Summary
Wir beschreiben ein Protokoll zur Induktion lohnend und nonrewarding Erfahrungen in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) mit freiwilligen Ethanolkonsum als Maß für Änderungen in Lohn Staaten.
Abstract
Wir beschreiben ein Protokoll zur Messung von Ethanol Selbstverwaltung in Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) als Proxy für Änderungen in Lohn Staaten. Wir zeigen einen einfachen Weg in die Fliege Belohnungssystem zu erschließen, zu modifizieren Erfahrungen natürliche Belohnung im Zusammenhang, und freiwillige Ethanolkonsum als Maß für Änderungen in Lohn Staaten verwenden. Der Ansatz dient als relevantes Instrument, um die Neuronen und Gene zu untersuchen, die eine Rolle in Erfahrung vermittelten Veränderungen der internen Zustand spielen. Das Protokoll besteht aus zwei getrennten Teilen: die Fliegen zu belohnen und nonrewarding Erfahrungen auszusetzen und Testen freiwillige Ethanolkonsum als Maß für die Motivation, ein Medikament Belohnung zu erhalten. Die beiden Teile können unabhängig die Modulation der Erfahrung als erster Schritt zur weiteren Downstream-Assays oder als eine unabhängige zwei Wahl Fütterungsassay bzw. zu induzieren verwendet werden. Das Protokoll ist kein kompliziertes Setup erforderlich und kann daher in jedem laborator angewendet werdeny mit grundlegenden fly Kultur-Tools.
Introduction
Änderung des Verhaltens in Reaktion auf Erfahrung erlaubt Tiere ihr Verhalten auf Veränderungen in ihrer Umgebung 1 einzustellen. Während dieses Prozesses Tiere integrieren ihre internen physiologischen Zustand mit den sich ändernden Bedingungen der äußeren Umgebung und anschließend eine Aktion über die andere wählen, um ihre Chancen auf das Überleben und die Fortpflanzung zu erhöhen. Belohnungssysteme entwickelt Verhaltensweisen zu motivieren , die für das Überleben der Individuen und Arten erforderlich sind , durch Verhaltensweisen verstärken , die das unmittelbare Überleben verbessern, wie Essen oder Trinken, oder solche , die für zwei Nachkommen langfristige Überleben, wie Sexualverhalten oder Pflege zu gewährleisten. Künstliche Verbindungen wie Drogen wirken sich auch auf Belohnungssysteme durch Kooptierung Nervenbahnen , die natürliche Belohnungen 2 vermitteln.
In den letzten zwei Jahrzehnten die Fruchtfliege Drosophila melanogaster hat sich als viel versprechendes Modell etabliert für die Untersuchung der Molekdere und neuronalen Mechanismen, die die Auswirkungen von Ethanol auf das Verhalten 3,4 prägen.
Zuvor haben wir Droge Belohnungen 5 eine Untergruppe von peptidergen Neuronen in Fliegen (NPF / NPF - Rezeptor (R) Neuronen) , dass die paar natürliche Belohnungen, wie sexuelle Erfahrung, um die Motivation zu erhalten , identifiziert. NPF Ausdruck ist empfindlich gegenüber den beiden sexuellen Erfahrungen und Drogen Belohnungen, wie Ethanol Rausch. Änderungen in NPF Expressionsniveaus sind Änderungen in Ethanol Selbstverwaltung 5, umgewandelt , wo hohe NPF reduziert und niedrige NPF erhöht die Präferenz Ethanol zu konsumieren. NPF Neuronen aktivierenden ist lohnend für Fliegen, wie sie für einen Geruch, der mit der Aktivierung gepaart starke Präferenz anzuzeigen, die auch durch eine reduzierte Ethanolverbrauch niederschlägt. Noch wichtiger ist, stört die Aktivierung von NPF Neuronen mit der Fähigkeit von Fliegen eine positive Assoziation zwischen Ethanolintoxikation und einem Geruchs Stichwort zu bilden. Der Kausalzusammenhang zwischen dem NPF / RSystem, Belohnungs Speicher und Ethanolkonsum legt nahe , dass ein Ethanol - Selbstverabreichung als Maß für Änderungen in Belohnungs Staaten 5 verwenden.
