär tumörcell xenograft och spontana tumörmodeller, sällan metastaserar till levern. Intrakardiell och mjälten injektion modeller resulterar i levermetastaser, men dessa modeller kan förväxlas med samtidig sekundär plats metastaser, eller genom nedsatt immunförsvar på grund av avlägsnande av mjälten för att undvika tumörtillväxt vid injektionsstället. Att ta itu med behovet av förbättrade levermetastaser modeller, en mus portådern injektion metod som levererar tumörceller först och direkt till levern utvecklades. Denna modell ger tumörceller till levern utan komplikationer av samtidiga metastaser i andra organ eller borttagande av mjälten. optimized portvenen protokoll utnyttjar små injektionsvolymer på 5-10 l, ≥ 32 gauge nålar och hemostatisk gasväv på injektionsstället för att kontrollera för blodförlust. Portvenen injektion tillvägagångssätt i Balb / c honmöss med användning av tre syngena brösttumörlinjer av varierande metastatisk potential testades; hög metastatisk 4T1 celler, måttlig metastatiska D2A1 celler och låg metastatiska D2.OR celler. Koncentrationerna av ≤ 10.000 celler / injektion resulterar i en fördröjning av ~ 20 - 40 dagar för utveckling av levermetastaser med högre metastaserande 4T1 och D2A1 linjer, och> 55 dagar för mindre aggressiv D2.OR linje. Denna modell är ett viktigt verktyg för att studera bröstcancer metastaser till levern, och kan tillämpas på andra cancerformer som ofta metastasera till levern, inklusive kolorektal och pankreas adenokarcinom.
Introduction
Bröstcancer metastas till levern
Levern är en vanlig plats för bröstcancer metastaser, tillsammans med ben och lunga 3/1. Levermetastaser hos bröstcancerpatienter är en oberoende prognostisk faktor för mycket dåliga resultat 4,5, som medianöverlevnad av bröstcancerpatienter med levermetastaser varierar från 4,8 till 15 månader 6-9. Däremot bröstcancerpatienter med lung- eller skelettmetastaser har medianöverlevnadsgrad av 9 till 27,4 månader 8,9 och 16,3 till 56 månader 8,10-12 respektive. Metastas är en flerstegsprocess, som kallas den metastatiska kaskaden, som börjar med tumörcellspridning i den primära tumören och slutar med patientens dödlighet på grund av sådd och utväxt av cirkulerande tumörceller inom en avlägsen organ 13-15. Gnagarmodeller av metastaser har visat att den metastatiska kaskaden är anmärkningsvärt ineffektivt, med endast 0,02 till 10%av cirkulerande tumörceller upprättande overt metastas 16,17. En stor flaskhals av metastaserande ineffektivitet dikteras av de unika vävnadsmikromiljöer på sekundära platser, som kallas metastatiska nischer 18, belyser vikten av att förstå platsspecifika metastaser. Den metastatiska nisch är unik till stället för återkommande, och är, delvis, som kännetecknas av avsättning av distinkta extracellulära matrisproteiner 19,20, infiltration av olika immuncellpopulationer 21-23, och förändrad vävnadshomeostas inklusive dysreglerad produktion av talrika cytokiner, kemokiner och tillväxtfaktorer 15,18,24,25. Således föregår en förståelse för vävnadsspecifika metastaserad nisch en förståelse för hur man riktar metastaserad sjukdom. Men robusta modeller av levermetastaser saknas. Vidare kommer förbättrade modeller av levermetastaser vara avgörande för att identifiera nya mål och effektiva behandlingar för bröstcancerpatienter with levermetastaser.
Etablerade modeller för att studera bröstcancer metastasering till levern
För närvarande tillgängliga modeller för att studera bröstcancer metastaser till levern innefattar humana cancercell xenotransplantat i nedsatt immunförsvar möss. Dessa modeller använder vanligtvis väl studerade humana bröstcancercellinjer såsom MCF-7 och MDA-MB-231 och naken, Rag1 - / -, eller SCID nedsatt immunförsvar murina värdar 26-29. Xenograft-modeller ger fördelen att involvera människor som härrör cancercellinjer, men med tanke på den senaste tidens appreciering för immunceller i metastaser 30-32 och i terapeutiska motstånd 33-35, är studiet av metastaser i en helt immun kompetent värd avgörande. Modeller för att studera bröstcancer metastas till levern i immunkompetenta värdar innefattar orthotopic injektion av syngena tumörceller (t.ex. 4T1 och D2A1 cellinjer) in i bröstfettkudden, med eller utan kirurgiskresektion av primärtumören och efterföljande utvärdering av metastaser 36-38. Notera, är graden av levermetastaser från orthotopic transplantation modeller mycket låg eller obefintlig jämfört med andra metastatiska platser såsom lunga 39,40, eller inträffar efter lungmetastaser är etablerad, vilket komplicerar studie av leverspecifika metastaser 37,39 .
Tumör explantat från spontana genetiskt manipulerade bröstcancer modeller kan återinföras i bröstfettkuddarna hos naiva värdar som syngena tumörceller. Till exempel, har nyligen rapporterat att spontana tumörer från K14 Cre ECAD f / f P53 F / F möss, vilken modell invasiv lobulär bröstcancer, utveckla tumörer när ortotopiskt injiceras i vildtyp värdar. Efter kirurgisk resektion av dessa tumörer när de når 15 mm 2, fortskred 18% av mössen till levermetastaser 40,41. Ett tredje sätt att modellera levermetastaser Återvinnarespontan metastas i genetiskt modifierade möss. Hittills rapporter om spontana musmodeller av bröstcancer metastaser som lätt sprider sig till levern är ovanligt. Undantag inkluderar H19-IGF2, p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre och K14 Cre ECAD f / f P53 f / f genetiskt modifierade musmodeller, där levermetastaser utvecklas i en låg andel av möss 38,41- 43. Således, medan genetiskt manipulerade musmodeller underlätta studier av alla stadier av den metastatiska kaskaden, som ger kraftfulla och kliniskt relevanta modeller, är de begränsade på grund av låga hastigheter av levermetastaser 38.
