Summary
نحن تصف بروتوكول لإحداث مجزية وnonrewarding الخبرات في ذباب الفاكهة (ذبابة الفاكهة) باستخدام استهلاك الإيثانول الطوعي كمقياس للتغييرات في دول مكافأة.
Abstract
نحن تصف بروتوكول لقياس الإيثانول إدارة الذات في ذباب الفاكهة (ذبابة الفاكهة) كوكيل لإجراء تغييرات في دول مكافأة. ونحن لشرح طريقة بسيطة للاستفادة من نظام المكافأة الطاير، تعديل الخبرات المتعلقة مكافأة الطبيعية، واستخدام استهلاك الإيثانول الطوعي كمقياس للتغييرات في دول مكافأة. يخدم النهج كأداة ذات الصلة لدراسة الخلايا العصبية والجينات التي تلعب دورا في التغيرات بوساطة تجربة الدولة الداخلية. يتكون البروتوكول من قسمين منفصلة: فضح الذباب إلى الخبرات مجزية وnonrewarding، ويعاير استهلاك الإيثانول الطوعي كإجراء الدافع للحصول على مكافأة المخدرات. جزأين يمكن استخدامها بشكل مستقل للحث على التشكيل من الخبرة كخطوة أولى لمزيد من المقايسات المصب أو مقايسة التغذية الاختيار اثنين من المستقلين، على التوالي. لا يتطلب بروتوكول الإعداد معقدة، وبالتالي يمكن أن تطبق في أي المختبرذ مع الأدوات ثقافة ذبابة الأساسية.
Introduction
تعديل السلوك ردا على تجربة يسمح الحيوانات لضبط سلوكهم للتغيرات في بيئتها 1. وخلال هذه العملية، والحيوانات دمج الحالة الفسيولوجية الداخلية مع الظروف المتغيرة للبيئة الخارجية، وبعد ذلك اختيار عمل واحد على الآخر لزيادة فرصهم في البقاء والتكاثر. تطورت نظم المكافآت لتحفيز السلوكيات المطلوبة لبقاء الأفراد والأنواع من خلال تعزيز السلوكيات التي تعزز بقاء فوري، مثل الأكل أو الشرب، أو تلك التي تضمن البقاء على المدى الطويل، مثل السلوك الجنسي أو رعاية الأبناء 2. مركبات اصطناعية مثل تعاطي المخدرات تؤثر أيضا على أنظمة المكافأة تمثله من خلال التعاون المسارات العصبية التي تتوسط المكافآت الطبيعية 2.
خلال العقدين الماضيين، وذبابة الفاكهة أنشئت ذبابة الفاكهة نموذجا واعدا لدراسة molecجزيئية والآليات العصبية التي تشكل آثار الإيثانول على سلوك 3،4.
سابقا، حددنا مجموعة فرعية من الخلايا العصبية ببتيدي المفعول في الذباب (الجبهة الوطنية التقدمية / الجبهة الوطنية التقدمية مستقبلات (R) الخلايا العصبية) أن المكافآت الطبيعية الزوجين، مثل تجربة جنسية، لدوافع الحصول على المكافآت المخدرات 5. التعبير الجبهة الوطنية التقدمية حساسا لكلا التجارب الجنسية والمكافآت المخدرات، مثل التسمم الايثانول. يتم تحويل التغيرات في مستويات التعبير NPF إلى تغييرات في الإيثانول الذات إدارة 5، حيث يقلل من ارتفاع الجبهة الوطنية التقدمية وانخفاض الجبهة الوطنية التقدمية يزيد من الأفضلية لاستهلاك الإيثانول. تفعيل الخلايا العصبية NPF غير مجزية للذباب، كما أنها تكشف تفضيل قوي للرائحة يقترن تفعيل، وهو ما ينعكس أيضا انخفاض استهلاك الإيثانول. الأهم من ذلك، تنشيط الخلايا العصبية NPF يتداخل مع قدرة الذباب لتشكيل علاقة إيجابية بين التسمم الايثانول وجديلة رائحة. العلاقة السببية بين الجبهة الوطنية التقدمية / Rالنظام والذاكرة مكافأة، واستهلاك الإيثانول تشير إلى أن يمكن للمرء أن استخدام الإيثانول الإدارة الذاتية كمقياس للتغييرات في دول مكافأة 5.
