Summary
Detta protokoll beskriver hur man förbereder en 2D-blandad matris bestående av gelatin och kollagen I och en 3D-kollagen I-plugga för att studera linjära invadosomer. Dessa protokoll tillåter studier av linjär invadosombildning, matrisnedbrytningsaktivitet och invasionskapaciteter hos primära celler och cancercellinjer.
Abstract
Celladhesion, migration och invasion är inblandade i många fysiologiska och patologiska processer. Till exempel, under metastasbildning måste tumörceller passera anatomiska barriärer för att invadera och migrera genom den omgivande vävnaden för att nå blod eller lymfatiska kärl. Detta kräver samspelet mellan celler och den extracellulära matrisen (ECM). På cellulär nivå kan många celler, inklusive de flesta cancerceller, bilda invadosomer, vilka är F-aktinbaserade strukturer som är kapabla att försämra ECM. Invadosomer är protrusiva aktinstrukturer som rekryterar och aktiverar matrismetalloproteinaser (MMP). Den molekylära sammansättningen, densiteten, organisationen och styvheten hos ECM är avgörande för reglering av invadosombildning och aktivering. In vitro är en gelatinanalys standardanalysen använd för att observera och kvantifiera invadosomedbrytningsaktivitet. Gelatin, som är denaturerat kollagen I, är emellertid inte en fysiologisk matris element. En ny analys med användning av typ I-kollagenfibriller utvecklades och användes för att visa att denna fysiologiska matris är en potent inducer av invadosomer. Invadosomer som bildar sig längs kollagenfibrillerna är kända som linjära invadosomer på grund av deras linjära organisation på fibrerna. Vidare visade molekylär analys av linjära invadosomer att discoidindomänreceptorn 1 (DDR1) är receptorn inblandad i deras bildning. Dessa data visar tydligt vikten av att använda en fysiologiskt relevant matris för att förstå de komplexa interaktionerna mellan celler och ECM.
Introduction
Extracellulär matris (ECM) remodeling sker under fysiologiska och patologiska processer, såsom angiogenes och tumörcellinvasion. I fysiologiska förhållanden kan många celltyper, mest från hematopoietiska linjen, bryta ned ECM-element. Till exempel kan makrofager passera anatomiska barriärer för att nå vävnader, och osteoklaster försämrar benmatrisen för att säkerställa kalciumhomeostas. Mer globalt förnyar alla matriser i kroppen att de behåller sina fysikaliska och kemiska egenskaper. I cancervävnader förändras tumörmiljömiljökompositionen. Till exempel i bröst- och lungcancer, typ I-kollagen överuttrycks och ackumuleras runt tumören. Dessutom är denna ackumulering förknippad med en ökad risk att utveckla metastas 1 , 2 . Cancermetastaser är beroende av cancercellernas förmåga att försämra ECM och invadera intilliggande vävnader.
DeInvasiv aktivitet av celler hänför sig till specialiserade aktinrika strukturer som kallas invadosomer. Denna term innefattar podosomer och invadopodier, vilka är närvarande i normala och cancerceller ( t.ex. makrofager, endotelceller och cancerceller, såsom MDA-MB-231 bröstcancercellinjen). In vitro kan invadosomer organisera sig i olika former: prickar, aggregat eller rosetter 3 . Klassiskt är invadosomer sammansatta av en F-aktinkärna innehållande flera proteiner, såsom ställningsproteinet Tks5 och kortaktin, omgivet av adhesionsplakmolekyler, såsom integriner och vinkulin 4 . Nyligen visades att Tks5 och RhoGTPas Cdc42 kan användas som en minimumsmolekylär signatur för funktionella invadosomer 5 . Dessa strukturer kan bryta ned ECM via rekrytering och aktivering av specifika metalloproteasproteiner, såsom MT1-MMP och MMP-2 6. I en tidigare studie rapporterade vi att interaktionen mellan typ I-kollagenfibriller och discoidin-domänreceptorn 1 (DDR1), en specifik receptor av kollagenfibriller av typ I, leder till bildandet av en ny klass av invadosomer, benämnda linjära invadosomer. Linjära invadosomer bildas längs typ I-kollagenfibriller 7 . Dessa strukturer kan bryta ned typ I-kollagenfibriller via rekrytering och aktivering av MT1-MMP / MMP2. Dessutom är deras bildning beroende av Tks5 och Cdc42 5 . In vitro demonstrerade vi förekomsten av linjära invadosomer och involveringen av DDR1 i deras bildande och aktivitet 8 med användning av olika strategier bestående av en kombination av olika matriselement, innefattande: i) fluorescerande gelatinbelagda täckglas, ii) kollagenfibril av fluorescerande typ I -belagda täckglas, och iii) Kollagenproppar av typen 3D-typ. På grund av användningen av olika matriser kunde vi studera och karaktäriseraIze linjär invadosombildning och deras nedbrytningsaktivitet 7 , 8 .