In dieser Veröffentlichung zeigen wir einen integrierten Ansatz für die Erschließung des Fliegen natürliche Belohnungssystem und das Testen Veränderungen in Lohn Staaten. Der Ansatz besteht aus zwei separaten Teilen, einem Trainingsprotokoll für natürliche Belohnung bezogene Erfahrungen zu manipulieren, gefolgt von einer zwei Wahl Kapillare Feeder-Assay (CAFE) Ethanol Selbstverwaltung als eine Schätzung für Änderungen in Lohn Staaten zu beurteilen. Die CAFE - Test ist analog zu den zwei-Flasche Wahl Assays in Studien an Nagetieren für Drogenselbstverwaltung verwendet und wurde 6 in Fliegen gezeigt , bestimmte Eigenschaften von suchtartiges Verhalten zu reflektieren.
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Protocol
Anmerkung: Allgemeine Übersicht über das Versuchsdesign: Die Versuchsanordnung umfasst einen angepaßten Protokoll für courtship Unterdrückung 7-9 , in dem männlichen Fliegen ausgesetzt Belohnen und nonrewarding Erfahrungen in 3 aufeinander folgenden Trainingseinheiten im Laufe von 4 d. 4 d - am Ende der Erfahrung Phase werden die Fliegen für 3 in einem Zwei-choice freiwillige Ethanolaufnahme-Assay getestet. Das Protokoll umfasst hierin mehrere vorbereitende Schritte, von denen einige im Voraus durchgeführt werden in mehr als ein Versuch verwendet werden, während andere in rechtzeitig vor Beginn des Experiments (Tabelle 1) zu nehmen.
1. Vorbereitende Schritte
- Vorbereiten des kapillaren Vorsystem
- Erhitzen Sie eine 27 G - Nadel und es verwenden , kleine Löcher entlang einer Phiole (Abbildung 1) zu durchstechen.
- Schneiden Sie das Fläschchen Stecker in die Hälfte (über Kreuz) mit einer Rasierklinge. Mark vier Punkte auf der Oberfläche des Stopfens, die Schaffung eines square Form der Kapillare Halter zu positionieren in. Verwenden Sie eine 18 G - Nadel 4 Löcher durch den Stopfen (1b) zu machen.
- Verwenden Sie eine Rasierklinge Mikropipetten zu schneiden, so dass sie fest 5 ul Glaskapillaren halten kann, die als Adapter dienen.
- Legen Sie 4 Kapillar-Adapter in die vorbereiteten Stecker.
- Markieren Sie die Position der 2 Ethanol- und zwei nonethanol enthaltenden Kapillaren auf dem Stecker.
Hinweis: Es empfiehlt sich, die Positionen der zwei Arten von Kapillaren konsistent über alle Fläschchen zu halten. Achten Sie auf die Größe der Löcher, wie große Löcher das Entweichen von Fliegen aus den Fläschchen zu ermöglichen. Darüber hinaus wird empfohlen, die glatte Seite des Steckers zu verwenden (in der Regel gegenüber der Schnittseite) als der Seite, die nach unten gerichtet ist, wenn in das Fläschchen eingeführt, wie Schneiden Sie den Stecker einige kleine, lose Fasern erzeugt, die die Fliegen verheddern kann . - Bereiten Sie eine große Anzahl von Ampullen und Adapter für die Kapillar-Feeder-System verwendet werden (CAFE)Experimente in Schritt 2.3 beschrieben.
- Vorbereiten kleinen Glasfläschchen Lebensmittel
- Einen Tag vor der Fliegen (Schritt 1.4) zu sammeln, ordnen 200 Glasfläschchen auf Mikrozentrifugenröhrchen Racks. Melt fliegen Essen (nach dem cornmeal Melasse Rezept finden Sie in der Tabelle der Materialien) unter Verwendung einer Mikrowelle. Gießen 2 ml Fliege Nahrung in die Glasfläschchen (versuchen Sie nicht, das Essen auf den Fläschchen Wände zu schmieren). Lassen Sie die Lebensmittel verhärten, und decken die Fläschchen mit Plastikfolie.
