Summary
Descriviamo un protocollo per indurre gratificante e nonrewarding esperienze nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) utilizzando il consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa.
Abstract
Descriviamo un protocollo per misurare l'etanolo autosomministrazione nei moscerini della frutta (Drosophila melanogaster) come proxy per i cambiamenti negli stati di ricompensa. Dimostriamo un modo semplice per sfruttare il sistema di ricompensa volo, modificare le esperienze legate alla ricompensa naturale, e utilizzare consumo di etanolo volontaria come misura per le modifiche negli stati di ricompensa. L'approccio è uno strumento rilevante per studiare i neuroni e geni che svolgono un ruolo nella esperienza cambia-mediata di stato interno. Il protocollo si compone di due parti distinte: esporre le mosche di esperienze gratificanti e nonrewarding, e analizzando il consumo di etanolo volontariato come una misura della motivazione per ottenere un premio di droga. Le due parti possono essere usati indipendentemente per indurre la modulazione di esperienza come primo passo per ulteriori analisi a valle o come dosaggio alimentazione due scelta indipendenti, rispettivamente. Il protocollo non richiede una configurazione complessa e quindi può essere applicato in qualsiasi laboratory con strumenti di base della cultura mosca.
Introduction
Modifica del comportamento in risposta alle esperienze permette animali di regolare il loro comportamento ai cambiamenti nel loro ambiente 1. Durante questo processo, gli animali integrano il loro stato fisiologico interno con mutevoli condizioni dell'ambiente esterno e successivamente scegliere un'azione piuttosto che un altro per aumentare le loro possibilità di sopravvivenza e la riproduzione. Sistemi di ricompensa si sono evoluti per motivare i comportamenti che sono necessari per la sopravvivenza di individui e di specie rafforzando i comportamenti che aumentano la sopravvivenza immediata, come mangiare o bere, o quelli che garantiscono la sopravvivenza a lungo termine, come ad esempio il comportamento sessuale o la cura per la prole 2. Composti artificiali, come l'abuso di droghe interessano anche sistemi di ricompensa per vie neurali cooptazione che mediano ricompense naturali 2.
Nel corso degli ultimi due decenni, la mosca della frutta Drosophila melanogaster è stato stabilito come un modello promettente per lo studio della Moleclare e dei meccanismi neuronali che stanno plasmando gli effetti di etanolo sul comportamento 3,4.
In precedenza, abbiamo identificato un sottogruppo di neuroni peptidergiche nei moscerini (recettore NPF / NPF (R) neuroni) che premia naturali coppia, come esperienza sessuale, alla motivazione di ottenere ricompense droga 5. espressione NPF è sensibile ad entrambe le esperienze sessuali e alle ricompense di droga, come l'etanolo intossicazione. I cambiamenti nei livelli di espressione NPF vengono convertiti in etanolo alterazioni autosomministrazione 5, dove l'alta NPF riduce e bassa NPF aumenta la preferenza a consumare etanolo. L'attivazione dei neuroni NPF è gratificante per le mosche, in quanto mostrano una forte preferenza per un odore in coppia con l'attivazione, che si riflette anche dalla riduzione del consumo di etanolo. Ancora più importante, l'attivazione dei neuroni NPF interferisce con la capacità di mosche formare un'associazione positiva tra etanolo intossicazione e un cue odore. Il nesso causale tra la NPF / Rsistema, la memoria di ricompensa, e il consumo di etanolo suggerisce che si può usare l'etanolo autosomministrazione come misura per le modifiche negli stati ricompensa 5.