För att bättre förstå biologin för invasiva celler användes en kombination av ECM-komponenter i båda 2D- och 3D-kultursystemen, vilket liknade komplexiteten hos tumörmikromiljökompositionen. Nedan finns protokoll för överdragsskydd med gelatin / typ I-kollagen i 2D- och 3D-odlingssystem.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS! Före fixering fullbordas alla steg i en steril laminärflödeshuvud.
1. 2D-matris
OBS: 2D-matriser används för att bestämma procentandelen celler som bildar invadosomer och matrisnedbrytningsområdet per cell.
Figur 1: Protokoll. Sammanfattning av protokollet som används för att framställa gelatin och kollagen I matriser. Det är möjligt att endast göra gelatinmatrisen eller en gelatin och kollagen I-blandad matris. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Gelatinmatris
OBS: Fluorescerande gelatinmatriser används för att kvantifiera matrisnedbrytning och icke-fluorescerande gelatin används för att främja vidhäftningen av kollagen I-fibrer. Fluorescerande gelatinmattorRices används också för podosom och invadopodi studier (se figur 1 ).- Placera en bit parafilm (20 cm x 15 cm) på arbetsområdet under ett sterilt laminärt flödeskåp och desinficera det med 70% etanol.
- Aliquot 20 | il droppar av 1 mg / ml gelatin i en linje, åtskilda ca 1 cm från varandra; Hänvisa till Figur 1 för dropporganisation.
- Täck varje 20 μl gelatindroppe med ett autoklaverat glasöverdrag (12 mm i diameter).
- Inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur. Om gelatinet är fluorescerande, skydda det från ljus.
- Aliquot 40 μL droppar av 0,5% glutaraldehyd i 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i en linje, vardera åtskilda ca 1 cm under linjen av täckglas från steg 1.1.3.
VARNING: Glutaraldehyd är ett giftigt fixativt medel. Använd handskar och andas inte in. - Använd jeweled pincett, överför varje gelatinbelagd täckglas till en glutaraldehyddropp.
OBS: DetÄr normalt att en liten gelatindroppe kvarstår på parafilmen. Återanvänd inte detta för ett annat experiment. - Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur. För lysrör, skydda dem mot ljus.
- Ta en 24-brunns cellodlingsplatta och fyll i varje brunn med 500 μL steril 1x PBS. Placera täckglasen, gelatinsidan uppåt, i varje brunn.
- Tvätta två gånger i 1x PBS i 5 min vardera.
OBS! Vid detta steg kan täckglasen användas för experiment eller lagras i 1x PBS vid 4 ° C. Icke-fluorescerande täckglas kan lagras i en vecka, och fluorescerande täckglas kan lagras i 48 timmar.
- Fibrillär kollagen typ I matris
OBS: Fibrillär kollagen typ I-matris används för att studera linjär invadosombildning och den associerade matrisnedbrytningen. En kombination av fluorescerande kollagen I och icke-fluorescerande gelatinskyddslister används för att kolokalisera invadosommarkörer med kollagenfibrer ( t.ex. F-aktin iN den fjärrkanalen, kollagen I i den röda kanalen, Tks5 i den gröna kanalen och Hoechst färgar för en nukleär fläck). Å andra sidan används en kombination av icke-fluorescerande kollagen I med icke-fluorescerande gelatinöverdragslister för att maximera antalet färgade invadosommarkörer ( t.ex. F-aktin i den fjärrkanalen, kortaktin i den röda kanalen, Tks5 i Den gröna kanalen och Hoechst färgämne för en nukleär fläck). Slutligen används en kombination av icke-fluorescerande kollagen I med fluorescerande gelatinöverdragslister för att kvantifiera den gelatinassocierade nedbrytningen ( t.ex. F-aktin i den fjärrkanala, Tks5 i den röda kanalen, i den gröna kanalen och Hoechst-färgämnet För en nukleär fläck) (se figur 1). Hoechst färgämne används för att fläcka kärnan, och det kontrollerar också för mykoplasma kontaminering, förutom ett PCR-test som regelbundet görs på de använda cellinjerna.- Fluorescerande kollagen I
- Använd kommersiellt kollagen I extraherat från råtta-sen-sen i 0,02 N ättiksyrad. Dra ut den mängd kollagen som krävs för att förbereda 500 μl lösning per täckglas vid en slutlig koncentration av 0,4 mg / ml kollagen I.