في هذا المنشور نظهر نهج متكامل للالاستفادة من نظام المكافأة الطبيعي الطيران والتغيرات يعاير في دول مكافأة. يتكون المنهج من جزأين منفصلين، بروتوكول التدريب لمعالجة الخبرات ذات الصلة مكافأة الطبيعية، تليها اثنين الاختيار الشعرية المغذية فحص (CAFE) لتقييم الإيثانول الإدارة الذاتية كتقدير لإجراء تغييرات في دول مكافأة. فحص CAFE مماثل للفحوصات اختيار اثنين من زجاجة المستخدمة في الدراسات القوارض لمكافحة المخدرات والإدارة الذاتية، ولقد ثبت لتعكس خصائص معينة من السلوك مثل الإدمان في الذباب 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: لمحة عامة عن التصميم التجريبي: تصميم تجريبي يتضمن بروتوكول تكييفها للتودد قمع 7-9 في التي يتعرض لها الذباب الذكور إلى الخبرات مجزية وnonrewarding في 3 دورات تدريبية متتالية على مدى 4 د. في نهاية مرحلة التجربة، ويتم اختبار الذباب في فحص استهلاك الإيثانول الطوعي للاختيار اثنين ل3-4 د. وتشمل بروتوكول هنا العديد من الخطوات التحضيرية، وبعضها يمكن القيام به مقدما لاستخدامها في تجربة أكثر من واحد، في حين أن آخرين يجب ان تتم في الوقت المناسب قبل بداية التجربة (الجدول 1).
1. خطوات التحضيرية
- إعداد نظام الشعرية المغذية
- سخني 27 G إبرة واستخدامها لثقب الثقوب الصغيرة على طول قارورة (الشكل 1).
- قطع المكونات فيال في نصف (بالعرض) باستخدام شفرة حلاقة. علامة أربع نقاط على سطح من المكونات، وخلق squarشكل البريد لوضع أصحاب الشعرية في. استخدام إبرة 18 G لجعل 4 ثقوب من خلال قابس (الشكل 1B).
- استخدام شفرة حلاقة لقطع micropipets بحيث يمكن أن تعقد بحزم 5 الشعيرات الدموية الزجاج ميكرولتر، والتي تكون بمثابة المحولات.
- إدراج 4 محولات الشعرية في المقابس المعدة.
- بمناسبة موقف 2 ethanol- واثنين من الشعيرات الدموية التي تحتوي على nonethanol على المكونات.
ملاحظة: من المستحسن للحفاظ على مواقف أنواع 2 من الشعيرات الدموية متناسقة عبر كل قارورة. إيلاء الاهتمام لحجم الثقوب، كما تسمح فتحات كبيرة هروب من الذباب من قوارير. وبالإضافة إلى ذلك، فمن المستحسن استخدام الجانب سلاسة من المكونات (عادة مقابل الجانب قطع)، والجانب الذي يواجه نزولا عند إدراجها في قنينة، وقطع المكونات يخلق بعض والألياف فضفاضة الصغيرة التي الذباب يمكن الحصول على متشابكة في . - إعداد عدد كبير من قوارير ومحولات لاستخدامها لنظام الشعرية المغذية (CAFE)التجارب هو موضح في الخطوة 2.3.
- إعداد كوب صغير قارورة الغذاء
- وقبل يوم من جمع الذباب (الخطوة 1.4)، وترتيب 200 قارورة من الزجاج على رفوف أنبوب microcentrifuge. ذوبان يطير الغذائية (بحسب وصفه دبس الذرة، انظر جدول المواد) باستخدام الميكروويف. صب 2 مل من الطعام ذبابة في قارورة من الزجاج (ليس محاولة لتشويه الطعام على الجدران فيال). اسمحوا تتصلب الغذاء، وتغطية قارورة مع غلاف بلاستيكي.
ملاحظة: قارورة زجاجية تحتوي على المواد الغذائية يمكن أن تظل عند 4 درجة مئوية لعدة أسابيع. - في يوم جمع ذبابة، واتخاذ قارورة من الثلاجة والسماح لهم الوصول RT قبل استخدامها لإيواء الذباب.