In questa pubblicazione abbiamo dimostrato un approccio integrato per attingere il sistema di ricompensa naturale mosca e modifiche del test negli stati di ricompensa. L'approccio è costituito da due parti separate, un protocollo di formazione per la manipolazione di esperienze naturali ricompensa legati, seguita da una a due scelta saggio alimentatore capillare (CAFE) per valutare l'etanolo autosomministrazione come una stima per i cambiamenti negli stati di ricompensa. Il saggio CAFE è analogo ai saggi scelta due bottiglie utilizzate in studi su roditori drug autosomministrazione ed è stato dimostrato per riflettere alcune proprietà di comportamento dipendenza simile mosche 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Nota: panoramica generale del disegno sperimentale: Il disegno sperimentale prevede un protocollo adattato per la soppressione corteggiamento 7-9 in cui le mosche di sesso maschile sono esposti a esperienze gratificanti e nonrewarding in 3 allenamenti consecutivi nel corso di 4 d. Al termine della fase di esperienza, le mosche sono testati in un saggio di consumo di etanolo volontaria due scelta per 3 - 4 d. Il protocollo include qui diverse fasi preparatorie, alcune delle quali possono essere fatte in anticipo per essere utilizzato in più di un esperimento, mentre altri dovrebbero avvenire tempestivamente prima dell'inizio dell'esperimento (Tabella 1).
1. Operazioni preliminari
- Preparazione del sistema di alimentazione capillare
- Scaldare un ago G 27 e usarlo per forare piccoli fori lungo un flacone (Figura 1).
- Tagliare la spina fiala a metà (trasversale) con una lama di rasoio. Mark quattro punti sulla superficie del tappo, creando un square forma per posizionare i titolari capillari in. Utilizzare un ago 18 G per fare 4 fori attraverso il tappo (figura 1b).
- Utilizzare una lama di rasoio per tagliare micropipette in modo che possano tenere saldamente 5 capillari di vetro microlitri, che servono come adattatori.
- Inserire 4 adattatori capillari nelle spine preparati.
- Segnare la posizione dei 2 etanolo e due capillari nonethanol contenenti sulla spina.
Nota: Si consiglia di mantenere le posizioni dei 2 tipi di capillari coerente in tutte le fiale. Prestare attenzione alle dimensioni dei fori, come grandi fori permettono la fuoriuscita di mosche delle fiale. Inoltre, si raccomanda di utilizzare il lato più liscio della spina (generalmente opposto al lato cut) come il lato rivolto verso il basso quando inserito nel flacone, come tagliando la spina crea alcuni piccoli, fibre sciolte che le mosche possono impigliarsi in . - Preparare un gran numero di fiale e adattatori da utilizzare per il sistema di alimentazione capillare (CAFE)esperimenti descritti al punto 2.3.
- Preparazione fiale alimentari piccolo vetro
- Un giorno prima di raccogliere le mosche (passo 1,4), organizzare 200 fiale di vetro su rack provetta. Melt mosca cibo (secondo la ricetta melassa farina di mais, vedere la tabella dei Materiali) utilizzando un forno a microonde. Versare 2 mL di cibo volare in flaconi di vetro (cercare di non spalmare il cibo sulle pareti della fiala). Lasciare indurire cibo, e coprire le fiale di involucro di plastica.
NOTA: Le fiale di vetro contenenti il cibo può essere conservato a 4 ° C per diverse settimane. - Il giorno della raccolta volare, prendere le fiale dal frigorifero e lasciare che raggiungano RT prima di utilizzarli a casa mosche.
NOTA: Se fiale alimentari sono diverse settimane di vita, assicurarsi che il cibo è ancora integro e non distaccata dalla fiala, in linea possono essere intrappolati nelle fessure tra il cibo e il vetro.
- Un giorno prima di raccogliere le mosche (passo 1,4), organizzare 200 fiale di vetro su rack provetta. Melt mosca cibo (secondo la ricetta melassa farina di mais, vedere la tabella dei Materiali) utilizzando un forno a microonde. Versare 2 mL di cibo volare in flaconi di vetro (cercare di non spalmare il cibo sulle pareti della fiala). Lasciare indurire cibo, e coprire le fiale di involucro di plastica.
- Fare soluzione di riserva di cibo per il saggio alimentatore capillare
- per prepare soluzione madre alimentare (5% di saccarosio e il 5% di estratto di lievito), sciogliere 5,88 g di estratto di lievito e 5,88 g di saccarosio in 100 ml di acqua distillata.