HINWEIS: Die Glasfläschchen die Lebensmittel enthalten, können bei 4 ° C mehrere Wochen lang aufbewahrt werden. - Am Tag der Fliege Sammlung, nehmen Sie die Fläschchen aus dem Kühlschrank und lassen Sie sie RT erreichen, bevor Sie sie Fliegen zu beherbergen.
HINWEIS: Wenn das Essen Fläschchen mehrere Wochen alt sind, stellen Sie sicher, dass das Essen immer noch intakt ist und nicht aus dem Fläschchen freistehend, wie Fliegen in den Ritzen zwischen dem Essen und dem Glas gefangen werden.
- Einen Tag vor der Fliegen (Schritt 1.4) zu sammeln, ordnen 200 Glasfläschchen auf Mikrozentrifugenröhrchen Racks. Melt fliegen Essen (nach dem cornmeal Melasse Rezept finden Sie in der Tabelle der Materialien) unter Verwendung einer Mikrowelle. Gießen 2 ml Fliege Nahrung in die Glasfläschchen (versuchen Sie nicht, das Essen auf den Fläschchen Wände zu schmieren). Lassen Sie die Lebensmittel verhärten, und decken die Fläschchen mit Plastikfolie.
- Herstellung Stock Lebensmittel Lösung für die Kapillare Feeder-Assay
- Um vorpare die Lager Lebensmittel-Lösung (5% Saccharose und 5% Hefeextrakt), lösen sich 5,88 g Hefeextrakt und 5,88 g Saccharose in 100 ml destilliertem Wasser.
HINWEIS: Die Stammlösung zu einer Kontamination sehr anfällig ist. Daher empfiehlt es sich im Autoklaven (121 ° C, 30 min, und ohne einen Trocknungszyklus) und Aliquot sie in 850 & mgr; l Aliquots arbeiten bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden. Die Konzentration der Bestandteile in der Stammlösung ist 5,88% und die Endkonzentration von 5% nach der Zugabe von 15% Ethanol oder Wasser (150 & mgr; l in 850 & mgr; l premade Nahrungslösung) unmittelbar vor ihrer Verwendung in Schritt 2.3 erreichen.
- Um vorpare die Lager Lebensmittel-Lösung (5% Saccharose und 5% Hefeextrakt), lösen sich 5,88 g Hefeextrakt und 5,88 g Saccharose in 100 ml destilliertem Wasser.
- Sammeln experimentellen Fliegen
- Sammeln Sie 200 naiven männlichen Fliegen ein CO 2 Pad.
Hinweis: Verwenden Sie einen beliebigen Laborstamm relevant für die experimentelle Frage. 250 Fliegen können leicht von fünf Flaschen von Fliegen an ihrem Schlüpfen Pick Phase gesammelt werden. Wenn die Fliegen zu sammeln, achten Sie genau auf collect Fliegen, die kürzlich geschlüpften (virgin aussehenden Fliegen: helle Fliegen mit einem Mekonium Fleck auf ihren Bauch) haben. Experimentelle Fliegen sollten einzeln in kleinen Glasfläschchen mit Nahrung und im Alter von bis zu 3 gehalten werden - 4 d alt, bevor sie in dem Experiment verwendet wird. - Verwenden Sie weiche Stecker die Fläschchen zu schließen.
Anmerkung: Die gleiche weiche Stecker für die Trainingsphase sehr nützlich sein wird, wenn Mund Aspiration unter Verwendung von Frauen einzusetzen, in die und aus den Fläschchen während der Erfahrung Phase.
- Sammeln Sie 200 naiven männlichen Fliegen ein CO 2 Pad.