ملاحظة: إذا قارورة الغذائية عدة أسابيع من العمر، تأكد من أن المواد الغذائية لا تزال سليمة وليس فصل من القارورة، والذباب يمكن محاصرين في الشقوق بين الطعام والزجاج.
- وقبل يوم من جمع الذباب (الخطوة 1.4)، وترتيب 200 قارورة من الزجاج على رفوف أنبوب microcentrifuge. ذوبان يطير الغذائية (بحسب وصفه دبس الذرة، انظر جدول المواد) باستخدام الميكروويف. صب 2 مل من الطعام ذبابة في قارورة من الزجاج (ليس محاولة لتشويه الطعام على الجدران فيال). اسمحوا تتصلب الغذاء، وتغطية قارورة مع غلاف بلاستيكي.
- مما يجعل حل المخزون الغذائي للمقايسة الشعرية المغذية
- إلى ما قبلحلج الحل المخزون الغذائي (5٪ سكروز و 5٪ مستخلص الخميرة)، ويحل 5.88 غرام من خلاصة الخميرة و5.88 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر.
ملاحظة: الحل الأسهم هو عرضة للغاية للتلوث. ولذلك، فمن المستحسن أن الأوتوكلاف عليه (121 درجة مئوية، و 30 دقيقة، وبدون دورة تجفيف) وقسامة عليه في 850 ميكرولتر قسامات عمل ليتم الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. تركيز المكونات في حل السهم 5.88٪ وستصل إلى تركيز النهائي من 5٪ بعد إضافة 15٪ من الإيثانول أو المياه (150 ميكرولتر إلى 850 ميكرولتر من محلول الطعام ولم يضف) قبل استخدامه في الخطوة 2.3.
- إلى ما قبلحلج الحل المخزون الغذائي (5٪ سكروز و 5٪ مستخلص الخميرة)، ويحل 5.88 غرام من خلاصة الخميرة و5.88 غرام من السكروز في 100 مل من الماء المقطر.
- جمع الذباب التجريبية
- جمع 200 الذباب الذكور ساذجة باستخدام وسادة CO 2.
ملاحظة: استخدم أي سلالة المختبر المناسب للسؤال التجريبية. 250 الذباب يمكن جمعها بسهولة من خمس زجاجات من الذباب في مرحلة eclosion اختيارهم. عند جمع الذباب، وإيلاء الاهتمام الدقيق إلى العقيدالذباب lect التي eclosed مؤخرا (الذباب المظهر العذراء: الذباب مشرق مع بقعة العقي في البطن). يجب أن تبقى الذباب التجريبية منفردة في قوارير زجاجية صغيرة تحتوي على المواد الغذائية والذين تتراوح أعمارهم إلى 3-4 د من العمر قبل استخدامها في التجربة. - استخدام المقابس الناعمة لإغلاق قارورة.
ملاحظة: سوف نفس المقابس الناعمة تكون مفيدة جدا للمرحلة التدريب عند استخدام طموح الفم لادخال الإناث داخل وخارج قارورة خلال مرحلة التجربة.
- جمع 200 الذباب الذكور ساذجة باستخدام وسادة CO 2.
- جمع الذباب مدرب
ملاحظة: يجب أن تبقى جميع الذباب التي تم جمعها في 12 ساعة / 12 ساعة ضوء / حاضنة الظلام عند 25 درجة مئوية و 70٪ الرطوبة النسبية (RH). يمكن تغيير 12 ساعة / 12 ساعة دورة الضوء / الظلام إلى وقت انطلاق مريحة.- عذراء الذباب مدرب الإناث
- جمع 500 مدرب الإناث البكر الذباب من الأسهم WT أو الأسهم virginator لاستخدامها الإناث تقبلا البكر. الحفاظ على الذباب الإناث في مجموعات من 25 في الحجم العادي قارورة الغذاء، وجميعآه منهم إلى سن 3-4 د من العمر قبل استخدامها في التجربة.
- تزاوج الذباب مدرب الإناث
- جمع 300 إناث الذباب البكر من الأسهم WT أو الأسهم virginator للخضوع التزاوج قبل مرحلة التدريب (الخطوة 1.6.1).