NOTA: La soluzione madre è molto incline alla contaminazione. Pertanto, si raccomanda di autoclave esso (121 ° C, 30 min, e senza un ciclo di asciugatura) e aliquote in 850 microlitri aliquote lavorativi per essere conservato a 4 ° C fino all'utilizzo. La concentrazione degli ingredienti nella soluzione madre è 5.88% e raggiungerà la concentrazione finale del 5% dopo l'aggiunta del 15% di etanolo o acqua (150 ml in 850 ml di soluzione di cibo premade) appena prima del suo uso in fase 2.3.
- per prepare soluzione madre alimentare (5% di saccarosio e il 5% di estratto di lievito), sciogliere 5,88 g di estratto di lievito e 5,88 g di saccarosio in 100 ml di acqua distillata.
- Raccolta mosche sperimentali
- Raccogliere 200 mosche maschio naïve utilizzando un pad di CO 2.
Nota: Utilizzare qualsiasi ceppo di laboratorio rilevanti per la questione sperimentale. 250 mosche possono essere facilmente raccolti da cinque bottiglie di mosche in loro fase eclosion scelta. Quando si raccolgono le mosche, prestare attenzione a colmosche gliere che hanno recentemente eclosed (mosche vergini di aspetto: mosche luminosi con una macchia meconio sul loro addome). mosche sperimentali devono essere tenuti singolarmente in flaconcini di vetro di piccole dimensioni contenenti cibo e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere utilizzato nell'esperimento. - Utilizzare le spine morbide per chiudere le fiale.
NOTA: Gli stessi tappi morbidi sarà molto utile per la fase di addestramento quando si utilizza la bocca di aspirazione per inserire le donne dentro e fuori delle fiale durante la fase di esperienza.
- Raccogliere 200 mosche maschio naïve utilizzando un pad di CO 2.
- Raccolta mosche allenatore
NOTA: Tutte le mosche raccolti devono essere conservati in un / incubatore scuro 12 h / 12 h di luce a 25 ° C e 70% di umidità relativa (RH). Il ciclo di 12 h / 12 h luce / buio può essere cambiato in un comodo orario di partenza.- Virgin mosche allenatore femminili
- Raccogliere 500 vergine formatore femminile vola da uno stock WT o di un magazzino virginator per l'uso come le femmine ricettive vergini. Mantenere le mosche di sesso femminile in gruppi di 25 per cibo normale-dimensioni fiala, e tuttili ome età per 3 - 4 d vecchio prima di utilizzarli per l'esperimento.
- Accoppiati mosche allenatore femminili
- Raccogliere 300 mosche femmine vergini provenienti da uno stock WT o un virginator magazzino di sottoporsi accoppiamento prima della fase di formazione (punto 1.6.1).
NOTA: le mosche femminili sono allevati in gruppi di 10 femmine per cibo normale-dimensioni flaconcino e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere utilizzato nell'esperimento.
- Raccogliere 300 mosche femmine vergini provenienti da uno stock WT o un virginator magazzino di sottoporsi accoppiamento prima della fase di formazione (punto 1.6.1).
- mosche maschile utilizzato per generare accoppiate mosche allenatore femminili
- Raccogliere 150 mosche maschio (non necessariamente vergine).
NOTA: Le mosche sono tenuti in gruppi di 15 maschi per regolare dimensioni fiala cibo e di età compresa tra 3 - 4 d vecchia prima di essere accoppiato con la femmina vergine vola per creare le femmine accoppiate allenatore.
- Raccogliere 150 mosche maschio (non necessariamente vergine).
- Virgin mosche allenatore femminili
- Generazione di mosche femmina allenatore accoppiate
- Per generare femmine fecondate vola a essere utilizzati come addestratori, gruppi coppia di 10 femmine vergini vola con 15 maschi vola lanciando un flaconcino contenente maschile in una femmina-contavorazio fiala 16 - 18 h prima della fase di formazione (punto 2.1) 10.
