Vi præsenterer en metode til opnåelse af billeder sub-nanometer opløsning med amplitude-modulation (aflytning mode) atomic force mikroskopi i væske. Metoden demonstreres på kommercielle atomar kraftmikroskop. Vi forklarer rationalet bag vores valg af parametre og foreslå strategier for opløsning optimering.
Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user’s specific system.
Siden sin opfindelse, tre årtier siden, atomic force mikroskopi (AFM) 1 har etableret sig som en teknik til valg for at undersøge prøver på nanoskala, især hvor gennemsnit over makroskopiske arealer er ikke muligt, og lokal information er påkrævet. I en typisk AFM måling afbøjningen af en fleksibel cantilever anvendes til at kvantificere interaktionen kraft mellem et lille antal molekyler og en UltraSharp spids monteret ved enden af udliggeren. Afhængigt af hvilken type af interaktioner og de frister overvejes, kan en lang række oplysninger udledes, herunder de viskoelastiske egenskaber af bløde biologiske membraner 2,3, styrken af et enkelt kemisk eller molekylær obligation 4,5, de atomistiske oplysninger om en overflade 6 – 8, den magnetiske 9, kapacitiv 10, ledende 11, termiske 12,13 og kemiske 14 egenskaber af prøver <sup> 15. Del af succesen af AFM er dens evne til at arbejde på en bred vifte af materialer 16 og i flere miljøer såsom vakuum 17, gas 11,18 eller flydende 19,20, fordi den ikke er afhængig af en specifik kraft mellem probe og prøve .
Men i praksis, der opererer AFM i andre end det omgivende forhold kan være udfordrende og mange offentliggjorte resultater stadig opnås i luft. En yderligere vanskelighed kommer fra det faktum, at det sædvanligvis nødvendigt at operere AFM i dynamisk tilstand (vibrerende spids) for at bevare både spidsen og prøven ved at undgå store friktionskræfter. Selv om mere udfordrende, kan dynamisk drift i princippet give flere oplysninger om den analyserede prøve, og uden tab af rumlig opløsning. I det seneste årti, har inden for dynamiske AFM i flydende set vigtige udviklinger, fra fremkomsten af video-rate AFM 21 – 23, til flerfrekvens målinger <sup> 24,25 og sub-nanometer billeddannelse af hydrering strukturer på grænseflader 26 – 31. AFM operationen, mens nedsænket i væske er nu rutinemæssigt anvendes i biologi og biofysik 32 – 36, polymerforskning 37, elektrokemi 38 – 40 og faststof-væske grænseflader karakterisering 41-44. Tilstedeværelsen af væske omkring vibrerende cantilever betydeligt ændrer sin dynamik 45 samt samspillet mellem spidsen og prøven 29,42. Når de anvendes korrekt, kan væsken udnyttes til at forbedre den billeddannende opløsning 26,29, med en typisk forbedring af næsten en størrelsesorden i forhold til den bedste opløsning opnået i omgivelsesbetingelser 46.
I AFM, den højeste rumlig opløsning opnåelige for en bestemt måling afhænger af både kvaliteten af selve AFM og arten af than interaktion undersøgt 20,47,48. På nuværende tidspunkt er de fleste high-end, kommercielt tilgængelige AFMs nuværende støjniveauer, der er tæt på den for termisk grænse 12, så den afgørende faktor for opløsning er normalt den tip-prøven interaktion. Det er effektivt den rumlige gradient af denne interaktion, der bestemmer opløsning: målinger baseret på kortrækkende, hastigt rådnende interaktion producere resultater højere opløsning end når længere rækkevidde interaktioner er på spil. Flydende, kan solvatisering kræfter forbedre billeddannelse beslutning, fordi de har tendens til at forsvinde i løbet af kun få molekylære diametre af væske (typisk <1 nm), når bevæger sig væk fra overfladen af prøven 49. Disse kræfter stammer fra interaktionen mellem de flydende molekyler og overfladen af prøven. En væske med en stærk affinitet for overfladen vil have tendens til at være mere ordnet og mindre mobile end bulk-væske ved grænsefladen med prøven 29,42,50. Som resultat,det vil tage mere energi til en vibrerende AFM tip til at fortrænge grænsefladespændinger flydende molekyler end bulk-væske 42, hvilket gør målingen meget følsomme over for lokale variationer i grænseflade-flydende egenskaber på nanoskala -den solvatering landskab.
