Introduction
Infarto del miocardio (MI) è una delle principali cause di morte e disabilità in tutto il mondo. La malattia coronarica è la causa principale; MI deriva da ischemia consecutivo a eventi coronarici quali l'occlusione. Quando riperfusione non viene eseguita entro le prime 6 ore, ischemia induce necrosi miocardica irreversibile. Nei pazienti, la caratterizzazione di MI si basa su diversi strumenti diagnostici, tra cui i segni clinici, elettrocardiogramma, valutazione dei livelli plasmatici di biomarcatori, l'ecocardiografia, risonanza magnetica per immagini, e istologica analisi 1. Acuta e cronica MI sono classificati in due diverse fasi di pregiudizio secondo i tempi della necrosi miocardica rispetto al tempo della occlusione coronarica. La fase acuta, che si verificano durante i primi 7 giorni, è associato con la perdita di cardiomiociti, infiammazione estesa, e il reclutamento di fibroblasti. La fase sub-acuta, caratterizzata da guarigione del tessuto cardiaco e la formazione di una cicatrice, si verificatra 1 e 4 - 6 settimane. Espansione dell'infarto, assottigliamento della parete del ventricolo, e il ventricolo dilatazione caratterizzano la fase cronica. Ampia rimodellamento del ventricolo sinistro si traduce progressivamente in grave insufficienza cardiaca 2.
MI indotta da permanente discendente anteriore sinistra (LAD) legatura rappresenta il modello roditore livello di infarto miocardico cronico. I imita legatura coronarie l'occlusione coronarica. Le dimensioni dell'infarto dipende dal sito della legatura. Caratterizzazione di danno ischemico del miocardio in un modello di roditore è classicamente eseguita utilizzando i livelli plasmatici di biomarker, come la troponina I e T 3, l'ecocardiografia, risonanza magnetica, e istologia 4,5. livelli di biomarker sono correlati con l'entità della morte dei cardiomiociti. L'ecocardiografia valuta la funzione ventricolare sinistra di valore derivante da anomalie di movimento della parete regionali. Inoltre, le tecniche di imaging non invasive, come la risonanza magnetica o ad alta risoluzioneecocardiografia, permetta la valutazione della riduzione di movimento della parete, il volume dell'area cicatriziale con ridotta perfusione e miocardio vitale, e l'assottigliamento della parete. dimensioni LV permettono la valutazione accurata della dimensione dell'infarto. Infine, la quantificazione del miocardio vitale e morti può essere eseguita un'autopsia con macchie specifiche di sezioni istologiche di cuori raccolte e consente la verifica della dimensione dell'infarto (IS). Un'altra caratteristica importante è la valutazione dell'indice di espansione dell'infarto (EI) 6. L'EI è associato con l'infarto transmurale e inizia entro i primi 3 giorni. L'EI è caratterizzata da una progressiva riduzione di spessore della parete, un aumento delle dimensioni della cavità LV, e conseguenti cambiamenti di forma LV.
Per valutare l'efficacia terapeutica di nuovi trattamenti - in particolare, le strategie di rigenerazione basata su cellule, matrici, e gene valutazione delivery-accurata MI nei roditori è di fondamentale importanza.Quando misurato su una singola sezione trasversale ottenuta a livello muscolo papillare, la dimensione IS può essere polarizzato a causa della grande variabilità che esiste nello sviluppo dell'infarto seguente legatura LAD; l'infarto apice potrebbe essere poi occultato. È importante sottolineare che le metodologie più accurate alle dimensioni MI determinato sono stati descritti per topi o ratti 7-9 10. Tuttavia, IS è insufficiente per quantificare con precisione LV rimodellamento o riduzioni terapeuticamente indotte (o prevenzioni) del rimodellamento. Infatti, IS è comunemente espressa come percentuale del volume totale LV valutata su sezioni trasversali del cuore. Anche se questo metodo è valido per infarto miocardico acuto, l'assottigliamento della parete LV si verificano durante il rimodellamento rimane sotto-valutato 11,12. Una completa quantificazione morfometrica delle dimensioni dell'infarto e cambiamenti strutturali dovrebbe quantificare diversi parametri, quali la lunghezza endocardici ed epicardici e diametri, così come infarto e zone sane. Descriviamo un appr metodologicaoach per valutare con precisione MI e rimodellamento in un modello di ratto cronica.