- Tillsätt 5-karboxi x rhodaminsuccinimidylester vid en slutlig koncentration av 10 | ig / ml, beräknat för slutvolymen av kollagen I-lösning (nx 500 | il).
- Blanda lösningen genom pipettering upp och ner och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur, skyddad mot ljus.
- Späd till slutvolymen med 1X Dulbeccos fosfatbuffrade saltlösning (DPBS) innehållande kalcium och magnesium och använd direkt.
- Fibrillär kollagen I täckglas
- Använd de icke-fluorescerande eller fluorescerande gelatinöverdrag som tidigare framställts i steg 1.1.
- Förbered en lösning av fluorescerande eller icke-fluorescerande kollagen I vid en slutlig koncentration av 0,4 mg / ml i 1X DPBS innehållande kalcium och magnesium.
- Tillsätt 500 μL fluorescerande eller icke-fluorescerande kollagen I lösning perTäckglas i en 24-brunns cellodlingsplatta.
- Inkubera i 4 timmar vid 37 ° C för kollagen-I-polymerisation.
- Efter inkubering, ta bort det överskott av kollagen I genom att luta plattan och pipettera på sidan av brunnen (inte direkt på täckglaset) för att undvika att skada matrisen.
OBS: Denna matris kan inte lagras. Säd cellerna omedelbart efter avlägsnande av överskott av kollagen I.
- Fluorescerande kollagen I
2. Cellsåning, tid för odling och fixering
- Beroende på celltyp, bereda cellerna i lämpligt odlingsmedium och tillsätta celler för en slutlig volym av 500 | il per brunn.
- För att karakterisera förmågan hos en cellinje att bilda linjära invadosomer och att degradera matrisen plattor cellerna i 4 h, 12 h och 24 h på kollagen I-matris för att bestämma kinetiken för linjär invadosombildning och den därmed sammanhängande nedbrytningsaktiviteten.
OBS! Tabell 1 innehåller exempel på cellinjerTestas i laboratoriet.
Tabell 1: Cellsåkning och inkubationstidreferens. I tabellen presenteras en icke-uttömmande lista över cellinjer som används för att studera linjära invadosomer. Det indikerar antalet celler att utsäde på matrisen, tiden som är nödvändig för att observera linjära invadosomer och den tid som är nödvändig för att observera den associerade matrisnedbrytningen. Linjära invadosomer har kort livstid. För att kunna observera linjära invadosomer i det maximala antalet celler måste cellerna vara i kontakt med kollagen I-matrisen under en kort tidsperiod. Å andra sidan, för att kunna visualisera den rapporterade gelatinnedbrytningen måste cellerna vara i kontakt med kollagen I-matrisen under en längre tid än de som anges ovan.Cellinje Antal celler per täckglas Tidpunkt för kontakt med matris för linjär invadosom kvantifiering Tidpunkt för kontakt med matris för kvantifiering av linjär invadosomedbrytningsaktivitet MDA MB 231 40 tusen 4 h 12 h HuH7 40 tusen 12 h 24 h HEP 3B 40 tusen 12 h 24 h SNU 398 40 tusen 12 h 24 h NIH 3T3 src 30 tusen 4 h 12 h A431 50 tusen 6 h 24 h A549 40 tusen 12 h 24 h &# 160; RÅ 40 tusen 12 h 12 h PAE 40 tusen 12 h 12 h - Efter avlägsnandet av cellodlingsmediet,Fixa täckglasen i 10 min i 500 μl 4% paraformaldehyd i 1X PBS.
- Tvätta två gånger med 1x PBS.
- Förvara vid 4 ° C, skyddad mot ljus.
3. Immunofluorescens
- Permeabilisera cellerna i 10 minuter med en nyberedd lösning Av 0,2% Triton X-100 i 1x PBS. Återanvänd inte denna lösning.