For at udnytte solvatisering kræfter, der skal tages i betragtning adskillige praktiske aspekter. Først svingningsamplituden af spidsen skal være sammenlignelige med mængden af solvatisering kræfter, typisk <1 nm. Det andet den anvendte væske skal være en veldefineret solvatisering landskab ved overfladen af prøven. Makroskopisk, svarer det til at kræve en "befugtning" væske til prøven overvejes. For eksempel i vand er det lettere at opnå molekylært niveau beslutning om hydrofilt glimmer end på hydrofobe grafit 42,51. Endelig skal fjederkonstanten af cantilever støtter spidsen vælges passende 52,53. Når du arbejder i disse conbetingelser, har AFM ikke kun give molekylær-niveau billeder af grænsefladen, men det stammer også oplysninger om den lokale prøve-væske affinitet, som kan anvendes til at opnå kemisk information om prøvens overflade 54.
De mest almindelige dynamiske driftsformer for AFM i flydende er amplitude-modulation (AM, også 'aflytning mode') AFM og frekvens-modulation (FM) AFM. I det første tilfælde 55, spidsen raster-scanner prøven, mens dens vibration amplitude holdes konstant ved en tilbagekoblingssløjfe, der kontinuerligt re-justerer tip-prøven afstand. En topografisk billede af prøven stammer fra den korrektion, som feedback-sløjfe. I FM-AFM 28,41,56, er det oscillationsfrekvensen af cantilever / tip, konstant, mens spidsen scanner prøven. Begge teknikker giver sammenlignelige topografisk opløsning i væske 36,57. Kvantificering af spidsen-prøven interaktion synes at være mere straightforward og præcise i FM-AFM, men AM-AFM er lettere at gennemføre, mere robust, og tillader at arbejde med blødere støtteben, noget nyttigt for at studere let deformerbare eller sarte prøver. Betydeligt, AM-AFM er mere udbredt blandt AFM brugere, også af historiske grunde, men også på grund af det faktum, at det er teknisk lettere at kontrollere.
Selvom amplituden holdes konstant ved feedback-sløjfe under AM-AFM billeddannelse, er fase-lag mellem spidsen svingning og den drivende svingning lov til at ændre frit. Fase-lag kan give nyttige oplysninger om tip-sample interaktioner, er relateret til den energi, der spredes under svingning af spidsen på grænsefladen med prøven 58. Derfor fase-imaging kan erhverves samtidigt til topografisk billedbehandling, og er ofte komplementær i fremhæve heterogenitet af en prøve overflade. Fase billeddannelse er anvendt til forskellige kortlægning af interaktioner, herunder direkte kortlægning af friktion energi 42, viskoelastiske egenskaber 58 og hydrering landskab af en grænseflade 44.
Praktisk, at opnå billeder med høj opløsning i væsken forbliver ikke-triviel grund af det store antal parametre til styring, og fraværet af en enkel, systematisk protokol, som virker i enhver situation. Billedkvaliteten afhænger typisk af cantilever geometri og elasticitet, spidsen kemi, svingningsamplituden, og prøven stivhed, blandt andre 55. AFM målinger er også per definition perturbative til systemet. Som et resultat, kan skiftende imaging variabler og miljømæssige forhold uden ordentlig overvejelser føre til vanskeligheder i reproducerbarhed og / eller misrepresentative observationer og falske resultater.
Her præsenterer vi vores protokol for at opnå høj opløsning billeder af hårde og bløde prøver i opløsning, ved hjælp af kommercielle instrumenter drives i AMPLitude-modulation. Vores mål er at tilbyde en praktisk procedure for at optimere de vigtigste parametre, der kan påvirke beslutningen over forskellige prøver, forklarer i hvert tilfælde begrundelsen for vores valg fra de fysiske principper bag billeddannende proces. Vi detalje en trin-for-trin tilgang, fra underlaget rengøring og forberedelse, til valg af cantilever, justering af de billeddannende parametre og fejlfinding almindelige problemer. Rede for det videnskabelige rationale bag vores valg og procedurer for høj opløsning skal hjælpe gøre rationelle valg, når tilpasning af metoden, og tjene som et udgangspunkt for imaging nye systemer.