- Sammeln Trainer Fliegen
HINWEIS: Alle gesammelten Fliegen sollte in einem 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Inkubator bei 25 ° C und 70% relativer Luftfeuchtigkeit (RH) gehalten werden. Die 12 h / 12 h Hell / Dunkel-Zyklus kann auf eine bequeme Startzeit geändert werden.- Virgin weibliche Trainer Fliegen
- Sammeln Sie 500 jungfräulichen weiblichen Trainer fliegt von einem WT Lager oder einem virginator Lager für die Verwendung als jungfräuliche rezeptiven Weibchen. Halten Sie die weiblichen Fliegen in Gruppen von 25 pro Essen Fläschchen in Normalgröße, und alleow sie Alter von 3 bis 4 d alt, bevor sie in dem Experiment verwendet wird.
- Gepaart weibliche Trainer Fliegen
- Sammeln Sie 300 jungfräulichen weiblichen Fliegen von einem WT Lager oder einem virginator Lager Paarung vor der Trainingsphase (Schritt 1.6.1) zu unterziehen.
HINWEIS: Weibliche Fliegen werden in Gruppen von 10 Frauen pro Normalgröße, Lebensmittel Fläschchen und im Alter von bis zu 3 gehalten - 4 d alt, bevor sie in dem Experiment verwendet wird.
- Sammeln Sie 300 jungfräulichen weiblichen Fliegen von einem WT Lager oder einem virginator Lager Paarung vor der Trainingsphase (Schritt 1.6.1) zu unterziehen.
- Männliche Fliegen verwendet gestecktem weibliche Trainer Fliegen zu erzeugen
- Sammeln Sie 150 männlichen Fliegen (nicht notwendigerweise Jungfrau).
HINWEIS: Flies werden in Gruppen von 15 Männern pro Normalgröße, Lebensmittel Fläschchen und im Alter von bis zu 3 gehalten - 4 d alt, bevor sie mit jungfräulichen Weibchen gepaart werden fliegt die gepaart Trainer Frauen zu schaffen.
- Sammeln Sie 150 männlichen Fliegen (nicht notwendigerweise Jungfrau).
- Virgin weibliche Trainer Fliegen
- Die Erzeugung gepaart weiblichen Trainer Fliegen
- gestecktem weiblich generieren fliegt als Trainer verwendet werden, Paargruppen von 10 jungfräulichen Weibchen fliegt mit 15 männlichen fliegt von einem männlichen haltigen Spiegeln Fläschchen in ein weibliches-contaFläschchen ining 16 bis 18 h vor der Trainingsphase (Schritt 2.1) 10.
HINWEIS: Dies sollte in der Regel am Abend stattfinden, bevor die Trainingseinheit. Das Verhältnis 1,5: 1 zwischen männlichen fliegt weibliche Fliegen stellt sicher, dass alle Weibchen verpaart werden. - Am Tag des Experiments, trennen die zusammengefügten Weibchen von den Männchen von den Männchen aus dem Fläschchen Ansaugen einer Mund Aspirator verwenden. Führen Sie diese kurz vor Beginn eines jeden Trainingstag.
- gestecktem weiblich generieren fliegt als Trainer verwendet werden, Paargruppen von 10 jungfräulichen Weibchen fliegt mit 15 männlichen fliegt von einem männlichen haltigen Spiegeln Fläschchen in ein weibliches-contaFläschchen ining 16 bis 18 h vor der Trainingsphase (Schritt 2.1) 10.
2. Experimentelle Schritte
- Einstellen der Erfahrung Phase bis
- Startet das Experiment so nahe wie möglich an den Beginn der Lichtphase in den Inkubator. Legen Sie die Trainer Weibchen (beide Jungfrau und gepaart) im Verhalten Kammer.
HINWEIS: Es wird empfohlen, das Experiment in einem Verhalten Kammer oder über abgeschiedenen Umgebung auszuführen, die auf 25 ° C ruhig und gesetzt ist und 60 bis 65% relative Luftfeuchtigkeit. Luftfeuchtigkeit über 50% zu halten, ist sehr wichtig, da das Verhalten der Balz und Paarungs hängen von Pheromonerkennung, die auf Feuchtigkeit empfindlich zu sein bekannt ist.
- Startet das Experiment so nahe wie möglich an den Beginn der Lichtphase in den Inkubator. Legen Sie die Trainer Weibchen (beide Jungfrau und gepaart) im Verhalten Kammer.