- Tvätta täckglasen två gånger med 1x PBS.
- Lägg en bit parafilm (20 cm x 15 cm) på bänken.
- Späd primär antikropp i 4% bovint serumalbumin (BSA) i 1x PBS, såsom beskrivs i materialtabellen .
- Aliquot 50 μl droppar av primär antikroppslösning i en linje, vardera åtskilda ca 1 cm från varandra.
- Placera varje täckglas på en droppe.
- Inkubera i 40 minuter vid rumstemperatur, skyddad mot ljus.
- Efter inkubationstiden tvättas två gånger med 1x PBS.
- Späd sekundär antikropp, phalloidin och Hoechst färgämne i 4% BSA i 1xPBS.
- Aliquot 50 μL droppar av blandningen, vardera åtskilda ca 1 cm under den första linjen av täckglas, som tidigare gjort.
- Placera varje täckglas på en droppe.
- Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur, skyddad mot ljus.
- Efter inkubation tvätta två gånger med 1x PBS.
- Tvätta en gång med destillerat vatten för att avlägsna salterna.
- Montera täckglasen på en glasskiva med polymeriserande monteringsmedium.
- Låt täckglasen torka över natten vid rumstemperatur, skyddad mot ljus, före mikroskopi.
4. Kvantifieringar
Figur 2: Linjär invadosom kvantifiering. Makroet kräver konfokala bilder av F-aktin och Tks5-färgning (format: 1,024 x 1,024). ( A ) Öppna först F-actin-bilden och gör en mask. ( B ) Öppna sedanTks5-bilden och trösklar den. Använd makroen. ( C ) Analyserade resultat visas i två tabeller. Antalet linjära invadosomer per cell och annan information, såsom procentandelen som används av linjära invadosomer i cellen, kommer att finnas i sammanfattande tabellen. Storleken på varje linjär invadosom kommer att ligga i resultattabellen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Procentandel av celler som bildar linjära invadosomer
- Räkna cellerna som bildar linjära invadosomer, cirka 100 celler per täckglas (använd tekniska trippel). Kvantifiera minst 300 celler per n, med n = 3.
- Beräkna procentandelen celler som bildar linjära invadosomer genom att ta medeltalet av tre oberoende experiment, vilket resulterar i 900 kvantifierade celler.
- Linjär invadosom storlek och antal per cell
- Använd ImageJ med extra makro.
- Använd tre täckglas per skick.
- Ta 30 bilder per täckglas av fluorescerande gelatin och Hoechst-färgade kärnor.
- Använd ImageJ-programvaran som beskrivet i Martin KH et al. 9 .
5. 3D Collagen Invasion Assay
Figur 3: Invasion assay schema. Sammanfattning av invasionanalysprotokollet. Kollagen I är tvärbundet med succinimidylesterfärg och polymeriseras i 1 h vid 37 ° C. Celler tillsätts i serumfritt medium ovanpå kollagen I-pluggen. Insatsen placeras i medium wiTh 10% FBS. Kollagen I-pluggar fixeras 1 h efter cellsåning i kontrollen och 3 dagar efter cellsåtning i försöksförhållandet för att bestämma cellernas invasionskapacitet. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
- Kollagen Jag pluggar preparat
- Gör en tidskurs på 4 h, 12 h, 24 h, 48 h och 72 h för det första experimentet för att bestämma kinetiken för invasionen i gelén enligt celltypen. För varje experiment lägger du till en 1 h tidpunkt som referenspunkt när ingen invasion uppstår.
- Förbered kollagen I-lösningen på is under en steril laminärflödeskåpa. Förbered 500 μL lösning för 3 Boyden kammarinlägg.
- Aspirera 1 mg kommersiellt rått-svanskollagen I för att framställa en lösning med en slutlig koncentration av 2 mg / ml kollagen I.
- Tillsätt 5-karboxi x rhodaminsuccinimidylester vidEn slutkoncentration av 1 | ig / ml, beräknad för slutvolymen av kollagen I-lösning (i detta fall 500 | il).
- Blanda väl och inkubera i 5 minuter på is under den sterila laminära flödeskåpan, skyddad mot ljus.
- Tillsätt 50 μl iskall, filtrerad 10X PBS och 6,25 μl iskall 1 M natriumhydroxid (NaOH).