ملاحظة: يتم الاحتفاظ الذباب الإناث في مجموعات من 10 من الإناث في الحجم العادي قارورة الطعام والذين تتراوح أعمارهم بين ل3-4 د من العمر قبل استخدامها في التجربة.
- جمع 300 إناث الذباب البكر من الأسهم WT أو الأسهم virginator للخضوع التزاوج قبل مرحلة التدريب (الخطوة 1.6.1).
- الذباب الذكور تستخدم لتوليد تزاوج الذباب مدرب الإناث
- جمع 150 الذباب الذكور (وليس بالضرورة عذراء).
ملاحظة: يتم الاحتفاظ الذباب في مجموعات من 15 من الذكور في الحجم العادي قارورة الغذاء والعمر ل3-4 د من العمر قبل أن يقترن أنثى عذراء الذباب لإنشاء الإناث مدرب تزاوج.
- جمع 150 الذباب الذكور (وليس بالضرورة عذراء).
- عذراء الذباب مدرب الإناث
- توليد تزاوج الذباب الإناث مدرب
- لتوليد أنثى تزاوج الذباب لاستخدامها المدربين والجماعات زوج من 10 أنثى عذراء الذباب مع الذباب الذكور 15 عن طريق التقليب واحد القارورة التي تحتوي على الذكور إلى الإناث حساب المشتركining قنينة 16-18 ساعة قبل مرحلة التدريب (الخطوة 2.1) 10.
ملاحظة: هذه عادة يجب أن تأخذ مكان في المساء قبل الدورة التدريبية. 1.5: 1 نسبة الذكور بين الذباب الذباب الإناث يؤكد أن جميع الإناث سيتم تزاوج. - في يوم من التجربة، والفصل بين الإناث تزاوج من الذكور بواسطة الشفط الذكور من القارورة باستخدام الشافطة الفم. تنفيذ هذا الحق قبل بداية كل يوم تدريب.
- لتوليد أنثى تزاوج الذباب لاستخدامها المدربين والجماعات زوج من 10 أنثى عذراء الذباب مع الذباب الذكور 15 عن طريق التقليب واحد القارورة التي تحتوي على الذكور إلى الإناث حساب المشتركining قنينة 16-18 ساعة قبل مرحلة التدريب (الخطوة 2.1) 10.
2. خطوات التجريبية
- إعداد مرحلة التجربة
- بدء التجربة في أقرب وقت ممكن لبداية المرحلة الخفيفة في الحاضنة. وضع الإناث مدرب (سواء البكر وتزاوج) في غرفة السلوك.
ملاحظة: من المستحسن إجراء التجربة في غرفة السلوك، أو أي بيئة منعزلة وهذا هو الهدوء وتعيين إلى 25 درجة مئوية، و60-65٪ RH. حفظ الرطوبة أكثر من 50٪ من المهم جدا، منذ الخطوبة والتزاوج السلوكالصورة تعتمد على الاستشعار فرمون، والذي يعرف أن تكون حساسة للرطوبة.
- بدء التجربة في أقرب وقت ممكن لبداية المرحلة الخفيفة في الحاضنة. وضع الإناث مدرب (سواء البكر وتزاوج) في غرفة السلوك.
- فضح الذباب الذكور إلى الخبرات مجزية وnonrewarding
- ترتيب قارورة زجاجية تحتوي الذباب الذكور واحدة على رفوف microcentrifuge ل، وتحديد المواقع قارورة على هامش الرف.
ملاحظة: يسمح هذا الترتيب المجرب بسهولة مراقبة أزواج من الذباب الذي يخضع الجماع دون أخذ قارورة خارج الحامل. - إعداد (كما هو موضح في الخطوة 2.2.1) 2 مجموعات من 100 قارورة زجاجية تحتوي ذكر واحد يطير على رفوف منفصلة للذكور تمر الخبرات التزاوج مجزية وnonrewarding (أي رفض وتزاوج).
- نضح الإناث المدرب وإضافتها إلى كل قارورة تحتوي على الذباب الذكور. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 1 ساعة. بدءا من الحركة رفضت، إضافة الأنثى تزاوج إلى كل قارورة. ثم، ننتقل إلى الذكور إلى أن تزاوج وإضافة الأنثى البكر على كل قارورة.