NOTA: Questo dovrebbe normalmente avvenire la sera prima della sessione di allenamento. Il 1.5: 1 rapporto tra maschile vola a mosche di sesso femminile assicura che tutte le femmine saranno accoppiati. - Il giorno dell'esperimento, separare le femmine fecondate dai maschi aspirando i maschi dalla fiala usando un aspiratore bocca. Eseguire questo diritto prima dell'inizio di ogni giornata di formazione.
- Per generare femmine fecondate vola a essere utilizzati come addestratori, gruppi coppia di 10 femmine vergini vola con 15 maschi vola lanciando un flaconcino contenente maschile in una femmina-contavorazio fiala 16 - 18 h prima della fase di formazione (punto 2.1) 10.
2. Fasi sperimentali
- Impostazione della fase di esperienza
- Avviare l'esperimento il più vicino possibile l'inizio della fase leggera nell'incubatrice. Posizionare le femmine allenatore (sia vergini e accoppiati) nella camera di comportamento.
NOTA: Si consiglia di eseguire l'esperimento in una camera di comportamento, o qualsiasi ambiente appartato che è tranquillo e impostare a 25 ° C e 60-65% di umidità relativa. Mantenere umidità superiore al 50% è molto importante, poiché corteggiamento e l'accoppiamentos dipendono sensing feromone, che è noto per essere sensibile all'umidità.
- Avviare l'esperimento il più vicino possibile l'inizio della fase leggera nell'incubatrice. Posizionare le femmine allenatore (sia vergini e accoppiati) nella camera di comportamento.
- Esponendo le mosche di sesso maschile per esperienze gratificanti e nonrewarding
- Disporre le fiale di vetro contenenti i singoli mosche maschio su rack microcentrifuga, posizionando i flaconi lungo i margini del rack.
NOTA: Questa disposizione consente allo sperimentatore di osservare facilmente le coppie di mosche che subiscono copulazione senza prendere le fiale fuori dal rack. - Preparare (come descritto al punto 2.2.1) 2 gruppi di 100 fiale di vetro contenenti singolo maschio vola su rack separati per maschi sottoposti a esperienze gratificanti di accoppiamento e nonrewarding (cioè respinti e accoppiati).
- Aspirare femmine allenatore e aggiungerli ad ogni flacone contenente le mosche di sesso maschile. Impostare il timer per 1 ora. A partire con il gruppo respinto, aggiungere una femmina accoppiato ad ogni flacone. Poi, passare ai maschi ad essere accoppiati e aggiungere una femmina vergine ad ogni flacone.
- Guardare da vicino gli incontri di accoppiamentoper assicurarsi che i maschi interagiscono con femmine vergini accoppiano con successo entro la prima ora e che i maschi interagiscono con le femmine precedentemente accoppiate non si accoppiano. Per monitorare la coorte respinto nel corso di 1 h, impostare un secondo timer per 15 minuti e guardare maschi ogni 15 min.
- Scaricare i maschi della coorte respinto che è riuscito ad accoppiarsi e maschi dalla coorte accoppiato che non finiscono di accoppiamento entro la fine della prima sessione di allenamento.
- Termina il primo allenamento aspirando i formatori femminili precedentemente accoppiati in un normale flacone cibo volare, e tenerli per la prossima sessione di condizionamento. Seguire questo passaggio aspirando delicatamente le femmine del gruppo maschile accoppiato.
- Lasciate che le mosche riposare per 1 ora.
- Ripetere i punti 2.2.3 - 2.2.7 due volte.
- Ripetere la sessione di allenamento in fasi 2.2.3 - 2.2.8 ogni giorno per più di 3 d.
- Disporre le fiale di vetro contenenti i singoli mosche maschio su rack microcentrifuga, posizionando i flaconi lungo i margini del rack.
- Consumo di registrazione (CAFE)
- Alla fine dell'ultimo conditioning sessione (quarto giorno), aspirare singoli maschi e raggrupparli in fiale di alimentazione capillare. Utilizzare una spina morbido per coprire la fiala alimentatore capillare durante l'inserimento le mosche, e sostituirlo rapidamente con la spina di alimentazione capillare ready-made, dopo tutte le mosche sono stati inseriti. Gruppo 6 - 8 linea di ciascuno dei gruppi sperimentali in una fiala, creando non meno di 8 fiale per condizione.