- Tillsätt sterilt vatten enligt formeln 443.75 - x / il kollagen I.
- Tillsätt 100 μL lösning per Boyden kammarinlägg.
- Inkubera i 1 h vid 37 ° C för att möjliggöra polymerisation.
- Tillsätt cellodlingsmedium berikat med fetalt bovint serum (FBS) i nya brunnar; Placera insatser i dessa brunnar.
- Frö 30 000 celler på toppen av kollagenet I pluggar i FBS-fritt medium.
- Efter odling av cellerna vid 37 ° C fixar jag kollagen I-pluggen under 30 minuter i 4% paraformaldehyd i 1x PBS.
- Fullständig immunofluorescens som i steg 3, med undantag av följande steg: permeabiliZe med 0,2% Triton X-100 i 1x PBS under 30 minuter, inte 10 minuter; Inkubera med primära och sekundära antikroppslösningar i 1,5 h vardera, i stället för 40 min respektive 30 min. Stain för F-aktin eller kärnor för att lokalisera cellerna.
- Efter immunofluorescens, använd en skalpell för att skära runt insatsens membran och försiktigt överföra kollagen I-kontakten till en glasbottenmaträtt. Se till att toppen av kollagenet jag pluggar är i kontakt med glaset. Håll insatsmembranet fäst vid botten av kollagen I-pluggen för att hålla kontakten på plats.
OBS: Kollagen I-pluggen förblir intakt i glasskålen. Djupet mellan glasbotten och plasten kring glasbotten motsvarar tjockleken på pluggen. - Placera en täckglas på kollagenet jag pluggar och monterar med polymeriserande monteringsmedium för att förhindra att pluggen torkar ut.
- Använd ett inverterat konfokalmikroskop för att bilda kollagenet jag pluggar; toppen avPluggen är i kontakt med glasets botten på skålen.
- Skaffa en z-stack från toppen till botten av kollagenet jag pluggar för att visualisera cellinvasion. Bestäm tjockleken på z-stacken genom att undersöka hur djupt cellerna invaderar bildfältet. Utför förvärv med ett 40X oljemål i ett 512 x 512 format med en z-steg storlek på 0,25 μm.
OBS: För referens är den genomsnittliga z-stacken för MDA-MB-231-celler 3 dagar efter sådd 30 μm.
- Skaffa en z-stack från toppen till botten av kollagenet jag pluggar för att visualisera cellinvasion. Bestäm tjockleken på z-stacken genom att undersöka hur djupt cellerna invaderar bildfältet. Utför förvärv med ett 40X oljemål i ett 512 x 512 format med en z-steg storlek på 0,25 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med hjälp av en kombination av två typer av matriser, gelatin och typ I-kollagen ( Figur 1 och 4 ) har vi framhävt en ny typ av invadosom, känd som linjära invadosomer. Märkningen av dessa matriser möjliggör observation av linjär invadosombildning längs kollagen I-fibrer och deras nedbrytningsförmåga ( Figur 5 ). Antalet invasiva strukturer kan sedan kvantifieras med det tidigare beskrivna makroet (steg 4.2), och nedbrytningsaktiviteten kan också bestämmas med användning av ImageJ-mjukvaran, såsom beskrivs av Martin et al. Och Diaz et al. 9 , 10 . Den blandade matrisen möjliggör karakterisering av linjära invadosomer genom att definiera DDR1 som den receptor som är nödvändig för linjär invadosombildning och funktionalitet ( Figur 6 ).
figur 3 och 7 ). Denna analys tillåter oss att bestämma antalet celler som har invaderat i kollagen I-pluggen, liksom avståndet som reste, genom att använda z-stack-rekonstruktioner.