Flera metastas modeller förbi de första stegen i metastaserande kaskad inklusive spridning av tumörceller från den primära tumören och intravasering. Dessa modeller tillåter utredning de senare stegen i metastaserande kaskad, från extravasation etablering av tumörer på sekundära platser. intracardiac injektion modell levererar tumörceller i vänster kammare, som distribuerar tumörceller i cirkulationssystemet via aorta. Intrakardiell injektion kräver ultraljud guidad avbildning av injektionsstället eller andra avbildningsmetoder såsom bioluminiscens av luciferas taggade celler för att bekräfta lyckad injektion. Tumörcellinjektion via den vänstra ventrikeln kan resultera i ben, hjärna, lunga, och / eller levermetastaser, bland andra organ 44-48. På grund av metastaser flera organ dessa möss behöver ofta avlivas före utveckling av öppen levermetastaser, motverkar möjligheten att fullt ut undersöka metastatisk tillväxt i levern. Ett alternativt tillvägagångssätt som väsentligt minskar utvecklingen av multi-site metastaser är mjälten injektionen modellen. Mjälten injektion levererar tumörceller via mjälten ven som går med den överlägsna tarmkäxvenen att bli portådern 49,50. Djur kan övervakas för outgrowth av metastatiska lesioner i levern eftersom bildningen av metastaser på andra platser är sällsynt, och som ett resultat, är djuret allmänna hälsa bibehålls 49,50. Det är emellertid viktigt att notera att den i mjälten modellen kräver splenektomi för att undvika från mjälte tumörer 49,50, ett förfarande som påverkar immunförsvaret. Till exempel är myokardischemi reperfusionsskada som kännetecknas av infiltration av Ly6C + monocyt delmängder som härrör från mjälte och är ansvariga för fagocytiska och proteolytisk aktivitet under sårläkning efter ischemi 51,52. Med splenektomi, det finns en observerad reduktion i monocyt populationer som bistå vid sårläkningen 52. Vidare har splenektomi visats minska primärtumörtillväxt och lungmetastaser i en icke-småcellig lungcancer modell, särskilt genom en minskning av antalet cirkulerande och inom tumör CCR2 + CD11b + Ly6C + monocytisk Myelosuppressionid cellerna 53. Dessutom, splenektomi efter mjälten injektion av koloncancerceller resulterade i minskade nivåer av anti-tumör naturliga mördarceller i kröslymfknutor och förhöjda levermetastaser 54. Sammanfattningsvis tyder dessa fynd att splenektomi äventyrar immunsystemets roll med efterföljande konsekvenser för metastaserande cell öde.
Portvenen Injektion Modell av levermetastaser
För att undersöka bröstcancer metastaser till levern i en helt immun kompetent värd, under förhållanden där möss inte äventyras på grund av metastaser flera organ var en portådern injektion modell som utvecklats. Intraportal injektion modeller har använts tidigare för att studera levermetastaser av kolorektal 55,56 och melanom 16 cellinjer; Här beskriver vi tillämpning av intraportal injektion för att modellera syngena brösttumörcellmetastaser. Denna modell kan användas för att studerade senare stadierna av metastaserande kaskad inklusive bröstcancercellinje extravasering och sådd, tumörcell öde beslut om död / spridning / dvala, och utväxt i uppenbara skador. I denna modell är syngena brösttumörcellinjer injiceras via portådern av immunkompetenta Balb / c-möss av honkön, en metod som ger tumörceller först och direkt till levern utan avlägsnande av mjälten. Att utveckla denna modell, användning av fyra brösttumörcellinjer som sträcker sig i metastaserad kapacitet från låg till hög användes: D2.OR, D2A1 och 4T1, och har anställt D2A1 märkt med grönt fluorescerande protein (D2A1-GFP) till undersöka tidigt tidpunkter efter tumörcellinjektion. 4T1 är en mycket metastatisk cellinje härledd från 410,4 tumör som spontant uppkom i en MMTV + Balb / c-mus av honkön 36,37 och metastasizes till lunga, lever, hjärna och ben från juverfett pad primära tumörer 39,57,58. D2A1 tumörceller were också ursprungligen härledd från en spontan brösttumör som härrör från en Balb / c-värd efter transplantation av D2 hyperplastiska alveolära knuta celler, och bekräftas vara metastatisk från den primära tumören till lungan 59,60. D2.OR tumörceller är en icke-metastatisk syster linje till D2A1 linjen och, även om de fly den primära tumören och anländer till sekundära platser, de sällan upprätta fjärrmetastaser 60,61.
Dessutom är det viktigt att undvika användning av vanligen använda smärtlindring läkemedel inklusive icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID) under eller efter den kirurgiska proceduren. NSAID har antitumöraktivitet i vissa bröstcancer 62-65, och vissa klasser av NSAID öka risken för levertoxicitet 66,67, potentiellt äventyra studiet av levermetastaser och levermetastaserande nisch. Vidare studier tyder på att NSAID direkt påverka vävnadsmikro, minska pro-metastaser extracellular matrixproteiner tenascin-C 68 och fibrillärt kollagen 62,65. Alternativt, användning av en opioid-derivat, buprenorfin, användes på grund av dess effekt i gnagare smärtbehandling 69 och på grund av bristen på bevis att opioider har anti-tumöraktivitet 70. Denna portal ven injektion modell optimerad för mindre injektionsvolymer på 5 - 10 ^ för att undvika onödiga skador på levern. Modellen har också optimerats för att inkludera nålar med mindre diameter (≥ 32 gauge) och användning av BLODS gasväv omedelbart efter injektion för att minimera blodförlust under förfarandet. I motsats till dessa optimerade injektion parametrar, bör antalet celler bestämmas på individuell basis, baserat på tumörframkallande potential cellinje. Men, med början på ≤ 10000 celler / injektion för långtidsstudier rekommenderas. För kortare endpoints (t.ex. 24 timmar efter injektion) betydligt fler tumörceller (t.ex.,1 x 05-01 oktober x 10 6) kan användas om det är befogat. Sammanfattningsvis, portvenen injektions modell beskrivs här utgör ett användbart verktyg för att studera bröstcancer metastaser till levern och kringgår ett antal begränsningar av andra levermetastaser modeller. Denna modell möjliggör studier av tumörcell extravasering, sådd, tidig öde beslut överlevnad, proliferation och dvala och metastaserande utväxt i immunkompetenta murina värdar.
Protocol
Alla djurförsök i denna artikel har granskats och godkänts av Oregon Health & Science University Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Beredning av operationsområdet och instrument
- Förbered sax, pincett och hemostat genom autoklavering vid 124 ° C i 30 min, 1 - 2 dagar före den planerade operationer. Säkerställa tillgång till autoklaveras eller steril sängkläder, burar, och mat för postoperativ återhämtning.
- Förbereda en aseptisk kirurgiska området, företrädesvis i ett dragskåp med laminärt flöde.
- Torka ned alla ytor hos det kirurgiska området med 10% blekmedel, inklusive värmedynan, ljuskälla, anestesi slangar och noskonen, och varje annan del av det kirurgiska svit som kommer att vara i nära anslutning till det kirurgiska förfarandet medan den håller på att utföras .
- I den aseptiska operationsområdet, placera den rengjorda värmedyna med steril duk, ljuskälla, anestesi slangar och noskon, insulinsprutor, 1 ml sprutor, bupivakain, artificiella tårar, steril saltlösning, 2 x 2 "steril gasbinda svampar, 4 x 4" steril gasbinda, BLODS gasväv skuren i 0,5-1 cm 2 st, sax, pincett, hemostat, 4-0 Vicryl suturer med avsmalnande nål, och 50 ml 2% klorhexidinglukonat i en autoklaverad behållare.
- Se till att det finns utrymme i detta utrymme för beredda tumörceller som lagras på is.
- På bänken intill operationsområdet, förbereder återställningsområdet med en andra värmedyna och rena burar med steril sängkläder.
OBS: Detta område kan också hus poster såsom en pärla autoklav.
2. Portal sveninjektion
- En timme före den planerade injektioner behandla Balb / c honmöss i åldrarna 8 - 15 veckor med 100 pl av 0,015 mg / ml buprenorfin, subkutant, för smärtlindring.