- Offenlegen von männlichen Fliegen zu belohnen und nonrewarding Erfahrungen
- Ordnen Sie die Glasfläschchen, die einzelnen männlichen Fliegen auf Mikro Racks enthält, die Positionierung der Fläschchen entlang der Ränder des Racks.
HINWEIS: Diese Anordnung ermöglicht es dem Experimentator auf einfache Weise die Paare von Fliegen beobachten, die Kopulation unterziehen, ohne dass die Fläschchen aus dem Rack nehmen. - Bereiten Sie zwei Gruppen von 100 Glasfläschchen mit einzelnen Männchen fliegt auf separaten Racks für Männer (wie in Schritt 2.2.1 beschrieben) unterzogen lohnend und nonrewarding Paarungs Erfahrungen (dh abgelehnt und gesteckten Zustand).
- Absaugen Trainer Weibchen und fügen Sie sie in jedes Fläschchen die männlichen Fliegen enthält. Stellen Sie den Timer für 1 h. Beginnend mit der abgelehnten Gruppe, fügen Sie zu jedem Fläschchen ein verbundenes Weibchen. Dann fahren Sie mit den Männchen gepaart werden und eine Jungfrau weiblich zu jedem Fläschchen hinzuzufügen.
- Sehen Sie sich die Paarung Begegnungen engum sicherzustellen, dass die zusammenwirkenden Männchen mit jungfräulichen Weibchen erfolgreich innerhalb der ersten Stunde paaren und dass die Männchen mit den zuvor begattete die Interaktion nicht paaren. Um die abgelehnte Kohorte im Laufe von 1 h überwachen, einen zweiten Zeitgeber für 15 min eingestellt und die Männchen alle 15 Minuten beobachten.
- Entladen Sie die Männer von der abgelehnten Kohorte, die aus der verpaart Kohorte paaren und Männern verwaltet, die nicht bis zum Ende der ersten Trainingseinheit am Ende hat der Paarung.
- Beenden Sie die erste Trainingseinheit durch Absaugen aus der zuvor gepaart weiblichen Trainer in einen regelmäßigen Fliegen Essen Fläschchen, und halten Sie sie für die nächste Sitzung Anlage. Folgen Sie dieser Schritt sanft die Weibchen aus der verpaart männliche Gruppe Absaugen.
- Lassen Sie die Fliegen für 1 Stunde ruhen.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.2.3 - 2.2.7 zweimal.
- Wiederholen Sie die Trainingseinheit in den Schritten 2.2.3 - 2.2.8 jeden Tag für 3 weitere d.
- Ordnen Sie die Glasfläschchen, die einzelnen männlichen Fliegen auf Mikro Racks enthält, die Positionierung der Fläschchen entlang der Ränder des Racks.
- Aufnahmeverbrauch (CAFE)
- Am Ende des letzten conditioning Sitzung (vierter Tag), aspirieren die einzelnen Männchen und gruppieren sie in die Kapillare Feeder-Fläschchen. Verwenden Sie einen weichen Stecker der Kapillare Zubringer Fläschchen zu bedecken, während die Fliegen einfügen und ersetzen Sie es schnell mit der gebrauchsfertigen Kapillare Feeder-Stecker nach alle Fliegen eingefügt wurden. Gruppe 6 - 8 Fliegen von jedem der Versuchsgruppen in ein Fläschchen, nicht weniger als acht Ampullen pro Zustand zu schaffen.
- Befeuchten Sie die Stecker vorsichtig 5 ml Wasser an die Spitze des Steckers hinzufügen. Seien Sie vorsichtig, während die Zugabe von Wasser Verschütten in die Fläschchen zu vermeiden. Hinzufügen gleichen Menge Wasser in jedes Fläschchen.
HINWEIS: Dieser Schritt wird durchgeführt Verdampfung aus den Kapillaren zu reduzieren. Daher wird es jeden Tag für den Rest des Experiments wiederholt. In Abhängigkeit von der relativen Feuchtigkeit erfordern die folgenden Tagen kann weniger Wasser zu den Steckern hinzugefügt werden. - Bereiten Sie zwei getrennte Lebensmittel Lösungen von Ethanol oder Wasser in die Lager Lebensmittel Aliquots Zugabe einer Endkonzentration von 15% zu schaffen.