Figur 4: Jämförelse av gelatin och gelatin-kollagen I blandade matriser med användning av konfokal mikroskopi. Schematisk representation som visar organisationen av fluorescerande gelatinöverdrag på toppanelen. ( A ) Confocal z-stack rekonstruktion visar att den fluorescerande gelatinmatrisen bildar ett tunt, enhetligt skikt som täcker hela ytan av täckglaset. ( B ) I den blandade matrisen, efter deponering av fluorescerande gelatin på täckglasen, sätter kollagenfibriller av typ IPolymerisera på toppen. Kollagenet I fibriller är färgade i rött. Kollagen I-matrisen är tjock och heterogen på täckglaset. Fördelningen av kollagen I-fibrerna är beroende av polymerisationen av kollagen I-a-kedjor. Skala bar = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Effekter av gelatin och gelatin-kollagen I-matriser på invadosombildning och aktivitet. Cellerna som används för dessa analyser är MDA-MB-231 bröstcancerceller. ( A ) En schematisk representation visar celler utsöndrade på en fluorescerande gelatin täckglas på toppanelen. Nedbrytningsområdena visualiseras i svart på grund av reduktionen av fluorescens. Tks5-färgning användes som en invadosomarkör. På gelatin, invAdosomer som form är organiserade som prickar. ( B ) En schematisk representation visar celler sådda på en blandad matris av gelatin och kollagen I. Kollagen I är märkt i rött; Tillsatsen av kollagenfibriller av typ I ökar cellens förmåga att degradera gelatin. Intressant är den invadosomarkör Tks5 omorganiserad, och prickarna ersätts av linjära strukturer som representerar linjära invadosomer. Nedbrytningsområdena visualiseras i svart på grund av reduktionen av fluorescens. Skala bar = 5 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Konfokal mikroskopi analys av molekylär sammansättning och organisering av invadosomer i både gelatin och blandad matris betingelser. ( A ) I gElatin villkor, invadosomer är organiserade i prickar, och F-aktin (röd) samlokaliseras med Tks5 (grön, bottenpanel), men inte med DDR1 (grön toppplatta). Dessa är klassiska invadosomer. Skalstänger = 5 μm. ( B ) I gelatin-kollagenet i blandat matrix-tillstånd samlokaliserar DDR1 (grön topppanel) med kollagen I-fibrillerna (röd, toppanel), Tks5 (grön bottenpanel) och F-aktin (röd botten panel). Kollagenfibrillerna av typ I inducerar bildningen av linjära invadosomer. Skalstänger = 10 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Cellinvasionstest av MDA-MB-231-celler i en kollagen I-plugga. 1 h efter sådd av cellerna är kontrollinsatserna fixerade och färgade. ( A ) z-stack aUpphandling av kollagen I-pluggen utförs med användning av konfokal mikroskopi. Cellerna invaderar inte kollagen I-pluggen vid denna tidpunkt; I stället förblir de överst på kollagenet jag pluggar. Således används detta som kontrollpunkten när ingen invasion uppstår. MMP-aktivering är nödvändig för att cellerna ska invadera en kollagen I-kontakt vid denna densitet. ( B ) Tre dagar efter sådd invaderar några celler kollagen I-pluggen. Denna analys möjliggör observation och kvantifiering av cellinvasion. Dessutom kan det användas för att studera effekterna av olika droger eller siRNA, till exempel. Skala bar = 20 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Klassiskt studeras invadosomer in vitro utan hänsyn till mikromiljön och matrisen på vilken cellerna är pläterade. Flera typer av matriser används för närvarande, däribland gelatin, fibronektin, vitronektin eller fibrillärt kollagen med hög densitet (HDFC) 7 , 11 ; Emellertid är dessa ofta inte representativa för mikromiljön i vilka cellerna är bosatta och inte fysiologiskt relevanta. Här användes en ny typ av matris, som består av en association mellan kollagen av gelatin och fibrillär typ I. Användningen av kollagenfibriller av typ I tillåter oss att markera en ny klass av invadosomer, kända som linjära invadosomer, vilka specifikt bildar kollagen I i sin fysiologiska arkitektur 7 . Märkning av kollagen Jag tillåter oss att observera linjära invadosomer längs fibrerna och att kvantifiera deras bildning med hjälp av cellulära markörer såsom Tks5 och kortaktin. Använda miXed matris har vi identifierat en ny receptor, discoidin domänreceptorn 1 (DDR1), som är involverad i bildandet av linjära invadosomer 8 .