- Bagnare i tappi aggiungendo delicatamente 5 mL di acqua all'inizio del tappo. Prestare attenzione durante l'aggiunta di acqua per evitare perdite nelle fiale. Aggiungere la stessa quantità di acqua per ogni flacone.
NOTA: Questo passo è fatto per ridurre l'evaporazione dai capillari. Pertanto, si ripete ogni giorno per il resto dell'esperimento. A seconda della umidità relativa, i giorni successivi possono richiedere meno acqua da aggiungere alle spine. - Preparare due soluzioni separati dell'alimento aggiungendo etanolo o acqua per le aliquote di cibo e per creare una concentrazione finale del 15%.
- Per riempire il capillariete con le due soluzioni alimentari, creano 5 microlitri cibo liquido cade su una pellicola di laboratorio e permettono la soluzione per riempire il capillare fino a raggiungere il contrassegno 5 microlitri. Assicurarsi di utilizzare il chiaro fine del capillare, che è vicino alla linea di segno nero 5 ml.
NOTA: per riempire diversi capillari contemporaneamente, è possibile collegare 6 - 8 adattatori capillari e li usa come inserto per tenere i capillari. - Toccare i capillari delicatamente sulla striscia di paraffina per posizionare la soluzione cibo esattamente in corrispondenza del segno nero. Sigillare i capillari immergendo la fine di ciascun capillare in piccole gocce di olio minerale. Questo passaggio minimizza potenziale evaporazione della soluzione cibo.
- Inserire due capillari contenente etanolo e due capillari nonethanol contenente attraverso i 4 adattatori / porta nella spina finché i lati esposti dei capillari malapena peek dall'interno della fiala (1 mm o meno dalla superficie spina).
NOTA:Mantenendo l'apertura dei capillari vicino alla spina bagnato riduce l'evaporazione e consente un facile accesso al cibo, in linea normalmente siedono sui tappi e scendere sul capillare esposto ad alimentare. - In aggiunta a fiale contenenti mosche sperimentali, preparare una fiala finto, senza mosche. Questo controllo serve per valutare l'evaporazione naturale.
NOTA: Cercare di mantenere relativamente uguale posizionamento dell'apertura capillare rispetto ai tappi, le differenze possono portare a evaporazione variabile e fuorvianti dati di consumo. Mantenere un'adeguata umidità durante l'esperimento e posizionare le aperture capillari più vicino possibile alla spina bagnato, come bassa umidità e grande distanza dalla spina bagnato può sia risultato dell'evaporazione incontrollata. - Registrare la posizione relativa del liquido in ciascuna delle capillari rispetto alla linea segno nero in mm utilizzando un righello, e scrivere questi valori.
NOTA: Se la soluzione è posizionata esattamente al l neraine, il valore dovrebbe essere uguale a zero, e se è superiore o inferiore, dovrebbe essere valori positivi o negativi, rispettivamente. I livelli iniziali di liquido impostare i punti di riferimento per i valori di consumo finale O / N. - Impostare le fiale indietro nell'incubatrice per 24 h. Sostituire i capillari alla volta costante durante l'intero esperimento.
- Rimuovere i capillari delicatamente dalle fiale e misurare i livelli di liquido rispetto alla linea di marcatura nera.
- Controllare attentamente il livello del liquido nel flaconcino finto.
NOTA: Se i livelli sceso superiore a 2 mm, indica che l'evaporazione è elevata ei livelli di consumo non sono affidabili. - Inumidire i tappi delicatamente con 2 ml di acqua e inserire una nuova serie di capillari, come indicato nei passaggi 2.3.3 - 2.3.10. Impostare le fiale indietro nell'incubatrice per 24 h.