OBS: Detta injektionsprotokoll kan tillämpas på vilken stam som helst av kvinnlig eller manlig mus vid vilken ålder som helst, med hjälp av lämpligacellinjer för förändringar i stammen. - Förbered tumörcellerna för injektion baserad på protokoll för cellinje eller tumör explantat val. Testa alla tumörcellinjer före administrering med avseende på förekomst av murina patogener för att minska risken för att sådana patogener i djuret koloni.
- För syngena Balb / c-tumörcellinjer inkluderande D2A1, D2.OR, och 4T1-tumörceller, tö celler in i en 10 cm vävnadsodlingsplatta 3 dagar före injektion så att följande dag cellerna är vid ~ 90-100% konfluens.
- En dag efter tumörcells tö tvätta cellerna en gång med 1 x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och trypsinize de konfluenta tumörceller med användning av 2 ml av 0,05% trypsin vid 37 ° C under 5 min. Lägga 8 ml komplett medium (DMEM hög glukoshalt, 10% fetalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, och 1 x penicillin / streptomycin) och passage 1:10 in i en färsk 10 cm skålen med 10 ml komplett medium.
- På dagen för injektionerna, tvätta cellerna en gång med 1x PBS och trypsinize såsom beskrivits ovan.
- Resuspendera trypsiniserade celler i 8 ml fullständigt medium, snurra under 5 minuter vid 1500 xg, ta bort media och återsuspendera i 5 ml 1x PBS.
- Räkna cellerna på en hemocytometer med användning av trypanblått uteslutning för bedömning livskraft. Resuspendera celler för injektion i 1x PBS vid en förutbestämd koncentration och volym.
OBS: 5-10 ^ il rekommenderas som mindre injektionsvolymer förhindra onödig skada på levern. - Håll celler på is under hela injektioner. Efter slutförandet av injektioner, returnera ett prov av celler till laboratoriet och placera i odling i fullständigt medium under 1 dag för att säkerställa livsduglighet.
- Placera musen under anestesi med 2-2,5% isofluran (2-klor-2- (difluormetoxi) -1,1,1-trifluoro-etan) levereras i syre. Upprätthålla kroppstemperaturen med hjälp av värmedyna. Säkerställa fullständig anesthetization genom att bedöma om en reaktion på en tå nypa, och sedan behålla anestesisia på 2-2,5% isofluran.
OBS: Det är viktigt att följa djuren andningsfrekvens och justera isofluran flöde i enlighet med hela förfarandet. - Placera en liten mängd av artificiella tårar eller veterinär salva över varje öga för att undvika överdriven torkning av ögonen under den kirurgiska proceduren.
- Placera musen i ryggläge, på rygg med magen utsatta.
- Ta bort hår på den ventrala vänstra sidan av gnagare från det andra revbenet utrymme ner till 4: e inguinala bröstkörteln nippel genom att torka området med kemiska hårborttagnings. Låt hårborttagnings att sitta 1-2 minuter och sedan ta bort helt med gasbinda och H2O Detta steg kan göras 1 - 2 dagar i förväg för att spara tid om många operationer planeras.
- Ta en 2 x 2 "steril gasbinda svamp (indränkt i 2% klorhexidin) och torka av musen på platsen för hårborttagning. Sterilisera hela omgivningen, inklusive svansen, för att minimera bakteriell fortsaminering av instrument.
- Torka platsen för hårborttagning och omgivningen ner med en alkohol prep pad.
- Upprepa 2% klorhexidin och alkohol steg än en gång och avsluta med en slutlig Klorhexidin torka för totalt tre 2% klorhexidin och två alkohol prep pad tvättar. Gör den slutliga Klorhexidin torka så att kemikalien inte droppar runt operationsområdet för att undvika att få Klorhexidin på inre organ. OBS: Tillämpning av stora mängder av klorhexidin och alkohol på huden och omgivande päls kan resultera i en betydande nedgång i kroppstemperatur. Torka inte med överskottsvolym under steg 2,7-2,9. Upprätthålla kroppstemperaturen med en värmedyna.
- Med användning av sterila handskar och en steriliserad skalpell med sterilt blad, göra en enda en-tums snitt i huden mellan median och sagittalplan på den vänstra sidan av musen, med början strax under revbenen och slutar strax ovanför planet för den fjärde inguinal bröstkörtel spene.
- Med hjälp av autoklave eller pärla steriliserade sax och pincett, gör en liknande en-tums snitt i bukhinnan. Undvik att skära i bröstfettkudden och se till att inte skära tarmar, lever, eller membran.
- Placera en 4 x 4 "kompress indränkt i steril saltlösning på den vänstra sidan av musen, där snitt gjordes, så att inre organ kan placeras på gasväv och inte komma i kontakt med den omgivande huden eller kirurgiskt område.
- Förbered tumörceller genom att pipettera upp och ned flera gånger som tumörceller kommer att avgöra under framställningen av musen. Förbered en 25 pl avtagbar sprutnål och 32-nål med tumörceller. Tryck på sprutan tills tumörceller är vid spetsen av nålen och kolven är i lämplig volym för injektion; undvika injektion av luftbubblor.
- Torka utsidan av nålen med en steril våtservetten för att avlägsna eventuella externa tumörceller. Var försiktig för att undvika nålstick.
- Håll median side av snittet, inklusive hud och peritoneal foder, förutom med pincett och använda en steril bomullspinne för att försiktigt dra de stora och små tarmar ut, placera dem på steril gasbinda indränkt i steril saltlösning. Dra ut stora och små tarmar tills portvenen visualiseras.
- Täck de inre organen i saltlösning indränkt gasbinda för att upprätthålla inre fukt och sterilitet.
- Har en assistent, också bär sterila handskar, hålla tarmarna inslagna i saltlösning indränkt gasbinda försiktigt ur vägen med en steril bomullspinne för att till fullo avslöja portvenen. Dessutom kan det vara nödvändigt att använda det autoklave hemostat eller pincett för att hålla vävnad åt sidan på median sidan av snittet.
- Stick in nålen laddade med tumörceller ~ 3-5 mm in i portvenen ~ 10 mm under levern vid en vinkel <5 ° till venen, med koniska uppåt. Långsamt injicera hela volymen innehåller tumörceller. Låt blod strömma förbi nålen hEAD i flera sekunder för att undvika tillbakaflöde av tumörceller ur venen. Minimera nålen i venen i rörelse under injektionen. Återigen, var försiktig för att undvika nålstick.
OBS: Visualisering av portvenen sker utan förstoring, men ett stereomikroskop kan användas om så önskas. - Ta bort nålen samtidigt placera en steril bomullstopp på venen med tryck. Med assistenten fortfarande håller tarmen undan placera en bit av 0,5-1 cm 2 hemostatisk gasväv på injektionsstället på venen.
OBS: Blods pulver också försökt för detta steg i protokollet men var inte effektiva i att stoppa venösa blodförlust efter injektion. - Håll den hemostatiska gasväv på injektionsstället med tryck från en steril bomullsspets applikator för 5 min.
- Bedöma stängning av venen genom att försiktigt lyfta den hemostatiska gasväv, om de gasväv pinnar till den omgivande vävnaden, en liten mängd av sterile saltlösning kan användas för att suga och lyfta gasväv.
- Om blodförlusten sker vid den här tiden, placera en extra bit hemostatisk gasväv på platsen med tryck för en ytterligare 5 minuter. När blodflödet har upphört helt, ta bort gasväv från musen.