Den 2D-blandade matrisen tillåter oss att kvantifiera matrisnedbrytningsaktiviteten för linjära invadosomer via zymografi- in situ- analysen. Denna analys rapporterar proteolysaktiviteten hos MMP genom att analysera närvaron av svarta hål i det fluorescerande gelatinskiktet. Intressant ökar organisationen av F-aktin i linjära invadosomer matrisnedbrytningsaktiviteten jämfört med endast gelatin 7 . En begränsning av denna analys är att gelatin är en icke-fysiologisk matris, och det har visats att en mer fysiologisk matris förändrar det cellulära svaret på mikromiljön. En ytterligare begränsning existerar i hur MMP-aktivitet kvantifieras på gelatin-kollagen I-blandade matriser. Endast gelatinnedbrytningen som lokaliseras under kollagen I fiGlasögon kan kvantifieras; Därför är detta en indirekt metod för att kvantifiera kollagen I-matrisnedbrytning. En alternativ metod för att visualisera nedbrytningsaktiviteten hos linjära invadosomer är att märka kollagen I-fibrerna med en specifik antikropp mot kollagenklyvningsställen (Col1-3 /4 C, immunoglobulin). Detta möjliggör visualisering av klyvda fibrer genom immunofluorescens. På grund av cellmigrering är emellertid denna antikropp inte särskilt specifik i 2D för nedbrytning på grund av linjär invadosombildning. Ett annat sätt att visualisera och kvantifiera nedbrytningsaktiviteten hos kollagen I-fibrerna är att använda multiphotonmikroskopi och andra harmoniska generationen 8 . Denna metod möjliggör avbildning av kollagen I-fibrer utan någon färgning.
Vår metod för polymerisering av kollagen av typ I är annorlunda jämfört med andra metoder som används i litteraturen 12 , 13 . Till exempel, Artym För att studera involvering av linjära invadosomer vid cellinvasion användes 3D-kollagen-I-proppanalysen. 3D-kollagen I-pluggen används redan av det vetenskapliga samfundet för att studera invasiva strukturer eller involvering av metalloproteinaser i invasionen 14 , 15 , 16 . Dessa typer av 3D-matriser har gränser för dessaR styvhet - till exempel är 3D-kollagen I-pluggen mindre stel än 2D-matrisen. Dessutom är kollagenens typ och ursprung också viktigt med avseende på den olika organisationen av kollagenfibrer in vivo 17 . Slutligen, med avseende på mikromiljökompositionen in vivo , fokuserades endast ett element i den extracellulära matrisen, typ I-kollagenet. Ytterligare studier är nödvändiga för att bestämma relevansen av linjära invadosomer in vivo . Förutom studien av linjära invadosomer kan den blandade matrisen som beskrivs häri användas med andra typer av matriskomponenter, såsom fibronektin, vitronektin och andra typer av kollagener ( t.ex. typ IV-kollagen). Detta protokoll kan anpassas beroende på vilka typer av matriselement som är av intresse och de processer som ska studeras. Det är emellertid klart att generering av komplexa och fysiologiska matriser möjliggör identifiering av neW vägar involverade i celladhesion, migration och invasion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
JDM stöddes av ett doktorskt stipendium från INSERM / Région Aquitaine och stöds nu av ett postdoktoralt ARC-stipendium och Tisch Cancer Institute på Mount Sinai School of Medicine. EH stöds av en doktorand från Ministère de l'Enseignement Supérieur et de la Recherche. ZE stöds av ett postdoktorskt stipendium från Agence Nationale de la Recherche (ANR). CM stöds av Tisch Cancer Institute vid Mount Sinai School of Medicine och JJBC stöds av NIH / NCI bidrag K22CA196750, TCI Young Scientist Cancer Research Award JJR-fonden och Tisch Cancer Institute vid Mount Sinai School of Medicine. Detta arbete stöddes av ett bidrag från ANR-13-JJC-JSV1-0005. FS stöds av "Ligue nationale contre le cancer". VM och FS stöds av finansiering från "Equipe Labellisée Ligue Nationale contre le Cancer 2016" och Institut National du Cancer, INCA_8036 och PLBio2012.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin solution | Sigma | G1393 | Stock 20 mg/ml used at 1 mg/ml |
| Gelatin from pig skin Oregon green 488 conjugate | Molecular probe life technologies | G13186 | 5mg dilute at 1 mg/ml in sterile water |
| Microscope cover glasses | Marlenfeld GmbH & Co | 111520 | Ø12mm No.1 |