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Protocol
Tutti gli animali hanno ricevuto cura umana nel rispetto della Convenzione europea sulla cura degli animali. Le procedure chirurgiche sono state eseguite in conformità con la legge svizzera sulla protezione degli animali dopo aver ottenuto l'autorizzazione del veterinario di Stato, Friborgo, approvato dal veterinario, la Svizzera federale.
Raccolta 1. Cuore
NOTA: Tutti gli interventi chirurgici sono stati eseguiti in anestesia isoflurano. Gli sforzi sono stati fatti per ridurre la sofferenza degli animali. In particolare, tutti gli animali hanno ricevuto una iniezione sottocutanea di 0,1 mg / kg buprenorfina pre-anestesia. Il protocollo chirurgico per induzione di infarto miocardico è stato precedentemente descritto altrove 13.
- Eseguire una sternotomia su un animale myocardially infartuato in anestesia (animale intubato, 2,5% isoflurano, anestesia corretta confermati dalla zampa pizzico reflex).
- Aprire l'animale tagliando la pelle e poi i muscolicon le forbici chirurgiche. Tagliare le costole a sinistra ea destra, e quindi rimuovere il petto.
- Rimuovere le adesioni rimanenti dopo l'intervento chirurgico precedente (LAD legatura). Tagliare l'aorta e rimuovere il cuore. Mettere il tessuto in 1 M KCl (in PBS), e poi lavare con PBS.
2. Preparazione del tessuto
- Mettere il cuore infartuato longitudinalmente in una matrice acrilica cuore di ratto. Tenerlo a -20 ° C per 1 ora.
- Tagliare cuore direttamente nella matrice con una lama di rasoio con una trasversale. Assicurarsi che ogni fetta ha uno spessore di 2 mm. Tagliare circa 5 - 7 diapositive per ogni cuore (in base al livello rimodellamento); questo è chiamato campionamento sistematico.
- A questo punto, eseguire la colorazione cloruro di 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) è facoltativo (mantenere l'orientamento del cuore fette base-apice).
- Incubare in 1% TTC in PBS per 50 min a 37 ° C. Incubare in 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a 1 ora. Mettere le sezioni between due lastre di vetro con distanziatori 2 mm e scattare foto con un microscopio stereologica accoppiato con una macchina fotografica a 15X di ingrandimento.
ATTENZIONE! Paraformaldeide è tossico.
- Incubare in 1% TTC in PBS per 50 min a 37 ° C. Incubare in 4% paraformaldeide (PFA) per 20 minuti a 1 ora. Mettere le sezioni between due lastre di vetro con distanziatori 2 mm e scattare foto con un microscopio stereologica accoppiato con una macchina fotografica a 15X di ingrandimento.
- Far scorrere il congelamento (1 opzione st)
- Mettere ciascun vetrino in uno stampo di plastica (10 x 10 x 5 mm) con supporto per cryotomy (temperatura di taglio ottimale, OCT) di montaggio, mantenere l'orientamento (posizionare il lato apice orientata della sezione giù sul fondo dello stampo). Congelare i blocchi con vapori 2-metilbutano sotto azoto liquido di raffreddamento per 10 - 15 minuti. Infine, memorizzare il tessuto a -80 ° C.
- Paraffinization (opzione 2 nd)
- Posizionare ciascuna diapositiva incorporamento cassette (mantenere l'orientamento posizionando il lato apice orientata della sezione sul fondo della cassetta) e poi in 4% PFA per 24 ore. Mettere in una macchina durante la notte processatore.
- Incubare in etanolo al 70% per 2 ore. Incubare a Ethanol 95% per 2 ore. Incubare in etanolo 100% per 3 ore. Incubare in xilolo per 4 ore. Incubare in paraffina (fuso a 60 ° C in forno) per 5 ore. Infine, fare blocchi, grazie all'integrazione di ogni diapositiva cuore in paraffina.
- Posizionare ciascuna diapositiva incorporamento cassette (mantenere l'orientamento posizionando il lato apice orientata della sezione sul fondo della cassetta) e poi in 4% PFA per 24 ore. Mettere in una macchina durante la notte processatore.