OBS: Blodförlust under det kirurgiska ingreppet måste bedömas noggrant och om den totala tillåtna blodförlust volym uppfylls eller överskrids (baserat på regulatoriska standardrutiner för utredarens institutionella prövningsnämnder) musen måste avlivas under anestesi genom hjärt perfusion. - När injektionsstället anses intakt, utan blod lämnar injektionsstället, placeras de inre organen försiktigt tillbaka in i bukhålan.
- Sutur peritoneal foder och sedan huden med steril 4-0 vicryl sutur och avsmalnande nål med en enkel kontinuerlig eller avbruten sutur mönster. Normalt stänger snittet kräver 10-15 suturer.
- Injicera 100 pl Bupivacaine (5 mg / ml) längs snittstället för lokal smärtlindring med användning av en insulinspruta. Injicera 0,5 ml steril koksaltlösning subkutant med hjälp av en 1 ml spruta med 26-gauge nål för vätske. Operationer tar 15 - 25 minuter att slutföra.
- För att bibehålla sterila betingelser under hela operationen, se till att alla verktyg och material som kommer i kontakt med musen, inklusive handskar på händerna, städas lämpligt före kontakt. Där det är möjligt använder sterila material och handskar, eller minimalt utnyttja en 70% etanollösning eller 10% blekmedel att rengöra.
- Om flera operationer planeras för en enda session remake inledande operationsområdet med färsk steril duk, insulinsprutor, 1 ml sprutor, steril saltlösning, 2 x 2 "steril gasväv svampar, 4 x 4" steril gasbinda, BLODS gasväv skuren i 0,5 - 1 cm 2 st, 4-0 Vicryl suturer med avsmalnande nål, och 2% klorhexidin. Bead-sterilisera sax, pincett och hemostat i mellan operationer och tillåtaatt adekvat kyla före återanvändning.
3. Återvinning, övervakning Gnagare hälsa, och slutpunkt Analyser
- Efter det kirurgiska ingreppet är klar, underhålla möss på en värmedyna för återvinning i sängkläder fria, rena burar under minst 20 minuter. Möss tar normalt 2 - 4 min att vakna upp ur narkosen.
- Skicka inte tillbaka ett djur som har opererats för samlevnad med andra djur förrän den har återhämtat sig helt från anestesi. Lämna inte ett djur utan tillsyn medan den återfår medvetandet och övervaka dess att djuret har återfått förmågan att hålla sig kvar i sternala VILA.
- Ge möss 0,05-0,1 mg / kg buprenorfin för smärtlindring varje 6-12 timmar efter operation, för upp till 72 timmar.
- Kontrollera suturer dagligen för att säkerställa att de förblir intakta under läkning. I det fall att suturerna komma ogjort, placera musen under anestesi, ta bort kvarvarande suturer och byta ut. I fallet med infektion eller Inflammation kontakta veterinär personal.
OBS: infektion eller inflammation inte har stött på med detta protokoll. - För metastas studier, utföra dagliga hälsokontroller tills yttre tecken på metastaserad sjukdom observeras inklusive men inte begränsat till:> 10% viktminskning / vinst, scruffiness, bristande uppmärksamhet till omgivningen, buken ödem / ascites, ljusa ögon och öron, eller en krökt position.
OBS: Dagliga hälsokontroller är särskilt viktiga när man utvecklar en modell för användning med en ny cellinje eller cellkoncentration tills tidslinjen av metastaser är väl förstått. - Vid studiens slut-punkt, euthanize möss genom CO 2 inandning följt av cervikal dislokation.
OBS: Alternativa metoder för dödshjälp godkänts av utredarnas tillsynsutskott kan användas, inklusive perfusion med 1x PBS under anestesi. Perfusion av levern utförs genom kanylering portvenen, snipping den nedre hålvenen, och trycka 1x PBS thgrov levern kärlsystemet med en hastighet av 4 ml / min under 1 - 2 min för att avlägsna cirkulerande blod och leukocyter.
OBS! Beroende på slutpunkten för studien, cellinje, och den använda koncentrationen, öppen levermetastaser kan eller inte kan vara uppenbara vid obduktion. Mikrometastatiska lesioner kan avslöjas med histologisk analys av levern. Endpoints varierar beroende på studiens utformning. - Extrahera levern med sax och pincett genom att först avlägsna gallblåsan, därefter skära igenom den nedre hålvenen överlägsen levern. Skär genom vena cava, portalvenen, och leverartären underlägsen levern.
- Ta bort hela levern försiktigt och tvätta 5x i 1x PBS.
- Separera levern till vänster, höger, median, och caudatus lober.
- Formalin fix levern i 10% neutral buffrad formalin under 48 timmar under skakning vid rumstemperatur. Process vävnader genom en serie av alkoholer i ökande koncentration och xylen; paraffin bädda den fasta vävnaden 71 OBS: Alternativt levern kan snäpp frysas genom att placera vävnaden i en cryomold med optimal skärtemperatur (oktober) formeln och frysa på torrispellets nedsänkta i 95% etanol.
- Med hjälp av en mikrotom, skuren i paraffin inbäddade vävnadsblock så att en match-huvudstorlek av vävnad avslöjas.
- Skär fem 4-mikron seriella sektioner utgör detta den första nivån för analys.
- Kapa 250 mikron av vävnad, kasta dessa avsnitt i avfallet.
- På 250 mikron skär en andra nivå av fem 4-micron seriesnitt.
- Upprepa vid behov till snitt genom hela levern. Hematoxylin och eosin fläck den första delen av varje nivå för att bedöma för metastaser 72.
OBS: För snäpp fryst vävnad använda en kryostat att skära sektioner.
OBS: Upptäckt av mikrometa sjukdom kräver tumörcellspecifik färgning.
- Ta bort möss från studien om det finns tumörtillväxt vid snittet sittae, eftersom detta indikerar tumörcell läckage in i peritonealhålan efter injektion.
OBS: Detta problem har inte observerats.
Representative Results
Portvenen injektionsmodell, i vilken tumörceller levereras direkt till levern via en kirurgisk procedur, gör det möjligt för tumörcellinjektion in i portvenen. Under antiseptiska förhållanden, i en sövd mus, är en ~ 1-tums kirurgiskt snitt görs på den vänstra sidan av musen mellan median och sagittalplan, med början strax ovanför planet för den fjärde inguinal mjölkkörtlarna spene och slutar strax under revbenen . De stora och små tarmar är försiktigt dras genom snittet för att åstadkomma visualisering av portvenen (Figur 1A). Exakt anatomiska identifiering av portådern och framgångsrika inom portal injektion kan bekräftas genom att öva injektionsprotokollet med tusch eller liknande färg. Korrekt injektion via portalvenen kommer att resultera i bläck att levereras omedelbart och specifikt till levern, och kommer inte att resultera i tusch spridning till lungan (Figure 1B). Vidare, genom att använda D2A1 musbrösttumör celler märkta med GFP, spridning av tumörceller i hela levern är uppenbar vid nittio minuter efter injektion, vilket bekräftar portvenen injektionsleverans till levern (Figur 1C). Vid högre förstoring blir det uppenbart att vid 90 min efter injektion, är tumörceller inom sinusoiderna, liksom inom leverparenkym i nära anslutning till portal triader, där portvenen blod kommer in i levern (Figur 1C). Dessa data antyder att ett aktivt tumörcell extravasering sker vid 90 min efter tumörcellinjektion. Sammantaget visar dessa data bekräftar att portvenen injektionsmodell levererar injektionsvolymen direkt till levern, med bläck eller tumörceller spridda över hela levern och ingen märkbar transport av injektionsvolym till lungan.