| 2.5% Glutaraldehyd in 0.1M sodium cacodylate buffer pH 7.4 | Electron microscopy science | 15960 | Dilute at 0.5 % in sterile water |
| 1x PBS pH 7.4 | Gibco by life technologies | 10010-015 | Use this PBS in all steps before fixation |
| Collagen I Rat tail | Corning | 354236 | |
| 5 carboxy X rhodamin siccinimidyl ester | Life technologies | C-6125 | |
| DPBS 1x + calcium + magnesium | Gibco by life technologies | 14040-091 | |
| Paraformaldehyde 16% solution | Electron microscopy science | 15710 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Triton X 100 | Sigma | T9284 | |
| 10x PBS buffer pH 7.4 | Ambion | AM9625 | Dilute at 1X in water Use in steps after fixation |
| Tks5 antibody | Santa Cruz | sc-30122 | Invadosome markers Dilution : 1/100 |
| Cortactin 4F11 antibody | Millipore | 5180 | Invadosome markers Dilution :1/100 |
| DDR1 antibody | Cell signaling | 5583 | Linear invadosome receptor |
| Dilution :1/100 | |||
| Phalloidin FluoProbes | Interchim | FT-AZ0330 | Fibrillary actin marker Dilution :1/200 |
| Hoechst | Sigma | 33258 | Nucleus marker Dilution :1/200 |
| Secondary antibodies FluoProbes | Interchim | FP-488 FP-547H or FP-647H | |
| Albumin from bovine serum | Sigma | A2153 | Dilute at 4% in 1X PBS |
| Fluoromount G mounting medium | Interchim | FP 483331 | |
| ImageJ software | Public domain | http://www.macbiophotonics.ca/imagej/ | |
| Cell culture insert | Corning | 353097 | 8.0µm pore size / 24 wells |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma | 221465 |
References
- Ramaswamy, S., Ross, K. N., Lander, E. S., Golub, T. R. A molecular signature of metastasis in primary solid tumors. Nat. Genet. 33, 49-54 (2003).
- Gilkes, D. M., et al. Collagen prolyl hydroxylases are essential for breast cancer metastasis. Cancer Res. 73, 3285-3296 (2013).
- Linder, S., Wiesner, C., Himmel, M. Degrading Devices: Invadosomes in Proteolytic Cell Invasion. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 27, 185-211 (2011).
- Murphy, D. A., Courtneidge, S. A. The 'ins' and 'outs' of podosomes and invadopodia: characteristics, formation and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 12, 413-426 (2011).
- Di Martino, J., et al. Cdc42 and Tks5: a minimal and universal molecular signature for functional invadosomes. Cell Adh. Migr. 8, 280-292 (2014).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. J. Cell Sci. 122, 3015-3024 (2009).
- Juin, A., et al. Physiological type I collagen organization induces the formation of a novel class of linear invadosomes. Mol. Biol. Cell. 23, 297-309 (2012).
- Juin, A., et al. Discoidin domain receptor 1 controls linear invadosome formation via a Cdc42-Tuba pathway. J. Cell Biol. 207, 517-533 (2014).
- Martin, K. H., et al. Quantitative measurement of invadopodia-mediated extracellular matrix proteolysis in single and multicellular contexts. J. Vis. Exp. , e4119 (2012).
- Diaz, B. Invadopodia detection and gelatin degradation assay. Bio-protocol. 3, 1-8 (2013).
- Artym, V. V., et al. Dense fibrillar collagen is a potent inducer of invadopodia via a specific signaling network. J. Cell Biol. 208, 331-350 (2015).
- Schachtner, H., et al. Megakaryocytes assemble podosomes that degrade matrix and protrude through basement membrane. Blood. 121, 2542-2552 (2013).
- Schoumacher, M., Glentis, A., Gurchenkov, V. V., Vignjevic, D. M. Basement membrane invasion assays: native basement membrane and chemoinvasion assay. Methods Mol. Biol. 1046, 133-144 (2013).
- Wolf, K., Muller, R., Borgmann, S., Brocker, E. B., Friedl, P. Amoeboid shape change and contact guidance: T-lymphocyte crawling through fibrillar collagen is independent of matrix remodeling by MMPs and other proteases. Blood. 102, 3262-3269 (2003).
- Geraldo, S., et al. Do cancer cells have distinct adhesions in 3D collagen matrices and in vivo? Eur. J. Cell Biol. 91, 930-937 (2012).
- Monteiro, P., et al. Endosomal WASH and exocyst complexes control exocytosis of MT1-MMP at invadopodia. J. Cell Biol. 203, 1063-1079 (2013).
- Wolf, K., et al. Collagen-based cell migration models in vitro and in vivo. Semin. Cell Dev. Biol. 20, 931-941 (2009).