3. Masson-Goldner colorazione tricromica
- Rendere sezioni di tessuto da blocchi di paraffina con un microtomo manuale (spessore 5 um) o dai blocchi oltremare con un criostato impostato a -18 ° C (spessore 7 micron).
- Macchia un vetrino da ogni parte del cuore per ogni ratto (3 - 4 sezioni trasversali per vetrino) con Masson-Goldner colorazione tricromica (vedi allegato).
NOTA: Inizia da questo passaggio per le sezioni di paraffina.- Sciogliere i vetrini a 60 ° C in un forno. Sotto una cappa aspirante, li Deparaffinare in xilolo due volte per 10 minuti ciascuno. li Reidratare in 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua distillata per 3 minuti ciascuno.
NOTA: Inizia da questo passaggio per il cryosectionS. - fissarli in Bouin soluzione durante la notte. Poi, sciacquarli sotto acqua corrente per 10 - 15 minuti. Sciacquare con acqua distillata. incubare in ematossilina di Mayer per 3 min.
- Rimuovere le diapositive e lasciarli in acqua distillata per 5 min. Poi, incubare in acido Fuchsin-Ponceau per 5 min. Risciacquare in acido acetico 1% per 1 min.
- Poi, incubare in acido fosfomolibdico Arancio G per 1 min. Risciacquare in acido acetico 1% per 1 min, incubare a colorante verde luce per 10 minuti, e sciacquare in acido acetico 1% per 1 min.
- li Disidratare in etanolo al 70% (30 sec), 95% di etanolo (30 sec), e il 100% di etanolo (5 min). Mettere una goccia di un mezzo di montaggio resinoso sulle sezioni di tessuto, coprire con coprioggetto, e lasciarli asciugare.
- Sciogliere i vetrini a 60 ° C in un forno. Sotto una cappa aspirante, li Deparaffinare in xilolo due volte per 10 minuti ciascuno. li Reidratare in 100% di etanolo, 95% di etanolo, 70% di etanolo e acqua distillata per 3 minuti ciascuno.
4. Infarct Size Analysis
- Acquisire una immagine da ogni diapositiva su uno stereomicroscopio (15x) accoppiato con una macchina fotografica. Fotografare un righello con la stessa impostazioneS.
- Utilizzare immagine software di analisi per misurare lo spessore della cicatrice in mezzo dell'infarto, lo spessore del setto, la zona della cavità ventricolo sinistro (LV), la zona dell'infarto, e l'area di tessuto LV utilizzando.
- Impostare la scala con l'immagine righello (Figura 1A).
- Clicca su misurazioni quindi selezionare Imposta fattore di conversione. Tracciare una linea sulla barra di calibrazione. Fare clic destro sull'immagine e cliccare su taratura finale. Si noti il valore bar, e quindi fare clic su OK.
- Selezionare il LV dalla foto del cuore colorato (Figura 1B). Utilizzare lo strumento segmento multiplo. Selezionare il punto per punto LV, e quindi fare clic destro Copia / incolla da nessuna parte.
- Misurare lo spessore della cicatrice e membrana con lo strumento di misurazione singolo segmento (Figura 1C
- Rileva automaticamente il LV cavità, infarto, e le aree LV utilizzando lo strumento di misurazione locale automatico in modalità RGB (Figura 1D).
- Fare clic sullo strumento. Attiva solo Bordi e Contigui in modalità RGB. Infine, fare clic all'interno dell'area di interesse per rilevarla. Se necessario, utilizzare strumenti di precisione.
- Impostare la scala con l'immagine righello (Figura 1A).
- Calcolare le dimensioni dell'infarto come rapporto dell'area infartuata all'area LV.
- Calcolare l'indice di espansione come segue: [LV zona cavità / intera area LV] / [spessore infarto / spessore del setto], con l'intera area LV comprendente sia la cavità LV e aree di tessuto LV.
- Infine, calcolare un "medio" per ogni cuore come segue: [media dell'indice di espansione dalle diapositive infartuati] * [numero di diapositive infartuati / numero totale di diapositive].