För att bedöma robustheten portvenen injektionsmodell, tre separåt syngena mus mammary tumörcellinjer testades i vuxen Balb / c-möss. Dessa brösttumörlinjer utvalda baserat på deras kännetecknas beteende bröstfettkudden modeller och inkluderar mycket aggressiv och metastaserande 4T1 cellinje, desto mindre aggressiv metastaser D2A1 linje, och den låga / icke-metastaserande D2.OR linje 37,61,73 , 74. 2.000 och 10.000 celler per injektion testades med inga märkbara skillnader i tid för utveckling av öppen metastas med dessa låga cellkoncentrationer. För dessa studier surrogatmarkörer av metastaser användes såsom brist på grooming, blekhet, och viktminskning för att motivera obduktion, varefter närvaron eller frånvaron av levermetastaser bekräftades genom visuell bedömning av levern och andra organ för att bekräfta inom portal leverans . Dessa data bekräftar tidigare rapporter om att 4T1 och D2A1 cellinjer representerar mer aggressiva brösttumörlinjer, som kortare metastaser fria överlevnad observeras jämfört med möss som injiceratsmed det mindre aggressiva D2.OR linjen (Figur 2A). Möss injicerade med 4T1 eller D2A1 tumörceller utvecklade overt levermetastaser vid ~ 30 - 40 dagar efter injektion, och vissa utvecklade metastaser så tidigt som 18 dagar efter injektion (Figur 2A), medan endast en mus som injicerats med D2.OR celler hade utvecklade öppen levermetastaser vid studiens slut, vilket var 60 - 65 dagar efter tumörcellinjektion. Metastaser därefter bekräftades genom sektionering genom levern i 250 um nivåer och analysera hematoxylin och eosin (H & E) färgade sektioner (figur 2B-D).
Förutom detektering av uppenbara metastatiska lesioner i muslever, kan portvenen modell också användas för att studera tidigare händelser i den metastatiska kaskaden inklusive detektering av enstaka celler / cellkluster efter extravasation, och bildning av mikrometastatisk lesioner. Multiplex immunofluorescens-färgning användesatt detektera 4T1, D2A1 och D2.OR brösttumörceller i levern när de är närvarande som enskilda celler eller mikrometastatiska lesioner, som H & E är inte tillräcklig för att bekräfta närvaron av små lesioner. Figur 3A visar ett representativt Balb / c muslever med en förmodad mikrometa härdar av D2A1 tumörceller som är positiva för epitelial keratin CK18, negativ för den pan-immun markör CD45 och negativt för hepatocyte markör Heppar-1. Hepatocyter färga också positivt för CK18, vilket nödvändiggör användning av Heppar-1 i denna färgning panel. En viktig anmärkning är att gallgången epitel och lever progenitorceller färgas positivt för CK18, kräver noggrann diskriminering mellan tumörceller och gallgångar, särskilt vid bedömningen periportala regioner (figur 3A). Ett alternativ till multiplex immunofluorescens för att identifiera enskilda sprids celler och mikrometa fokus är att utnyttja syngena brösttumörlinjer märkta med förbättrade grönt fluorescerandeprotein (EGFP) och / eller luciferas och utför IHC för taggen (Figur 1C). På grund av immunogenicitet EGFP, luciferas, och andra proteiner, är det viktigt att använda musmodeller som toleranta mot dessa proteiner, såsom den nya immunkompetenta "glödande head" mus som uttrycker EGFP och luciferas i den främre hypofysen 75. För identifiering av macrometastatic lesioner av omärkta syngena linjer såsom D2A1 tumörlinjen är CK18 / Heppar-1 / CD45 multiplex immunofluorescens ideal (Figur 3B).
Figur 1: Portal sveninjektion levererar tumörceller direkt till levern. A) Portal ven injektion; snitt görs mellan medianen och vänstra sagittalplan, från ovan planet hos den fjärde inguinal mjölkkörtlarna spene och slutar strax under rib bur. B) Balb / c-lever med PBS injektion (till vänster). Följande tusch injektion via portvenen, levern (mitten) men inte i lungorna (höger) tar upp bläck. C) Representativa tunna sektionsbilder av D2A1 musbrösttumör celler märkta med GFP i en Balb / c-muslever vid 90 min efter injektion av 1 x 10 6 tumörceller via portvenen. Levrarna formalin fixerade, paraffininbäddade, sektionerades, och färgades med anti-GFP-antikropp för tumörcelldetektering. Ovanpanelen visar mörkbrun färgade tumörceller (pilar) spridda över hela levern, betecknar asterisk ospecifik hepatocyte färgning runt centrala ådror; skala bar = 300 um. Lägre paneler visar representativa bilder av tumörceller vid 90 min efter injektion fortfarande nära förknippad med kärl; skala bar = 50 pm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: utväxt av musbrösttumör cellinjer i levern efter Portal sveninjektion. A) Kaplan-Meier-kurva som visar metastasering fria överlevnaden hos möss som injicerats med 2,000-10,000 4T1, D2A1 eller D2.OR mus brösttumörceller. Möss injicerades med tumörceller och övervakas för tecken på metastaser, inklusive brist på grooming, ljusa ögon, och viktförändringar. Metastas bekräftades vid tidpunkten för obduktion och av H & E på histologiska sektioner av levrar. N = 2 4T1 2000-celler; 2 4T1 10000 celler. N = 2 D2A1 2.000 celler; 3 D2A1 10000 celler. N = 3 D2.OR 2.000 celler; 3 D2.OR 10000 celler. Representativ H & E bilder av B) 4T1 lesioner vid 21 dagar efter injektion av 10.000 celler, C) D2A1 lesioner vid 26 dagar efter injektion av 10.000 tumörceller, och D) D2.OR lesioner vid59 dagar efter injektion av 10.000 celler; Skalstrecken = 75 | im. Liknande skador observeras när 2000 4T1 eller D2A1 tumörceller injicerades. Inga skador upptäcktes med 2.000 D2.OR celler. Inga tecken på metastaser i andra organ eller det kirurgiska ingreppet platsen var uppenbar i någon mus på dessa studier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Upptäckt av enskilda celler och metastaser i muslever använder Multiplex Immunofluorescens. A) Representativa multiplex immunofluorescens av D2A1 tumörceller i en Balb / c muslever vid 90 min efter injektion med hjälp av portalen sveninjektion modell. Färgning gjordes med användning av en multiplex kit. Från vänster till höger visar DAPI; CD45 för att markera leukocyter; Heppar-1 att mark hepatocyter; och CK18 att markera tumörceller, hepatocyter och gallgången epitel. Sammanslagna bilden visar en förmodad kluster av CK18 + Heppar-1 - CD45 - D2A1 tumörceller närstående en portal triad. Pil = D2A1 tumörceller, asterisk = gallgången epitel; skala bar = 25 pm. B) Ett representativt öppen D2A1 metastaserande lesion med hjälp av samma färgnings panel som i A. Tumörceller är CK18 + medan intilliggande hepatocyter är CK18 + Heppar-1 +; skala bar = 25 pm. Bilder fångades på ett mikroskop med 20 x 0,8, 40 x 1,3, och 60 x 1,4 mål och CCD-kamera, med hjälp av mikroskop programvara. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Balb / c-mus portvenen injektion modell tillåter studiet av bröstcancer lesioner i levern i frånvaro av confounding många organ metastasering och i ett fullt immun kompetent värd. Vår protokoll är ett framsteg över tidigare publicerade kirurgiska procedurer som tillåter åtkomst till portvenen för injektion av tumörceller direkt in i levern 16,55,56. En framsteg vi har gjort är att avsevärt minska antalet injicerade tumörceller från ≥ 1 x 10 5 celler / injektion 16,55,56 ner till ≤ 10000 tumörceller / injektion. Vi har också utökat modell för studier av bröstcancer metastaser till levern. Med hjälp av detta protokoll, två bröstcancercellinjer med känd metastatisk potential att utveckla levermetastaser med kortare latens än en mer vilande brösttumör cellinje. Vidare, vid tidiga tidpunkter, är tumörceller fördelade över hela leverparenkymet som enskilda eller små grupper av enstaka cells efter tumörcellinjektion. Modellen är redo att ta itu med frågor om metastatisk effektivitet inklusive tumörceller extravasering, cellöverlevnad, dvala, och spridning - alla fenotyper som bidrar till utvecklingen av mikrometastatisk och öppen metastaserad sjukdom i levern.