- مشاهدة لقاءات التزاوج عن كثبللتأكد من أن الذكور التفاعل مع الإناث البكر تتزاوج بنجاح خلال الساعة الأولى وأن الذكور التفاعل مع الإناث تزاوج سابقا لا تتزاوج. لمراقبة الفوج رفض على مدى 1 ساعة، وضع جهاز توقيت ثان لمدة 15 دقيقة ومشاهدة الرجال كل 15 دقيقة.
- أداء الذكور من الفوج رفض أن تمكنت من التزاوج والذكور من الفوج تزاوج التي لم ينتهي التزاوج في نهاية الدورة التدريبية الأولى.
- الانتهاء من الدورة التدريبية الأولى بواسطة الشفط من المدربين الإناث تزاوج سابقا في قارورة الغذاء ذبابة العادية، والاحتفاظ بها للدورة تكييف المقبلة. اتبع هذه الخطوة بواسطة الشفط بلطف الإناث من مجموعة من الرجال تزاوج.
- السماح للذباب الراحة لمدة 1 ساعة.
- كرر الخطوات من 2.2.3 - 2.2.7 مرتين.
- تكرار دورة تدريبية في الخطوات 2.2.3 - 2.2.8 كل يوم لمدة 3 المزيد من د.
- ترتيب قارورة زجاجية تحتوي الذباب الذكور واحدة على رفوف microcentrifuge ل، وتحديد المواقع قارورة على هامش الرف.
- استهلاك تسجيل (CAFE)
- في نهاية conditionin الماضيجلسة ز (اليوم الرابع)، نضح الذكور واحدة وتجميعها في قارورة الشعرية المغذية. استخدام المكونات لينة لتغطية قارورة الشعرية المغذية حين إدراج الذباب، واستبدالها بسرعة مع الشعرية المغذية المكونات الجاهزة بعد أن تم إدراج كل الذباب. المجموعة 6-8 الذباب من كل مجموعة من المجموعات التجريبية في قارورة، وخلق ما لا يقل عن 8 قارورة في حالة.
- الرطب المقابس عن طريق إضافة بلطف 5 مل من الماء إلى الأعلى من المكونات. كن حذرا مع إضافة الماء لتجنب تسرب في قارورة. إضافة مبلغ مساو من الماء لكل قارورة.
ملاحظة: يتم ذلك خطوة للحد من تبخر من الشعيرات الدموية. لذلك، ويتكرر ذلك كل يوم لبقية التجربة. اعتمادا على الرطوبة النسبية، قد الأيام التالية تتطلب كميات أقل من المياه التي يمكن ان تضاف إلى المقابس. - إعداد حلين الغذائية منفصلة عن طريق إضافة الإيثانول أو المياه إلى قسامات المخزون الغذائي لخلق التركيز النهائي من 15٪.
- لملء capillبرج الحمل مع حلول الطعام اثنين، وخلق 5 ميكرولتر قطرات المواد الغذائية السائلة على شريط الفيلم المختبرات ويسمح الحل لملء الشعرية حتى تصل إلى علامة 5 ميكرولتر. تأكد من استخدام نهاية واضحة للالشعرية، التي هي قريبة إلى 5 ميكرولتر خط علامة سوداء.
ملاحظة: لملء عدة الشعيرات الدموية في آن واحد، فمن الممكن للاتصال 6-8 محولات الشعرية معا، واستخدامها كما إدراج إلى عقد الشعيرات الدموية. - الاستفادة من الشعيرات الدموية بلطف على قطاع البارافين لوضع حل الطعام بالضبط في علامة سوداء. ختم الشعيرات الدموية عن طريق غمس نهاية كل شعري إلى قطرات صغيرة من الزيوت المعدنية. هذه الخطوة تقلل من التبخر من الحل الغذاء.
- إدراج اثنين من الشعيرات الدموية التي تحتوي على الإيثانول واثنين من الشعيرات الدموية nonethanol تحتوي من خلال 4 محولات / أصحاب في المكونات حتى الجانبين المكشوفة من الشعيرات الدموية نظرة خاطفة بالكاد من المناطق الداخلية من (1 مم أو أقل من سطح المكونات) قنينة.