- Zum Befüllen des capillWidder mit den beiden Lebensmittel-Lösungen erstellen 5 ul flüssige Lebensmittel auf einer Labor-Filmstreifen fällt und damit die Kapillare die Lösung zu füllen, bis sie die 5 ul Marke erreicht. Achten Sie darauf, das klare Ende der Kapillare zu verwenden, die auf die 5 & mgr; l schwarze Markierung Linie in der Nähe ist.
HINWEIS: Zum Befüllen auf einmal mehrere Kapillaren, ist es möglich, 6 zu verbinden - 8 Kapillar-Adapter zusammen und nutzen sie als Einsatz in die Kapillaren zu halten. - Tippen Sie auf die Kapillaren sanft auf dem Paraffinstreifen die Nahrungs Lösung genau an der schwarzen Markierung zu positionieren. Abdichten der Kapillaren durch Eintauchen des Endes jeder Kapillare in kleine Tropfen Mineralöl. Dieser Schritt minimiert potentielle Verdunstung der Nahrungsmittellösung.
- Legen Sie zwei ethanolhaltigen Kapillaren und zwei nonethanol enthält Kapillaren durch die 4-Adapter / Halter im Stecker, bis die freiliegenden Seiten der Kapillaren kaum aus dem Inneren des Fläschchens (1 mm oder weniger von der Steckeroberfläche) Peek.
HINWEIS:Halten Sie die Öffnung der Kapillaren nahe der nassen Stecker verringert die Verdunstung und ermöglicht den einfachen Zugriff auf das Essen, wie Fliegen normalerweise an den Steckern sitzen und auf der freiliegenden Kapillare hinunterklettern zu ernähren. - Neben Fläschchen, die experimentelle Fliegen enthalten, bereiten ein Mock-Fläschchen ohne Fliegen. Diese Steuerung dient natürliche Verdunstung zu beurteilen.
HINWEIS: Versuchen relativ gleiche Positionierung der Kapillaröffnung auf die Stecker Vergleich zu erhalten, da Unterschiede zu variable Verdampfung führen kann und die Verbrauchsdaten irreführend. Es ist für ausreichende Feuchtigkeit während des Experiments und positionieren Sie die Kapillaröffnungen so nah wie möglich an den nassen Stecker, wie niedrige Luftfeuchtigkeit und großer Entfernung von dem nassen Stecker kann sowohl Folge einer unkontrollierten Verdunstung. - Notieren Sie sich die relative Position der Flüssigkeit in jeder der Kapillaren in Bezug auf die schwarze Markierungslinie in mm mit einem Lineal, und schreiben Sie diese Werte nach unten.
HINWEIS: Wenn die Lösung ist so positioniert, genau an der schwarz line, sollte der Wert Null, gleich, und wenn es oben oder unten ist, sollte es positive oder negative Werte jeweils sein. Die Ausgangswerte der Flüssigkeit, die die Referenzpunkte für die letzten O / N Verbrauchswerte eingestellt. - Stellen Sie die Fläschchen zurück in den Inkubator für 24 Stunden. Ersetzen die Kapillaren bei einer konstanten Zeit während des gesamten Experiments.
- Entfernen Sie die Kapillaren sanft aus den Fläschchen und messen das Niveau der Flüssigkeit in Bezug auf die schwarze Markierungslinie.
- Prüfen Sie sorgfältig den Flüssigkeitsstand in der Mock-Fläschchen.
HINWEIS: Wenn die Pegel von mehr als 2 mm fallen gelassen, es zeigt an, dass Verdampfung hoch ist, und die Verbrauchswerte sind nicht zuverlässig. - Befeuchten Sie die Stecker vorsichtig mit 2 ml Wasser und legen Sie einen neuen Satz von Kapillaren, wie in den Schritten angegeben 2.3.3 - 2.3.10. Stellen Sie die Fläschchen zurück in den Inkubator für 24 Stunden.