Det är viktigt att tänka på många aspekter av portvenen injektionsprotokoll innan man inleder studier. Noggrant besluta om cellinjer, cellkoncentration, totalt cellantal, och slutpunkter av intresse baserat på mindre förberedande studier rekommenderas starkt. Vidare är av yttersta betydelse för att förstå värd-tumörcellinteraktioner användningen av immunkompetenta värdar och syngena cellinjer. Den nyutvecklade "glödande head" mus som uttrycker EGFP och luciferas från den främre hypofysen är ett viktigt verktyg för att eliminera värd svar på exogen EGFP och luciferas, proteiner ofta används för att märka brösttumörlinjer 75
Det är viktigt att notera att portvenen injektion modellen inte replikera den fulla metastaser kaskad, men är begränsad till studiet av tumörcell extravasering, tumörcell-nisch interaktioner vid extravasation och tumörtillväxt. Modeller som exakt efterliknar hela metastaserande kaskad till levern, såsom förekommer i patienter, finns ett stort behov. En ytterligare begränsning av portalen ven injektion modell är att det är skam av effekterna av kirurgi på värden, med sårläkning känd för att påverka sjukdomsprogression 76,77.
Portalen sveninjektion modell representerar en förbättring jämfört med andra injektionmodeller för att studera levermetastaser, inklusive intrakardiell och mjälten modeller. Specifikt möjliggör studier av ett större utbud av sjukdomsprogression än intrakardiell modellen, som ofta begränsas av åtföljande metastaser i andra vävnader portalen sveninjektion modell. Vidare är portvenen modellen inte komplicerat genom avlägsnande av mjälten, vilket görs i den i mjälten modell.
Portvenen injektion modellen kan vara ett användbart verktyg för att studera levermetastaser i allmänhet. Levermetastaser är den vanligaste platsen för metastaser i adenokarcinom övergripande, med särskilt höga nivåer i pankreascancer (85% av metastaser är till levern), tjocktarms- och ändtarms adenokarcinom (> 70%), liksom magen och matstrupen (> 30 %) 1. Även om spontana och orthotopic primära tumörmodeller av pankreatiska och kolon adenokarcinom lättare metastasera till levern 78,79 kan portalsveninjektion modell Prove användbar för att förstå metastatiska processen av dessa cancerformer som kontrollerad leverans av tumörceller möjliggör biokemiska, molekylära och histologiska bedömningar vid bestämda tidpunkter efter tumörcell ankomst. Sammanfattningsvis representerar portalsveninjektion modell en viktig förbättring jämfört med tillgängliga levermetastaser modeller av bröstcancer, och kan också vara tillämplig på levermetastaser området i allmänhet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml Syringe w/ 26-gauge Needle | BD Syringe | 309597 | For subcutaneous buprenorphine injection; use caution, sharp |
| Alcohol Prep Pads | Fisher Scientific | 06-669-62 | For cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| All Purpose Sponges, Sterile | Kendall | 8044 | 4" x 4", use dipped in sterile saline to keep large and small intestines protected and hydrated during surgery |
| Artificial Tears | Rugby | 370114 | Mineral oil 15%, white petrolatum 83%; use to protect eyes during surgery |
| Buprenorphine HCl, 0.3 mg/ml | Mfg. by Reckitt Benckiser | NDC-12496-0757-1 | Use at 0.05 - 0.1 mg/kg body weight, 1 - 2x daily for 72 hr, injected subcutaneously |
| Bupivacaine HCl, 0.5% (5 mg/ml) | Mfg. by Humira Inc | NDC-04091163-01 | Use at 0.5%, 1x immediately after surgery, 10 μl injected subcutaneously at incision site |
| anti-CD45 antibody | BD Pharmingen | 550539 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude leukocytes in identification of metastatic foci |
| Celox™ Rapid Hemostatic Gauze | Medtrade Products Ltd. | FG08839011 | Cut into 5 mm² pieces, use to stop blood flow out of the portal vein with pressure following injection |
| Chemical Depilatory | Use to remove hair from surgical area; multiple suppliers | ||
| Chlorhexidine, 2% Solution | Vet One | 1CHL008 | Use caution, do not get chlorhexidine in mucous membranes or ears of the mouse |
| anti-CK18 antibody | Abcam | ab53118 | Use in multiplex immunofluorescence to identify metastatic foci |
| Cotton Tipped Applicators, Sterile | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6" Wooden Shaft 2 pc/envelope |
| DMEM, High-Glucose | HyClone | SH30243.01 | Cell culture media base for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines |
| Dry Glass Bead Sterilizer | Use between surgeries to sterilize stainless steel tools, use caution, extremely hot; multiple suppliers | ||
| Ethanol, 70% solution | Use caution flammable; use to clean surgical area as needed; multiple suppliers | ||
| Fetal Bovine Serum | HyClone | SH30071.03 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 10% in DMEM high glucose |
| Gauze, Sterile | Kendall | 2146 | 2" x 2", use dipped in chlorhexidine 2% solution for cleaning of abdomen prior to surgical incision |
| anti-Green Fluorescent Protein antibody | Vector Laboratories | BA0702 | Use to stain for GFP tagged D2A1 or other mammary tumor cell lines |
| L-Glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 2 mM (1x) in DMEM high glucose |
| Heating Pad, x 2 - 3 | Use to maintain body heat during surgery and recovery; multiple suppliers | ||
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1483 | For use in cell culture to count cells |
| Hemostatic Forceps | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| anti-Heppar-1 antibody | Dako | M7158 | Use in multiplex immunofluorescence to exclude hepatocytes in identification of metastatic foci |
| Insulin Syringe, 0.3 ml, 29-gauge | BD | 324702 | For bupivacaine injection at suture site; use caution, sharp |
| Isoflurane | Piramal | NDC-66794-017-25 | Administered at 2.5% |
| Isoflurane Vaporizer | VetEquip | 911103 | Use caution, vaporizes anesthetic gases |
| Light Source | Use for visualizing the surgical field; multiple suppliers | ||
| Neutral buffered formalin, 10% | Anatech Ltd. | 135 | Use caution, toxic; use as a tissue fixative for metastasis endpoints and assesment of metastatic burden by histology |