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Representative Results
Sei settimane post-LAD legatura, cuori sono state raccolte da ratti di Lewis. sezioni di tessuto 2 mm, sono state ottenute dall'apice alla base. Una procedura di colorazione TTC è stata effettuata per visualizzare l'area infartuale, che appare in bianco, e il miocardio sano, che appare in rosso (Figura 2). A seconda del sito di legatura LAD, le dimensioni dell'infarto varia. Per le grandi MI, infarti transmurale sono stati osservati dal vertice alla base (Figura 2A). Infarti piccoli presentati tessuto infartuato bianca visibile dall'apice alla metà della sezione del cuore (Figura 2B). Per piccoli infarti non transmurale, tessuto fibrotico è stata osservata solo su uno o due sezioni dall'apice (Figura 2C).
Sottili sezioni di 5 micron da ogni fetta di cuore sono stati tagliati e colorati con Masson-Goldner tricromica. Immagini di tutta la sezione trasversale del cuore eranoacquisito sotto un stereomicroscopio (Figura 3). tessuti sani apparso in tessuto rosso e il connettivo verde. La discriminazione tra ciascun colore può essere facilmente eseguita con un software di analisi di immagine.
Gli spessori del dell'infarto e il setto, la zona della cavità LV e la superficie totale LV sono stati misurati e calcolati per calcolare l'EI (Tabella 1). L'EI è stata calcolata per ogni sezione. A seconda delle dimensioni del cuore, il numero di sezioni variava da 5 a 7. Per ogni cuore, l'EI è una media di EI da ciascuna sezione. Il EI variare da 0 al 0.278 e ha rivelato una vasta gamma di infarti miocardici, con un CV del 58%. In confronto, la media della percentuale di infarto al LV variare da 0 a 0,241, con un CV del 54% (Tabella 1). L'EI e la percentuale di infarto erano significativamente correlati; un non-parametrica analisi Spearman disponibile un coefficiente di correlazione r-value di 0,491 (p = 0,005) (Figura 4A). Per chiudi valori EI, come 0,11 e 0,13, la percentuale di infarto varia da 5.8 al 24,1%.
la funzione del cuore è stata valutata mediante ecocardiografia ad alta risoluzione a 6 settimane post-LAD legatura su animali anestetizzati ed è stata eseguita una volta prima della raccolta del cuore. L'EI calcolata dalla quantificazione istologica correlata in modo significativo con l'EF. L'analisi non-parametrica Spearman fornito un valore di R di -0,709 (p = 0,005) (Figura 4B).
Figura 1. Step-by-step Illustrazione del Uso del Software Image Analysis. misure di colore di delimitazione e di lunghezza automatico incluso le varie fasi. A. Calibrazione: La scala dell'immagine è stato istituito. Un'immagine diun righello è stata presa nelle stesse condizioni come la sezione cuore. La lunghezza del righello è stato caratterizzato per definire il fattore di conversione scala. Conversione da pixel a millimetri è stata eseguita. Selezione B. LV: Il ventricolo destro è stato tagliato fuori dal quadro utilizzando lo strumento di selezione del software. C. LV misurazione dello spessore della parete e del setto: Lo strumento di misurazione singolo è stato utilizzato per quantificare le distanze. Le barre indicano scala 3 mm. Zona quantificazione D. automatica: delimitazione automatica del colore è stata eseguita in modalità RGB. Auto-selezione è stata effettuata dopo aver selezionato la modalità auto-selezione. Selezione del colore a base può essere modificato; l'investigatore eseguito il controllo visivo del tessuto verde selezionato e aumentato o diminuito la regione selezionata come necessario. Le barre indicano scala 3 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. 