I hele denne tekst bruger vi AM til at henvise til den amplitude-modulation driftstilstand af en AFM. Vi henviser til den feedback parameter holdes konstant under enten cantilever afbøjning (kontakt-tilstand) eller svingning amplitude (AM-tilstand) som setpunkt værdi. I AM-tilstand, er cantilever eksternt drevneenten ved en akustisk svingning eller en pulseret laser fokuseret på bunden af udliggeren. Drevet amplitude er intensiteten af det eksterne oscillerende signal. Den absolutte værdi af drevet amplitude kræves for at opnå en given svingningsamplitude af cantilever afhænger af mange parametre, såsom fremgangsmåden til kørsel (akustisk, fototermisk eller magnetisk), cantilever fiksering og parametre (stivhed, geometri) og laser tilpasning. Den nøjagtige værdi af drevet amplitude er derfor ikke relevant, men det er justeret i hvert forsøg for at tilvejebringe en passende (og kvantificerbare) oscillation amplitude af cantilever. Når den drevne cantilever er langt væk fra prøven, og ingen dæmpning af dens vibrationer sker gennem tip-sample interaktioner, er dens svingningsamplitude kaldet frie svingninger amplitude. Som den vibrerende spids nærmer sig overfladen af prøven, dens amplitude begynder at falde. Hvis feedback er aktiveret, vil z-piezo Constgelige og re-justere sin udvidelse, så at kølen den valgte setpunkt amplitude, konstant. Den nominelle værdi normalt altid mindre end den frie amplitude. Det er almindeligt at henvise til setpunkt forholdet er forholdet mellem setpunktet amplitude (billeddannelse amplitude) til de frie amplitude. Jo mindre setpunkt ratio, jo barskere de billeddannende betingelser er.
Antages det, at den billeddannende væske og udliggeren stivhed er blevet udvalgt på passende, de mest kritiske trin i opnåelsen vellykket høj opløsning er justeringen af den billeddannende amplitude, og den samlede renlighed af det undersøgte system.
Amplituder svarende til tykkelsen af den grænseflade-væske-regionen (typisk mindre end 2 nm) prober hovedsagelig variation i egenskaberne af grænsefladespænding 42 opløsningsmiddel. Hvis svingningerne amplituden er for stor, vil den vibrerende spids krydse langtrækkende, ikke-lineære kraftfelter 52, som udelukker stabilitet cantilever bevægelse, og uundgåeligt ramte prøven uanset de billeddannende vilkår 29, hvilket resulterer i forringelse af beslutningen. Bortset fra tabet i opløsning, højere harmoniske begynder at dukke op i spidsen bevægelse og systemet bliver mere kompliceret at modellere 55. Alternativt, hvis den billeddannende amplituden er for lille oun del af grænsefladen probes (typisk specifikke lag af grænseflade-væske) og stabilt billeddannelse kan kun opnås med stive støtteben (> 10 N / m i vand 53) for et tilfredsstillende signal-til-støj-forhold, med risiko for skadelige bløde prøver over store højdevariationer. Behovet for stive køreledningsophæng er at overvinde den termiske støj, som kan blive mere markant, at signalet målt Når man arbejder med små amplituder, de langtrækkende interaktioner mellem spidsen og prøven er stadig til stede, men er stort set konstant og påvirker ikke høj opløsning kontrast i billederne opnået.