| Opal™ 4-color fIHC kit | PerkinElmer, Inc. | NEL794001KT | Use for multiplex immunofluorescence of Heppar-1/CD45/CK18 to detect metastases in murine liver |
| Operating Scissors | Stainless steel; use caution, sharp; multiple suppliers | ||
| Penicillin/Streptomycin, 100x | Corning | 30-002-Cl | Cell culture media additive for use with D2A1, D2.OR, and 4T1 mammary tumor cell lines, use at 1x in DMEM high glucose |
| Phosphate-buffered Saline | Use at 1x for resuspending tumor cells prior to injection, multiple suppliers | ||
| Removable Needle Syringe, 25 μl, Model 1702 | Hamilton | 7654-01 | For portal vein injection; use caution, paricularly while working with tumor cell-loaded needles, sharp when needle is attached |
| Scalpel handle | Stainless steel; multiple suppliers | ||
| Scalpel blade, #15 | Carbon steel, sterile, size 15; multiple suppliers | ||
| Small Hub Removable Needles, 32-gauge | Hamilton | 7803-04 | For portal vein injection, 1" length, point style 4, 12° angle, 33- to 34-gauge reusable needles can also be used; use caution, paricularly while working with tumor cell loaded needles, sharp |
| Sodium Hypochlorite | Use caution, corrosive; use at 10% to disinfect workspace and surfaces, multiple suppliers | ||
| Sterile Saline | Fisher Scientific | BP358-212 | 0.9% NaCl solution; alternatively, can be homemade and sterile filtered |
| Surgical Gloves, Sterile | Multiple suppliers | ||
| Sutures, Sterile | Ethicon | J310H | 4-0 27" coated vicryl w/ 22 mm 1/2c taper ethalloy needle; use caution, sharp |
| Table Top Portable Anesthesia Machine | VetEquip | 901801 | Use with isoflurane vaporizer for mouse anesthesia |
| Thumb Dressing Forceps | Stainless steel, serrated, blunted; multiple suppliers | ||
| Towel Drapes, Sterile | Dynarex | 4410 | 18" x 26", to cover heating pad and provide a sterile workspace during surgery |
| Trypan Blue | Life Technologies | T10282 | For use in cell culture to assess viability, use 1:1 with cells in 1x PBS |
| Trypsin/EDTA, 0.05% (1x) | Gibco | 25300-054 | Use in cell culture to detach tumor cells from tissue culture plates |
References
- Hess, K. R., et al.
- Berman, A. T., Thukral, A. D., Hwang, W. T., Solin, L. J., Vapiwala, N. Incidence and patterns of distant metastases for patients with early-stage breast cancer after breast conservation treatment. Clin Breast Cancer. 13, 88-94 (2013).
- Savci-Heijink, C. D., et al. Retrospective analysis of metastatic behaviour of breast cancer subtypes. Breast Cancer Res Treat. 150, 547-557 (2015).
- Gerratana, L., et al. Pattern of metastasis and outcome in patients with breast cancer. Clin Exp Metastasis. 32, 125-133 (2015).
- Bonotto, M., et al. Measures of outcome in metastatic breast cancer: insights from a real-world scenario. Oncologist. 19, 608-615 (2014).
- Wyld, L., et al. Prognostic factors for patients with hepatic metastases from breast cancer. Br J Cancer. 89, 284-290 (2003).
- Tarhan, M. O., et al. The clinicopathological evaluation of the breast cancer patients with brain metastases: predictors of survival. Clin Exp Metastasis. 30, 201-213 (2013).
- Tseng, L. M., et al. Distant metastasis in triple-negative breast cancer. Neoplasma. 60, 290-294 (2013).
- Liu, X. H., Man, Y. N., Cao, R., Liu, C., Wu, X. Z. Individualized chemotherapy based on organ selectivity: a retrospective study of vinorelbine and capecitabine for patients with metastatic breast cancer. Curr Med Res Opin. 30, 1017-1024 (2014).
- Ahn, S. G., et al. Prognostic factors for patients with bone-only metastasis in breast cancer. Yonsei medical journal. 54, 1168-1177 (2013).
- Purushotham, A., et al. Age at diagnosis and distant metastasis in breast cancer--a surprising inverse relationship. Eur J Cancer. 50, 1697-1705 (2014).
- Karimi, A., Delpisheh, A., Sayehmiri, K., Saboori, H., Rahimi, E. Predictive factors of survival time of breast cancer in kurdistan province of Iran between 2006-2014: a cox regression approach. Asian Pac J Cancer Prev. 15, 8483-8488 (2014).
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H.
- Joyce, J. A., Pollard, J. W.
- Luzzi, K. J., et al. Multistep nature of metastatic inefficiency: dormancy of solitary cells after successful extravasation and limited survival of early micrometastases. Am J Pathol. 153, 865-873 (1998).
- Cameron, M. D., et al. Temporal progression of metastasis in lung: cell survival, dormancy, and location dependence of metastatic inefficiency. Cancer Res. 60, 2541-2546 (2000).
- Psaila, B., Lyden, D. The metastatic niche: adapting the foreign soil. Nat Rev Cancer. 9, 285-293 (2009).
- Oskarsson, T., et al. Breast cancer cells produce tenascin C as a metastatic niche component to colonize the lungs. Nat Med. 17, 867-874 (2011).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nat Cell Biol. 17, 816-826 (2015).
- Kaplan, R. N., et al. VEGFR1-positive haematopoietic bone marrow progenitors initiate the pre-metastatic niche. Nature. 438, 820-827 (2005).
- Erler, J. T., et al. Hypoxia-induced lysyl oxidase is a critical mediator of bone marrow cell recruitment to form the premetastatic niche. Cancer Cell. 15, 35-44 (2009).
- Zhao, L., et al. Recruitment of a myeloid cell subset (CD11b/Gr1 mid) via CCL2/CCR2 promotes the development of colorectal cancer liver metastasis. Hepatology. 57, 829-839 (2013).
- Peinado, H., Lavotshkin, S., Lyden, D. The secreted factors responsible for pre-metastatic niche formation: old sayings and new thoughts. Semin Cancer Biol. 21, 139-146 (2011).
- Van den Eynden, G. G., et al. The multifaceted role of the microenvironment in liver metastasis: biology and clinical implications. Cancer Res. 73, 2031-2043 (2013).
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer Cell. 3, 537-549 (2003).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436, 518-524 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459, 1005-1009 (2009).
- Ogba, N., et al. Luminal breast cancer metastases and tumor arousal from dormancy are promoted by direct actions of estradiol and progesterone on the malignant cells. Breast cancer research : BCR. 16, 489 (2014).
- Coffelt, S. B., et al. IL-17-producing gammadelta T cells and neutrophils conspire to promote breast cancer metastasis. Nature. 522, 345-348 (2015).