Figura 2. Cuore sezioni colorate con TTC. sezioni 2 mm del cuore pieno sono state colorate con TTC. miocardio sano è apparso nei tessuti rossi e fibrotici in bianco. Tre cuori con diverse dimensioni infarto sono presentati. A: grande infarto transmurale, B: media infarto, e C: piccolo infarto. Le barre indicano scala 3 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Sezioni cuore colorate con Masson-Goldner Trichrome. sezioni a 5 micron sono stati tagliati da ogni sezione cuore ottenuto 6 settimane post-LAD legatura. Stasezioni INED sono stati posti sotto uno stereomicroscopio. Immagini di sezioni piene sono stati ottenuti con 15X di ingrandimento. Il quadro rappresentativo, ottenuto a livello dei muscoli papillari (Freccia indietro), mostra miocardio sano nei tessuti rossi e fibrotici in verde. La figura illustra la delimitazione colore automatico con il software di analisi di immagine, nonché il sito in cui sono stati misurati lo spessore dell'infarto e setto (linee nere). Le barre indicano scala 3 mm. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. Correlazione tra l'espansione Index (EI) e la percentuale di dell'infarto relativi al VL (A) o la frazione di eiezione (EF) (B). La regressione lineare (linea nera) e il 95% confidareintervalli SNO (linee tratteggiate) sono rappresentati. Il Spearman R-valore non parametrico è segnalato. A: La percentuale di infarto e di EI significativamente correlata (r = 0,567; p = 0,003). L'indice di espansione dell'infarto (EI) è stata calcolata come [area LV cavità / intera area LV] / [spessore infarto / spessore del setto]. L'intera area LV è stata misurata come la cavità LV combinato e zona di tessuto LV. La percentuale dell'infarto è stata calcolata come area tessuto superficie tessuto LV / infarto. B: La funzione valutata a 6 settimane post-LAD legatura utilizzando una ecocardiografia ad alta risoluzione significativamente correlata con EI. Entrambi i parametri erano significativamente correlati (r = -0,709; p = 0.005). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
tavolo1: parametri misurati sulle sezioni di cuore Masson Goldner-macchiati.
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Discussion
I passaggi critici all'interno del protocollo
tessuto fibrotico può essere valutata con precisione in un modello di ratto MI cronica con campionamento sistematico del cuore e l'immagine raccolta analisi di sezioni istologiche tricromatiche macchiato ottenuti dalla base all'apice. Due passi sono particolarmente importanti per l'attuazione del protocollo di successo. In primo luogo, l'uso di KCl per la raccolta cardiaca permette il muscolo cardiaco per essere mantenuto in uno stato rilassato. Questo passaggio è importante per il confronto di dimensioni infarto provenienti da diversi cuori. In secondo luogo, la fissazione overnight della sezione in soluzione Bouin è fondamentale avere luminosa colorazione tricromica.
Modifiche e risoluzione dei problemi
Assenza di colorazione può essere dovuto a difficoltà durante il fissaggio della sezione in soluzione di Bouin, come riduzione del tempo di incubazione o scaduto soluzioni Bouin. La colorazione TTC è opzionale e could essere usato per visualizzare le dimensioni dell'infarto in modo rapido, ma non quantitativa. È importante notare che TTC può essere eseguita per lo stesso cuore prima dell'inserimento sia Office o paraffina.
LIMITI DELLA TECNICA
L'attuale approccio permette di scegliere una tra le sezioni di cuore inclusi in paraffina e crio-conservato e può essere utilizzato per immunocolorazione. Tuttavia, il cuore pieno deve essere sezionato, e il tessuto non può essere utilizzato per ulteriori analisi, quali western blot o RT-PCR per proteine e analisi dell'espressione genica.
Importanza della tecnica con rispetto agli attuali metodi alternativi /
Poiché le procedure di quantificazione e, in particolare, il numero di sezioni analizzate variano ampiamente tra le indagini, che definisce il numero minimo di sezioni necessarie per ottenere una quantificazione affidabile è fondamentale. Takagawa et al. 9 ha dimostrato che l'affidabilità è massimizzata con un cuore minimo numero di slice di 6 - 8 sezioni di tutto il cuore di un topo con intervalli di 1 mm. Nel presente protocollo, 5 - 7 sezioni di tutto il cuore di ratto sono stati ottenuti durante l'esecuzione di 2 mm di spessore sezionamento. Inoltre, le sezioni 2 mm sono standard e le dimensioni di uso frequente per il TTC colorazione. Inoltre, il campionamento sistemica è semplice da applicare e presenta un aspetto periodica che permette caratterizzazione del cuore intero.