- Determinazione preferenza
- Calcolare il consumo totale di ciascun capillare sottraendo il livello finale dal ilivello nitial al punto di partenza.
- Combinare i valori delle due capillari con lo stesso cibo (cioè nonethanol capillari separatamente dai capillari contenente etanolo).
- Calcolare preferenza etanolo sottraendo la quantità consumata dai capillari non-etanolo dalla quantità consumata dai capillari contenente etanolo e dividere il valore i valori totali di consumo da tutti i capillari della stessa fiala.
- La media dei indici di preferenza di tutti i flaconi dello stesso gruppo sperimentale.
NOTA: Nonethanol 1 (NE1), Nonethanol 2 (NE2), Etanolo 1 (E1), Etanolo 2 (E2), nonethanol totale (NE totale) = NE1 + NE2, etanolo totale (Total E) = E1 + E2, somma totale consumo (somma) = totale NE + Total e, ed etanolo preferenza Index (PI)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FPreviously, Devineni et al. hanno dimostrato che quando i moscerini della frutta sono dati la scelta di consumare cibo contenente etanolo, mostrano una forte preferenza per il cibo contenente etanolo sopra nonethanol contenente cibo 6. Indicato qui ci sono alcuni risultati rappresentativi si ottengono quando saggiare la preferenza etanolo innata di mosche maschio ingenua che non ha subito il protocollo di allenamento.
Naïve Canton S mosche maschi sono stati raccolti su eclosion, di età compresa fino a 4 giorni di età, e analizzati per la loro preferenza innata di consumare etanolo nel corso di 4 d (Figura 2). Analizzando le quantità consumate da etanolo: e nonethanol contenenti soluzioni spettacoli che vola mostrano una preferenza robusto per consumare cibi etanolo al 15% per il cibo nonethanol (Figura 2).
Utilizzando opposte sessualeesperienze, abbiamo precedentemente dimostrato che le mosche di sesso maschile che sono stati autorizzati ad accoppiarsi in gruppi display inferiore preferenza etanolo rispetto ai maschi singolarmente-alloggiati, che sono stati respinti dalle femmine precedentemente accoppiate ( "rifiutato isolati") ( "-raggruppati accoppiati"). Abbiamo usato diversi controlli per disaccoppiare l'esperienza custodia dall'esperienza accoppiamento-correlata e che la preferenza differenziale risulta dall'esperienza di accoppiamento 5.
Utilizzando il protocollo di allenamento qui descritto, abbiamo generato singolarmente-accoppiati e ha respinto le mosche di sesso maschile che hanno subito simili abitative e di accoppiamento regimi. Uomo singolo mosche Canton S sono stati sottoposti nel corso di 4 d alle esperienze di accoppiamento disparate. Una coorte di maschi è stato permesso di interagire e accoppiarsi con le mosche femmine vergini (singola coorte accoppiati), e l'altra di coorte è stato addestrato con le mosche di sesso femminile precedentemente accoppiati (singola coorte respinto). A seguito della fase di formazione, i singoli maschi from le due coorti sono stati raggruppati (8 / flacone) e collocati in fiale di alimentazione capillare; il loro consumo di etanolo volontario è stato registrato per 4 d (Figura 3A). La preferenza per consumare etanolo è stata calcolata dai dati di consumo utilizzando la formula in fase 2.4 (Figura 3B). I valori positivi indicano la preferenza per il cibo contenente etanolo, e valori negativi indicano l'avversione al cibo contenente etanolo.
Il presente esperimento supporta i nostri risultati precedenti, il che suggerisce che l'esperienza sessuale, e non condizione abitativa, modula il consumo di etanolo. l'accoppiamento di successo aumenta i livelli di ricompensa interne, che a sua volta riduce il consumo di etanolo. Rifiuti, percepito come una mancanza di ricompensa, portano ad un aumento dei comportamenti di ricompensa-cerca (Figura 3B).