- Bestimmen Präferenz
- Berechnen Sie den Gesamtverbrauch jeder Kapillare durch die letzte Stufe aus dem i subtrahiertnitial Pegel am Ausgangspunkt.
- Kombinieren , um die Werte der beiden Kapillaren mit dem gleichen Futter (dh nonethanol Kapillaren getrennt von Ethanol enthaltenden Kapillaren).
- Berechnen Ethanol bevorzugt, indem die Menge von den nicht-Ethanol Kapillaren aus der Menge aus den ethanolhaltigen Kapillaren verbraucht verbraucht subtrahieren und dividieren Sie den Wert durch die Summe der Verbrauchswerte von allen Kapillaren des gleichen Fläschchen.
- Durchschnittlich die Vorzugs Indizes aller Fläschchen der gleichen Versuchsgruppe.
HINWEIS: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Ethanol 1 (E1), Ethanol 2 (E2), Gesamt nonethanol (Total NE) = NE1 + NE2, Gesamt Ethanol (Total E) = E1 + E2, Gesamtsumme Verbrauch (Gesamtsumme) = Gesamt NE + Total E und Ethanol bevorzugt Index (PI)
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Representative Results
FPreviously, Devineni et al. zeigten , dass bei Fruchtfliegen die Wahl ethanolhaltigen Nahrung, sie zeigen eine starke Präferenz für ethanolhaltige Lebensmittel über nonethanol haltige Lebensmittel 6 zu konsumieren gegeben sind. Sehen Sie hier einige repräsentative Ergebnisse, die wir erhalten, wenn Untersuchung der angeborenen Ethanol bevorzugt von naiven männlichen Fliegen, die nicht das Trainingsprotokoll unterzogen worden sind.
Naïve Kanton S männliche Fliegen wurden auf Schlüpfen gesammelt, im Alter von bis zu 4 Tage alt, und für ihre angeborene Vorliebe getestet zu Ethanol im Laufe von 4 d (Abbildung 2) verbrauchen. Die Analyse der verbrauchten Mengen von Ethanol- und nonethanol haltigen Lösungen zeigt , dass für das Konsumieren von 15% Ethanol Nahrung über nonethanol Essen (Abbildung 2) zeigen eine robuste Präferenz fliegt.
Mit entgegengesetzten sexuellenErfahrungen haben wir bereits gezeigt, dass männliche Fliegen, die in Gruppen ( "gepaart gruppiert") Display niedriger Ethanol bevorzugt als einzeln untergebracht Männchen, die abgelehnt wurden von zuvor begattete ( "rejected-isoliert") zu paaren durften. Wir haben mehrere Kontrollen das Gehäuse Erfahrungen aus der Paarung bezogenen Erfahrung zu entkoppeln und zeigte , dass die Differenz Präferenz ergibt sich aus der Paarung Erfahrung 5.
Mit dem Trainingsprotokoll hier beschrieben, erzeugten wir einzeln schlüssigen und abgelehnt männlichen Fliegen, die ähnliche Gehäuse und Gegen Regime unterzogen. Alleinstehende Männer Kanton S Fliegen wurden im Laufe von 4 d zu unterschiedlichen Paarungs Erfahrungen ausgesetzt. Eine Kohorte von Männern wurde erlaubt zu interagieren und paaren sich mit jungfräulichen weiblichen Fliegen (Einzel gepaart Kohorte), und die andere Kohorte wurde geschult, um mit zuvor gepaart weiblichen Fliegen (Einzel abgelehnt Kohorte). Nach der Trainingsphase die einzelnen Männchen herm die beiden Kohorten wurden gruppiert (8 / Fläschchen) und in den kapillaren Feeder-Ampullen gegeben; ihre freiwillige Ethanolkonsum wurde 4 d (3A) aufgezeichnet. Die Präferenz Ethanol zu verbrauchen wurde aus den Verbrauchsdaten berechnet mit der Formel in Schritt 2.4 (3B) verwendet wird . Positive Werte zeigen eine Präferenz für ethanolhaltige Lebensmittel, und negative Werte zeigen Abneigung gegen ethanolhaltigen Lebensmitteln.