ملاحظة:الحفاظ على افتتاح الشعيرات الدموية القريبة من المكونات الرطب يقلل التبخر ويتيح سهولة الوصول إلى الطعام، كما الذباب يجلس عادة على المقابس وتسلق لأسفل على الشعرية تتعرض لتغذية. - بالإضافة إلى قارورة تحتوي على الذباب التجريبية، وإعداد قارورة وهمية دون الذباب. يخدم هذا التحكم لتقييم التبخر الطبيعي.
ملاحظة: محاولة للحفاظ على المواقع المساواة نسبيا من افتتاح الشعرية مقارنة مع المقابس، والاختلافات يمكن أن تؤدي إلى تبخر متغير ومضللة بيانات الاستهلاك. الحفاظ على رطوبة كافية أثناء التجربة ووضع فتحات الشعرية قدر الإمكان إلى المكونات الرطب، وانخفاض نسبة الرطوبة ومسافة كبيرة من المكونات الرطب يمكن على حد سواء نتيجة التبخر غير المنضبط. - تسجيل موقف النسبي من السائل في كل من الشعيرات الدموية فيما يتعلق خط علامة سوداء في ملم باستخدام المسطرة، وكتابة هذه القيم إلى أسفل.
ملاحظة: إذا تم وضع حل بالضبط في لتر الأسودالمعهد الوطني للإحصاء، يجب أن تساوي القيمة صفر، وإذا كان أعلى أو أدنى، ينبغي أن يكون القيم الإيجابية أو السلبية، على التوالي. المستويات الأولية من السائل تعيين نقاط مرجعية للقيم الاستهلاك يا النهائي / N. - تعيين قارورة مرة أخرى في حاضنة لمدة 24 ساعة. استبدال الشعيرات الدموية في وقت ثابت في كافة مراحل التجربة برمتها.
- إزالة الشعيرات الدموية بلطف من قارورة وقياس مستويات السائل فيما يتعلق خط علامات سوداء.
- التحقق بعناية من مستوى السائل في قارورة وهمية.
ملاحظة: إذا انخفضت مستويات أكثر من 2 ملم، فإنه يشير إلى أن التبخر عالية ومستويات الاستهلاك لا يمكن الاعتماد عليها. - بلل المقابس بلطف مع 2 مل من الماء وتضاف مجموعة جديدة من الشعيرات الدموية، كما هو مبين في الخطوات 2.3.3 - 2.3.10. تعيين قارورة مرة أخرى في حاضنة لمدة 24 ساعة.
- تحديد تفضيل
- حساب الاستهلاك الإجمالي لكل الشعرية بطرح المستوى النهائي من أنامستوى nitial في نقطة الانطلاق.
- الجمع بين قيم كل من الشعيرات الدموية مع نفس الطعام (أي nonethanol الشعيرات الدموية بشكل منفصل من الشعيرات الدموية التي تحتوي على الإيثانول).
- حساب الإيثانول تفضيل بطرح الكمية المستهلكة من الشعيرات الدموية غير الايثانول من الكمية المستهلكة من الشعيرات الدموية التي تحتوي على الإيثانول وتقسيم القيمة الإجمالية قيم الاستهلاك من جميع الشعيرات الدموية في نفس القارورة.
- متوسط المؤشرات تفضيل كل قارورة من نفس المجموعة التجريبية.
ملاحظة: Nonethanol 1 (NE1)، Nonethanol 2 (NE2)، والإيثانول 1 (E1)، والإيثانول 2 (E2)، إجمالي nonethanol (عدد NE) = NE1 + NE2، مجموع الإيثانول (عدد E) = E1 + E2، إجمالي المبلغ مؤشر استهلاك (مجموع) = إجمالي NE + توتال، والإيثانول تفضيل (PI)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FPreviously، Devineni وآخرون. أظهرت أنه عندما تعطى ذباب الفاكهة خيار تستهلك المواد الغذائية التي تحتوي على الإيثانول، لأنها تكشف تفضيل قوي للأغذية التي تحتوي على الإيثانول على nonethanol تحتوي على المواد الغذائية 6. يظهر هنا بعض نتائج ممثل حصلنا عليها عندما يعاير تفضيل الإيثانول الفطري من الذباب الذكور الساذجة التي لا تخضع لبروتوكول التدريب.