Figura 2. Un esempio di preferenza innata per consumare etanolo. Naive maschi WT sono stati raggruppati in gruppi di 8 maschi / flacone, e il loro consumo di etanolo: soluzioni e nonethanol contenenti stati registrati nel corso di 96 h. Le mosche consumato una quantità maggiore del 15% di etanolo contenentg cibo (** p <0.01, *** p <0,001, a due vie misure ripetute ANOVA con Bonferroni post-test, n = 8). I dati indicati sono la media + SEM o media - SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Esperienze di accoppiamento opposti mModulate Etanolo preferenze. (A) Schema del protocollo combinato. Singolo maschi WT vergini possono accoppiarsi con femmine vergini o sono sottoposti a 3 volte sessioni di formazione corteggiamento-soppressione 1h (rappresentati come "T") distanziati di 1 h di riposo (raffigurati come "R"). La formazione è ripetuta per 4 d. Alla fine di ogni giorno, le mosche sono posti in incubatrice (raffigurata come "ON"). Dopo 4 d della formazione, i maschi sono stati collocati in fiale dove potevano scegliere di nutrirsi dacapillari contenenti soluzioni alimentari con o senza il 15% di etanolo. (B) Singolo respinto maschi esposti maggiore preferenza etanolo rispetto ai maschi singoli accoppiati (** p <0.01, a due vie ripetute misure ANOVA con Bonferroni post-test, n = 9, i confronti sono tra i gruppi di trattamento in tutto 3 d dopo la fine della formazione). I dati indicati sono la media + SEM o media - SEM. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
| Sezione di riferimento | Note |
| 1.1 | Può essere utilizzato in molti esperimenti |
| 1.2 | Possono essere tenuti in 4 ° C per diverse settimane |
| 1.3 | Tenete a 4 ° C dopo autoclave |
| 1.4 | Di età compresa tra 3 - 4 d primautilizzato nell'esperimento |
| 1.5 | Questo passaggio dovrebbe avvenire la sera prima di ogni sessione di allenamento |
| 2.1 | Questo passaggio dovrebbe avvenire la mattina di ogni sessione di allenamento |
| 2.2 | Per essere ripetuta in 3 allenamenti consecutivi nel corso dei 4 d |
| 2.3 | Dump i tappi con acqua, misurare il consumo e sostituire capillari nel corso di 4 d |
| 2.4 | Questo passo è fatto ogni volta prima di sostituire i capillari durante il dosaggio due scelta |
Tabella 1. Una panoramica del protocollo raffigurante l'ordine e il flusso di tempo per ciascuna delle fasi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Ringraziamo U. Heberlein e A. Devineni per le discussioni di lunga durata e consulenza tecnica. Ringraziamo anche i membri del laboratorio Shohat-Ophir, A. Benzur, L. Kazaz, e O. Shalom, per l'aiuto di dimostrare il metodo. apprezzamento speciale va a Eliezer Costi per stabilire i sistemi di mosca in laboratorio. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Israel Science Foundation (384/14) e le Marie Curie Career Integration Grants (CIG 631.127).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polystyrene 25 x 95 mm Vials | FlyStuff | 32-109 | |
| narrow plastic vials flugs | FlyStuff | 42-102 | |
| Disposable Sterile Needle 18 G and 27 G | can be acquired by any company | 1.20 X 38 mm (18 G x 1 1/2") , 0.40 X 13 mm (27 G x 1/2") | |
| 10 x 75 mm Borosilicate Glass Disposable Culture Tubes | kimble chase | 73500-1075 | |
| calibrated pipets 5 μL | VWR | 53432-706 | color coded white to contain 5 μL |
| Mineral Oil | Sigma-Aldrich | M5904 | |
| Sucrose, Molecular Biology Grade | CALBIOCHEM | 573113 | |
| Yeast extract Powder for microbiology | can be acquired by any company | ||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 32221 | |
| standard pipette Tips (micro-pipetts) | ThermScientific | T114R-Q | volume: 0.1 - 20 μL (ultramicro) |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-A | fits opening 6 - 13 mm |
| IDENTI-PLUGS (Foam Tube Plugs) | Jaece | L800-D | fits opening 35 - 45 mm |
| virginator fly stock | bloomington drosophila stock center | #24638 | |
| Narrow Vials, Tray Pack (PS) | Genesee Scientific Corporation | # 32-109BR | |
| Drosophila Media Recipes and Methods | Bloomington Drosophila Stock Center | http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/molassesfood.htm | |
| propionic acid | Sigma-Aldrich | P5561 | |
| phosphoric acid | Sigma-Aldrich | W290017 | |
| Methl 4-Hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H3647 | |
| Agar Agar | can be acquired by any company | ||
| corn meal | can be acquired by any company | ||
| Grandma's molasses | B&G Foods, Inc | not indicated | |
| instant dry yeast | can be acquired by any company |
References
- Robinson, G. E., Fernald, R. D., Clayton, D. F.