Rengøring af imaging miljø er af afgørende betydning, når det kommer til høj opløsning AFM. Uønskede forbindelser i systemet kan forstyrre både billeddannelse og kraften spektroskopi. Der er to hovedkategorier af forureninger, der har tendens til at påvirke forsøgene: (i) forurenende stoffer direkte synlig, når billeddannelse ( <strong> Figur 4B, 4C) og (ii) generel uforklarlig mangel på høj opløsning. Tilfælde (i) har tendens til at forekomme kun i stærkt idealiserede systemer såsom ved vand-glimmer grænseflade, hvor adsorberede molekylære aggregater, der interfererer med den yderste-prøve interaktioner er klart i kontrast mod atomisk fladt glimmer overflade (figur 4A). Før du ændrer spidsen og prøven, er det værd at erhverve spektroskopiske kurver med en stor afbøjning, effektivt at trykke hårdt spidsen mod prøven gentagne gange. Dette vil normalt skade en ny spids, men kan lejlighedsvis rense en beskidt tip eller inducere stabile hydrering sites egnede til billeddannelse. Dette tip vil dog uundgåeligt være afrundede og dermed være kun egnet til flad prøve selv om billedbehandling forbedres. I tilfælde af mistanke om forurening i stive prøver, kan det være værd at forsøge at billedet med den anden eigenmode af cantilever, inden du forsøger den noget destruktive ovenfor beskrevne. Det kræver blot swkløe den drivende frekvens til den anden eigenmode og justere amplituden / sætpunkt (se fejlfinding diskussionen nedenfor). Den effektive stivhed af cantilever stiger betydeligt, når drives på den anden eigenmode og enhver svagt adsorberet forurenende kan skubbes væk af spidsen, mens billeddannelse. Denne strategi erstatter ikke behovet for en ren prøve og drikkepenge, men tilbyder nogle yderligere muligheder for at erhverve tilfredsstillende billeder, når et tip / prøve er tydeligvis ikke ideel.
Figur 4: Eksempler på forurening observeret når imaging moskovitiske glimmer, der hæmmer høj opløsning billeddannelse. A: Mica afbildet i 5 mM RbCI – ingen forurenende partikler er synlige. B: Forurening i form af aggregater i størrelsesordenen et tocifret antal nm tværs mens billeddannelse i nominelt ultrarent vand. C: Selvstændige samlet strukturer dannet af kontamineringNant partikler formentlig amfifile karakter. Billeddannelse blev igen gennemført i nominelt ultrarent vand. D: lodret forskudt sektioner svarende til de stiplede linier i A, B og C illustrerer afvigelsen fra glimmer er atomisk flad overflade. Scale barer i A, B og C svarer til 300 nm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Case (ii) er mere almindelig og karakteriseret hovedsageligt af frustrerende, at sub-nanometer funktioner kan simpelthen ikke løses, uanset de billeddannende betingelser. Underskrivelsen af denne type situation er normalt synlig i kraft spektroskopi måling, som har tendens til at vise nogle uoverensstemmelser. Disse kan omfatte dårligt reproducerbare kurver og amplitude vs distance kurver, der afviger væsentligt fra en typisk S-formet form 42. Hvis forureninger, ioniske eller på anden måde, er Dispersed ensartet i hele væsken, kan de ikke vises i topografisk billedbehandling men kunne forstyrre hydrering struktur af prøven 69, hvilket er afgørende for at opretholde en regelmæssig tip-prøve interaktion 29 og opnå høj opløsning 70. Der kan også være direkte effekter af de forurenende stoffer på prøven, især i bløde, biologiske eksperimenter. For eksempel er det velkendt, at tilstedeværelsen af alkoholer (fra rensning procedure) kan fluidify gel-fase lipiddobbeltlag 71 – 73 umuliggør sub-nanometer-niveau opløsning. Hvis høj opløsning ikke er muligt, bør man være først taget i renseprocessen, især med fokus på alt udstyr, der kommer i kontakt med imaging løsning. Selv tilsyneladende stabile forbindelser såsom epoxyharpiksen kan solvat i fluidet til en vis grad, hvis ikke fuldt hærdet.
Høj opløsning billeddannelse med AM-AFM er krævende, kræver tålmodighed ogofte flere forsøg, før at nå de bedst mulige billeddiagnostiske forhold. Små eksperimentelle spørgsmål kan let blive vigtigt nok til at forhindre høj opløsning og fejlfinding færdigheder er afgørende. Herefter vi nævne nogle af de mest almindelige problemer, vi stødte med vores foreslåede løsning.