تم جمع السذاجة كانتون S الذباب الذكور على eclosion، البالغ من العمر حتى من العمر 4 يوما، ويعاير عن تفضيلها الفطري للاستهلاك الإيثانول على مدى 4 د (الشكل 2). تحليل كميات المستهلكة من البرامج حلول ethanol- والتي تحتوي على nonethanol التي تطير معرض تفضيل قوي للدول المستهلكة 15٪ من الإيثانول الطعام على الطعام nonethanol (الشكل 2).
باستخدام معارضة الجنسيالتجارب، ونحن قد أظهرت في وقت سابق ان الذباب الذكور أن سمح لزميله في مجموعات ( "تزاوج-مجمعة") عرض أقل تفضيل الإيثانول من الذكور يضم منفردة والتي تم رفضها من قبل الإناث تزاوج سابقا ( "رفض معزولة"). استخدمنا عدة ضوابط لفك الارتباط بين تجربة السكن من الخبرة ذات الصلة التزاوج وأظهر أن تفضيل التفاضلية النتائج من تجربة التزاوج 5.
باستخدام بروتوكول التدريب المذكور هنا، ولدت لنا تزاوج منفردة ورفض الذباب الذكور التي خضعت الأنظمة الإسكان والتزاوج مماثلة. وتعرض واحد من الذكور كانتون S الذباب على مدار 4 د لتجارب التزاوج المختلفة. وسمح لفئة واحدة من الذكور للتفاعل وتتزاوج مع إناث الذباب البكر (واحد الفوج تزاوج)، وكان تدريب الفوج أخرى مع الذباب الإناث تزاوج سابقا (واحد فوج رفض). وبعد مرحلة التدريب، والذكور واحدة جيئة وذهابام تم تجميع الأفواج اثنين (8 / القارورة) ووضعها في قارورة الشعرية المغذية. تم تسجيل استهلاك الإيثانول الطوعي لمدة 4 د (الشكل 3A). تم احتساب الأفضلية لاستهلاك الإيثانول من بيانات الاستهلاك باستخدام الصيغة في خطوة 2.4 (الشكل 3B). وتشير القيم الإيجابية تفضيل المواد الغذائية التي تحتوي على الإيثانول، والقيم السالبة تشير الى النفور من الطعام التي تحتوي على الإيثانول.
التجربة الحالية تدعم نتائجنا السابقة، مما يشير إلى أن تجربة جنسية، وليس حالة السكن، ينظم استهلاك الإيثانول. التزاوج الناجح يزيد من مستويات المكافأة الداخلية، والذي بدوره يقلل من استهلاك الإيثانول. الرفض، ينظر إليها على أنها نقص الثواب، ويؤدي إلى زيادة في سلوك التماس مكافأة (الشكل 3B).
الشكل 2. مثال الأفضلية الفطري لدى المستهلك الايثانول. تم تجميع الذكور WT ساذجة في مجموعات من 8 ذكور / القارورة، وسجلت استهلاكهم للحلول ethanol- والتي تحتوي على nonethanol على مدار 96 ساعة. الذباب تستهلك كمية أكبر من 15٪ من الإيثانول containinز الغذائية (** P <0.01، *** P <0.001، في اتجاهين التدابير المتكررة أنوفا مع بونفيروني بعد الاختبارات، ن = 8). البيانات المعروضة هي متوسط + SEM أو تعني - SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. التجارب التزاوج المتضاربة mModulate الإيثانول الأفضلية. (A) رسم تخطيطي للبروتوكول مجتمعة. يسمح واحدة الذكور WT البكر لتتزاوج مع الإناث البكر أو يخضعن إلى 3x دورات تدريبية الخطوبة-قمع 1H (كما هو مبين "T") متباعدة من قبل 1 ساعة للراحة (كما هو مبين "R"). ويتكرر التدريب لمدة 4 د. في نهاية كل يوم، يتم وضع الذباب في الحاضنة (كما هو مبين "ON"). بعد 4 د للتدريب، وضعت الذكور في قوارير حيث يمكن أن تختار لإطعام منالشعيرات الدموية التي تحتوي على حلول الغذاء مع أو بدون 15٪ من الإيثانول. رفض (ب) واحدة من الذكور أظهرت أعلى الإيثانول تفضيل الذكور من تزاوج واحدة (** P <0.01، في اتجاهين المتكررة تدابير ANOVA مع بونفيروني بعد الاختبارات، ن = 9، المقارنات بين مجموعات العلاج عبر 3 د بعد نهاية تدريب). البيانات المعروضة هي متوسط + SEM أو تعني - SEM. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| قسم المراجع | الملاحظات |
| 1.1 | يمكن استخدامها في العديد من التجارب |
| 1.2 | يمكن الاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية لعدة أسابيع |