- Koob, G. F. Neurobiological substrates for the dark side of compulsivity in addiction. Neuropharmacol. 56, Suppl 1 18-31 (2009).
- Kaun, K. R., Devineni, A. V., Heberlein, U. Drosophila melanogaster as a model to study drug addiction. Hum Genet. 131, 959-975 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U.
- Shohat-Ophir, G., Kaun, K. R., Azanchi, R., Mohammed, H., Heberlein, U. Sexual deprivation increases ethanol intake in Drosophila. Science. 335, 1351-1355 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. Preferential ethanol consumption in Drosophila models features of addiction. Curr Biol : CB. 19, 2126-2132 (2009).
- McBride, S. M., et al. Mushroom body ablation impairs short-term memory and long-term memory of courtship conditioning in Drosophila melanogaster. Neuron. 24, 967-977 (1999).
- Ejima, A., Smith, B. P., Lucas, C., Levine, J. D., Griffith, L. C. Sequential learning of pheromonal cues modulates memory consolidation in trainer-specific associative courtship conditioning. Curr Biol. 15, 194-206 (2005).
- Ejima, A., et al. Generalization of courtship learning in Drosophila is mediated by cis-vaccenyl acetate. Curr Biol. 17, 599-605 (2007).
- Keleman, K., Kruttner, S., Alenius, M., Dickson, B. J. Function of the Drosophila CPEB protein Orb2 in long-term courtship memory. Nat Neurosci. 10, 1587-1593 (2007).
- Kaun, K. R., Azanchi, R., Maung, Z., Hirsh, J., Heberlein, U. A Drosophila model for alcohol reward. Nat Neurosci. 14, 612-619 (2011).
- Xu, S., et al. The propensity for consuming ethanol in Drosophila requires rutabaga adenylyl cyclase expression within mushroom body neurons. Genes Brain Behav. 11, 727-739 (2012).
- Devineni, A. V., Heberlein, U. The evolution of Drosophila melanogaster as a model for alcohol research. Annu Rev Neurosci. 36, 121-138 (2013).
- Ro, J., Harvanek, Z. M., Pletcher, S. D. FLIC: high-throughput, continuous analysis of feeding behaviors in Drosophila. PloS one. 9, 101107 (2014).
- Itskov, P. M., et al. Automated monitoring and quantitative analysis of feeding behaviour in Drosophila. Nat Commun. 5, 4560 (2014).
- Yapici, N., Cohn, R., Schusterreiter, C., Ruta, V., Vosshall, L. B. A Taste Circuit that Regulates Ingestion by Integrating Food and Hunger Signals. Cell. 165, 715-729 (2016).
- Peru, Y. C., et al. Long-lasting, experience-dependent alcohol preference in Drosophila. Addict Biol. 19, 392-401 (2014).
- Dus, M., et al. Nutrient Sensor in the Brain Directs the Action of the Brain-Gut Axis in Drosophila. Neuron. 87, 139-151 (2015).
- Anderson, D. J., Adolphs, R. A framework for studying emotions across species. Cell. 157, 187-200 (2014).
- Gibson, W. T., et al. Behavioral responses to a repetitive visual threat stimulus express a persistent state of defensive arousal in Drosophila. Curr Biol. 25, 1401-1415 (2015).