- Kitamura, T., Qian, B. Z., Pollard, J. W.
- Zhang, Q., et al. CCL5-Mediated Th2 Immune Polarization Promotes Metastasis in Luminal Breast Cancer. Cancer Res. 75, 4312-4321 (2015).
- Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27, 462-472 (2015).
- Koyama, S., et al. Adaptive resistance to therapeutic PD-1 blockade is associated with upregulation of alternative immune checkpoints. Nat Commun. 7, 10501 (2016).
- Quail, D. F., et al. The tumor microenvironment underlies acquired resistance to CSF-1R inhibition in gliomas. Science. 352, (2016).
- Dexter, D. L., et al. Heterogeneity of tumor cells from a single mouse mammary tumor. Cancer Res. 38, 3174-3181 (1978).
- Aslakson, C. J., Miller, F. R. Selective events in the metastatic process defined by analysis of the sequential dissemination of subpopulations of a mouse mammary tumor. Cancer Res. 52, 1399-1405 (1992).
- Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
- Pulaski, B. A., Ostrand-Rosenberg, S. Reduction of established spontaneous mammary carcinoma metastases following immunotherapy with major histocompatibility complex class II and B7.1 cell-based tumor vaccines. Cancer Res. 58, 1486-1493 (1998).
- Doornebal, C. W., et al. A preclinical mouse model of invasive lobular breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 353-363 (2013).
- Derksen, P. W., et al. Somatic inactivation of E-cadherin and p53 in mice leads to metastatic lobular mammary carcinoma through induction of anoikis resistance and angiogenesis. Cancer Cell. 10, 437-449 (2006).
- Pravtcheva, D. D., Wise, T. L. Metastasizing mammary carcinomas in H19 enhancers-Igf2 transgenic mice. J Exp Zool. 281, 43-57 (1998).
- Lin, S. C., et al. Somatic mutation of p53 leads to estrogen receptor alpha-positive and -negative mouse mammary tumors with high frequency of metastasis. Cancer Res. 64, 3525-3532 (2004).
- Basse, P., Hokland, P., Heron, I., Hokland, M. Fate of tumor cells injected into left ventricle of heart in BALB/c mice: role of natural killer cells. J Natl Cancer Inst. 80, 657-665 (1988).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A.
- Balathasan, L., Beech, J. S., Muschel, R. J. Ultrasonography-guided intracardiac injection: an improvement for quantitative brain colonization assays. The American journal of pathology. 183, 26-34 (2013).
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51, 868-881 (2014).
- Zhou, H., Zhao, D. Ultrasound imaging-guided intracardiac injection to develop a mouse model of breast cancer brain metastases followed by longitudinal MRI. J Vis Exp. , (2014).
- Rajendran, S., et al. Murine bioluminescent hepatic tumour model. J Vis Exp. , (2010).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. , e51677 (2014).
- Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. J Exp Med. 204, 3037-3047 (2007).
- Swirski, F. K., et al. Identification of splenic reservoir monocytes and their deployment to inflammatory sites. Science. 325, 612-616 (2009).
- Levy, L., et al. Splenectomy inhibits non-small cell lung cancer growth by modulating anti-tumor adaptive and innate immune response. Oncoimmunology. 4, e998469 (2015).
- Higashijima, J., et al. Effect of splenectomy on antitumor immune system in mice. Anticancer Res. 29, 385-393 (2009).
- Thalheimer, A., et al. The intraportal injection model: a practical animal model for hepatic metastases and tumor cell dissemination in human colon cancer. BMC Cancer. 9, 29 (2009).
- Limani, P., et al. Selective portal vein injection for the design of syngeneic models of liver malignancy. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310, G682-G688 (2016).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17, 163-170 (1999).
- Coligan, J. E., et al. Mouse 4T1 breast tumor model. Current protocols in immunology. , (2001).
- Mahoney, K. H., Miller, B. E., Heppner, G. H. FACS quantitation of leucine aminopeptidase and acid phosphatase on tumor-associated macrophages from metastatic and nonmetastatic mouse mammary tumors. J Leukoc Biol. 38, 573-585 (1985).
- Rak, J. W., McEachern, D., Miller, F. R. Sequential alteration of peanut agglutinin binding-glycoprotein expression during progression of murine mammary neoplasia. Br J Cancer. 65, 641-648 (1992).
- Barkan, D., et al. Metastatic growth from dormant cells induced by a col-I-enriched fibrotic environment. Cancer Res. 70, 5706-5716 (2010).
- Lyons, T. R., et al. Postpartum mammary gland involution drives progression of ductal carcinoma in situ through collagen and COX-2. Nat Med. 17, 1109-1115 (2011).
- Allott, E. H., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drug use, hormone receptor status, and breast cancer-specific mortality in the Carolina Breast Cancer Study. Breast Cancer Res Treat. 147, 415-421 (2014).
- Kim, S., et al. Lifetime use of nonsteroidal anti-inflammatory drugs and breast cancer risk: results from a prospective study of women with a sister with breast cancer. BMC Cancer. 15, 960 (2015).
- Esbona, K., et al. COX-2 modulates mammary tumor progression in response to collagen density. Breast Cancer Res. 18, 35 (2016).
- Andrade, R. J., et al. Drug-induced liver injury: an analysis of 461 incidences submitted to the Spanish registry over a 10-year period. Gastroenterology. 129, 512-521 (2005).
- Chalasani, N., et al. Causes, clinical features, and outcomes from a prospective study of drug-induced liver injury in the United States. Gastroenterology. 135, 1924-1934 (2008).
- O'Brien, J., et al. Non-steroidal anti-inflammatory drugs target the pro-tumorigenic extracellular matrix of the postpartum mammary gland. Int J Dev Biol. 55, 745-755 (2011).
- Adamson, T. W., et al. Assessment of carprofen and buprenorphine on recovery of mice after surgical removal of the mammary fat pad. J Am Assoc Lab Anim Sci. 49, 610-616 (2010).
- Doornebal, C. W., et al. Morphine does not facilitate breast cancer progression in two preclinical mouse models for human invasive lobular and HER2(+) breast. Pain. 156, 1424-1432 (2015).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Paraffin embedding tissue samples for sectioning. CSH Protoc. , (2008).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harb Protoc. , 655-658 (2014).
- Maller, O., et al. Collagen architecture in pregnancy-induced protection from breast cancer. J Cell Sci. 126, 4108-4110 (2013).
- Martinson, H. A., Jindal, S., Durand-Rougely, C., Borges, V. F., Schedin, P. Wound healing-like immune program facilitates postpartum mammary gland involution and tumor progression. Int J Cancer. , (2014).
- Day, C. P., et al. 34;Glowing head" mice: a genetic tool enabling reliable preclinical image-based evaluation of cancers in immunocompetent allografts. PLoS One. 9, (2014).
- Schafer, M., Werner, S. Cancer as an overhealing wound: an old hypothesis revisited. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 628-638 (2008).
- Kuraishy, A., Karin, M., Grivennikov, S. I. Tumor promotion via injury- and death-induced inflammation. Immunity. 35, 467-477 (2011).
- Herreros-Villanueva, M., Hijona, E., Cosme, A., Bujanda, L.
- Johnson, R. L., Fleet, J. C.