| 1.3 | نضع في 4 درجة مئوية بعد الأوتوكلاف |
| 1.4 | الذين تتراوح أعمارهم بين ل3-4 د قبلالمستخدمة في التجربة |
| 1.5 | وينبغي أن تأخذ هذه الخطوة مكان المساء قبل كل دورة تدريبية |
| 2.1 | وينبغي أن تأخذ هذه الخطوة مكان من صباح كل دورة تدريبية |
| 2.2 | أن يتكرر في 3 دورات تدريبية متتالية على مدى 4 د |
| 2.3 | تفريغ المقابس مع الماء، وقياس الاستهلاك واستبدال الشعيرات الدموية على مدار 4 د |
| 2.4 | تتم هذه الخطوة في كل مرة قبل استبدال الشعيرات الدموية خلال فحص الاختيار اثنين |
الجدول 1. لمحة عامة عن تصور النظام وتدفق الوقت للخطوات المختلفة البروتوكول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
نشكر U. Heberlein وA. Devineni للمناقشات طويلة الأمد والمشورة الفنية. كما نشكر أعضاء مختبر شوحط-أوفير، A. Benzur، L. القزاز، وO. شالوم، من أجل المساعدة في إظهار الأسلوب. تقدير خاص يذهب إلى اليعازر كوستي لإقامة أنظمة الطيران في المختبر. وأيد هذا العمل من قبل مؤسسة العلوم اسرائيل (384/14) وكوري الوظيفي التكامل المنح ماري (CIG 631127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
- Robinson, G. E., Fernald, R. D., Clayton, D. F. Genes and social behavior. Science. 322, 896-900 (2008).
- Koob, G. F. Neurobiological substrates for the dark side of compulsivity in addiction. Neuropharmacol. 56, Suppl 1 18-31 (2009).
- Kaun, K. R., Devineni, A. V., Heberlein, U. Drosophila melanogaster as a model to study drug addiction. Hum Genet. 131, 959-975 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Addiction-like behavior in Drosophila. Commun Integr Biol. 3, 357-359 (2010).
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr Biol : CB. 19, 2126-2132 (2009).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Ejima, A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D., Griffith, L. C. Sequential learning of pheromonal cues modulates memory consolidation in trainer-specific associative courtship conditioning. Curr Biol. 15, 194-206 (2005).
- Ejima, A., et al. Generalization of courtship learning in Drosophila is mediated by cis-vaccenyl acetate. Curr Biol. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Xu, S., et al. The propensity for consuming ethanol in Drosophila requires rutabaga adenylyl cyclase expression within mushroom body neurons. Genes Brain Behav. 11, 727-739 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annu Rev Neurosci. 36, 121-138 (2013).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PloS one. 9, 101107 (2014).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste Circuit that Regulates Ingestion by Integrating Food and Hunger Signals. Cell. 165, 715-729 (2016).
- Peru, Y. C., et al. Long-lasting, experience-dependent alcohol preference in Drosophila. Addict Biol. 19, 392-401 (2014).
- Dus, M., et al. Nutrient Sensor in the Brain Directs the Action of the Brain-Gut Axis in Drosophila. Neuron. 87, 139-151 (2015).
- Anderson, D. J., Adolphs, R. A framework for studying emotions across species. Cell. 157, 187-200 (2014).
- Gibson, W. T., et al. Behavioral responses to a repetitive visual threat stimulus express a persistent state of defensive arousal in Drosophila. Curr Biol. 25, 1401-1415 (2015).