Da ciascuna delle fette 2 mm, sezioni 5 micron sono state tagliate e colorate. Per ogni sezione 5 micron, quantificazione dello spessore del setto, spessore della cicatrice e la lunghezza, area totale cicatriziale, area totale LV, e la zona della cavità LV sono state eseguite, e la media di ciascun parametro è stato calcolato per ogni animale. Abbiamo usato Masson-Goldner colorazione di sezioni sottili, piuttosto che TTC colorazione di sezioni di 2 mm per migliorare l'accuratezza sia del rilevamento automatico del colore e la valutazionedi lunghezza. Infatti, colorazione TTC è soprattutto interessante per modelli riperfusione ischemica precoce fase o per l'individuazione della zona a rischio 8,14, piuttosto che per la fase cronica.
MI indotta da legatura LAD possono variare a seconda del sito di legatura. Nel modello miocardico cronico presentato, la dimensione legatura è stato intenzionalmente modificato per ogni animale, e risultati per le varie condizioni di dimensioni dell'infarto e rimodellamento erano presenti dopo 6 settimane. Di conseguenza, il calcolato EI rivelato una vasta gamma di infarti miocardici e sostenuto la differenza osservata nella funzione cardiaca correlata con EF. Quando si verificava vasta assottigliamento del segmento infartuata, la zona dell'infarto è stata notevolmente ridotta nel caso della fibrosi transmurale. In questa condizione, definendo le dimensioni dell'infarto calcolando l'area del tessuto infarto rispetto all'intera LV (espressa come percentuale del LV) sarebbe debolmente valutare l'estensione dell'infarto. La mancanza di cNell'int ne in considerazione per rimodellamento indotta dilatazione LV ed estremo assottigliamento della parete dell'infarto LV potrebbe sottostimare la dimensione dell'infarto, mentre un infarto presenti in assenza di assottigliamento muro sarebbe sovrastimare la dimensione infartuale, come rappresentato dai valori al di fuori del confidenza del 95% intervallo. Questa lacuna potrebbe essere eliminata attraverso il calcolo della EI.
E 'stato dimostrato che il cambiamento di forma LV è correlata positivamente con l'EI e diradamento parete 15, 16. Sebbene EI può essere un predittore di funzione ventricolare sinistra, è importante sottolineare che ecocardiografia e analisi istologiche sono metodi complementari per valutare l'infarto del miocardio a livello funzionale e tessuti, rispettivamente. L'ecocardiografia permette studio longitudinale, e istologiche analisi di fornire test end-point fondamentali che consentono ulteriore quantificazione di LV morfologia, come ad esempio lo spessore della parete.
Le applicazioni future o verso l'indietroer padroneggiare questa tecnica
Il campionamento sistemica dell'intero cuore e il calcolo della EI sono di particolare interesse nel valutare cronica MI. Inoltre, questo metodo sarà adatto per la valutazione dell'efficacia del trattamento, in particolare per nuovi trattamenti, come cellulo e trattamenti volti a ridurre dimensioni dell'infarto e rimodellamento matriciale. quantificazione affidabile di espansione dell'infarto è di fondamentale importanza per il confronto di animali non trattati e trattati, come end-point analisi istologica preclude il confronto delle dimensioni dell'infarto pre e post-trattamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acrylic rat heart matrix 2 mm | 72-5015 | Harvard Appartus | |
| Inspira advanced volume controlled ventilator | Harvard Apparatus | 557058 | |
| Catheter Insyte 14 G | BD | 381267 | |
| O.C.T | BDHA361603E | VWR | |
| TTC | T8877-10G | Sigma Aldrich | |
| Mayer hematoxylin | MHS32-1L | Sigma Aldrich | |
| Acid Fuchsin CI 42685 |
F8129-50G | Sigma Aldrich | |
| Ponceau Xylidin CI 16150 |
P2395-25G | Sigma Aldrich | |
| Orange G CI 16230 |
O3756-100G | Sigma Aldrich | |
| Light green CI 42095 |
L5382-25G | Sigma Aldrich | |
| KCl | P9333-500G | Sigma Aldrich | |
| Xylol | 10315083 | HoneyWell | |
| Ethanol absolute | 10303990 | HoneyWell | |
| 2-methylbutane | M32631-1L | Sigma Aldrich | |
| Stereogical microscope | SM2800 | Nikon | |
| Formaldehyde | 99340 | Reactolab | |
| Embedding cassette | K113.1 | Carl Roth | |
| Bersoft Image measurement Software | Bersoft.com | Licensed software |
References
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