Das vorliegende Experiment unterstützt unsere bisherigen Erkenntnisse, was darauf hindeutet, dass die sexuelle Erfahrung, und nicht die Wohnverhältnisse, Ethanolkonsum moduliert. Erfolgreichen Paarung erhöht internen Belohnungs Ebenen, die wiederum ethanol Verbrauch senkt. Ablehnungen, als ein Mangel an Belohnung wahrgenommen wird , zu einer Erhöhung der Belohnung Suchverhalten (3B) führen.
Abbildung 2. Ein Beispiel für angeborene Präferenz zu Verbrauchen Ethanol. Naïve WT Männer wurden in Gruppen von 8 männliche Tiere / Fläschchen gruppiert und den Verbrauch von Ethanol- und nonethanol haltigen Lösungen wurden im Verlauf von 96 h aufgezeichnet. Die Fliegen verbraucht eine größere Menge an 15% -igem Ethanol mit deg Nahrungsmittel (** P <0,01, *** p <0,001, Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen mit Bonferroni post-Tests, n = 8). Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM oder bedeuten - SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Opposing Mating Erfahrungen mModulate Ethanol Preference. (A) Schematische Darstellung des kombinierten Protokoll. Einzel Jungfrau Männchen WT dürfen mit jungfräulichen Weibchen zu paaren oder ausgesetzt sind, um 1 h Ruhe Abstand 1h Balz-Unterdrückung Trainingseinheiten (dargestellt als "T") 3x (dargestellt als "R"). Die Ausbildung ist für 4 d wiederholt. Am Ende eines jeden Tages werden die Fliegen in den Inkubator (dargestellt als "ON") platziert. Nach 4 d der Ausbildung wurden die Männer in Ampullen gegeben, wo sie wählen könnten von zu fütternKapillaren mit Lebensmittel-Lösungen mit oder ohne 15% Ethanol. (B) Einzel abgelehnt Männchen höhere Ethanol bevorzugt als einzelne gepaart Männchen zeigten (** P <0,01, Zwei-Wege wiederholte Messungen ANOVA mit Bonferroni post-Tests, n = 9, sind Vergleiche zwischen den Behandlungsgruppen über 3 d nach dem Ende der Ausbildung). Die gezeigten Daten sind der Mittelwert ± SEM oder bedeuten - SEM. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Referenzteil | Notizen |
| 1.1 | Kann in vielen Experimenten verwendet werden, |
| 1.2 | Kann in 4 ° C mehrere Wochen haltbar |
| 1.3 | Halten Sie in 4 ° C nach Autoklav |
| 1.4 | Im Alter von auf 3 - 4 D vorwobei in dem Experiment verwendet |
| 1.5 | Dieser Schritt sollte der Abend stattfinden, bevor jeder Trainingseinheit |
| 2.1 | Dieser Schritt sollte am Morgen jeder Trainingssitzung nehmen |
| 2.2 | Zu wiederholt in 3 aufeinander folgenden Trainingseinheiten im Laufe von 4 d |
| 2.3 | Dump die Stecker mit Wasser, messen Verbrauch und ersetzen Kapillaren im Laufe von 4 d |
| 2.4 | Dieser Schritt wird jedes Mal durchgeführt, bevor die Kapillaren während der zwei Wahl Assay Ersetzen |
Tabelle 1 Eine Übersicht über das Protokoll , welches die Reihenfolge und Zeitablauf für die verschiedenen Schritte.
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Acknowledgments
Wir danken U. Heberlein und A. Devineni für langanhaltenden Diskussionen und technische Beratung. Wir danken auch den Shohat-Ophir Labor Mitglieder, A. Benzur, L. Kazaz und O. Shalom, für die Hilfe bei der Methode zu demonstrieren. Besondere Anerkennung geht für die Festlegung der Flugsysteme im Labor zu Eliezer Costi. Diese Arbeit wurde von der Israel Science Foundation (384/14) und die Marie-Curie-Career Integration Grants (CIG 631.127) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
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