cantilever tuning
De fleste kommercielle AFMs bruge akustisk magnetisering at køre cantilever. I så fald tuning cantilever, som beskrevet i trin 5.4, nær dens resonansfrekvens ofte tilvejebringer tilstrækkelig ydeevne til drift i luft. I flydende miljøer, væsken har tendens til at inducere nogle kobling mellem forskellige mekaniske dele af AFM såsom cantilever chip og indehaveren. Dette kan påvirke den tilsyneladende resonans af cantilever, ofte illustreret ved en cantilever frekvensspektrum, der udviser mange skarpe toppe og dale sædvanligvis beskrives som en "skov af toppe". Som følge heraf er det ofte vanskeligt at finde tilsvact drivfrekvensen. Disse toppe også eksistere i gas-miljøer, men på grund af den høje værdi af kvalitet faktor cantilever, amplituden ved resonanser er betydeligt større 74,75. I flydende vælge den relevante top til at drive cantilever muligvis ikke let og kan kræve trial and error. I praksis frekvensen top med stejleste variation i amplitude i "skov af toppe" omkring resonansfrekvensen er normalt den bedste indsats trods bliver ikke nødvendigvis nøjagtigt på resonans, og ofte omfatter en drivende frekvens tilstrækkelig til at opnå høj opløsning billeddannelse.
Billede forvrængning
Imaging afdrift er ofte et problem, når de søger høj opløsning og gør billederne ser forvrængede (typisk strakt). Dens oprindelse er generelt termisk, enten fordi scanneren / AFM ikke har nået sin ligevægt driftstemperatur, eller fordi en del af prøven væsken fordamper hurtigt (fx billeddiagnostik i alkoholer ). I alle tilfælde, afdriften bliver ubetydelig ved termisk ligevægt. Det er derfor nyttigt at fastsætte temperaturen af prøven, hvis muligt. Ellers er det værd at forlade AFM til at scanne en blindprøve (stort format scanning ved langsom scanningshastighed) i flere timer, før udførelse af eksperimentet. Hvis fordampning ikke er et problem, er denne procedure gøres bedst efter trin 6 i proceduren, idet man først trække spidsen en kort afstand (f.eks 20 pm) fra overfladen. Lejlighedsvis vil afdrift forblive selv efter omfattende thermalization. Dette indikerer normalt, at cantilever eller dens chip delvis trække prøven mens billedbehandling, noget, der kan ske på bløde sammenhængende prøver, såsom tynde film, eller hvis spidsen / cantilever / chip er ikke passende placeret. På chips, der vært mere end en cantilever / tip, er det ofte nyttigt at bryde cantilever, der ikke er i brug i stedet for at lade dem trække hen over overfladen.
ionstyrke
ntent "> Da imaging er domineret af den grænseflade-væske, det er nogle gange praktisk at tilføje nogle salt til høj opløsning billeddannelse af den ladede overflade i vand. rolle saltet er dobbelt. For det første ændrer hydrering landskab i overflade afbildet på adsorption, som ofte øger kontrasten. for det andet, det hjælper skærmen stærke elektrostatiske interaktioner mellem spidsen og prøven (fx på glimmer). Generelt større ioner, kalium, rubidium og cæsium tillader bedre billeder på grund af deres specifikke hydrering egenskaber 76, og det faktum, at de ofte adsorberer hovedsagelig i en unik hydrering tilstand 77.Dårlig cantilever / tip
Hvis der er mistanke om, at cantilever er en kilde til forurening (se symptomer beskrevet ovenfor), skal det først undersøges under et optisk mikroskop. Hvis opbevaret i en gel boks, kan cantilever afhente spor af gel polymerer eller silikoneolie 59, der kan visesI ekstreme tilfælde, som mørkere pletter, på bagsiden af cantilever (som i figur 5A). Fototermisk svingning af udliggeren kan inducere tilsvarende pletter, men de er på grund af nedbrydning / overophedning af cantilever coating ved den drivende laser. Kontaminering tendens til vises tilfældigt på udliggeren. En længere (12 timer) rensning med isopropanol og derpå med ultrarent vand kan fjerne uønskede partikler fra udliggeren.
Figur 5: Sammenligning mellem en ny cantilever og en identisk en, der har været omfattende anvendt på hårde overflader og efterladt i en gel kasse i en længere periode. A: Top; optisk billede af splinternye cantilever, der er blevet renset (se procedure). Bund; optisk billede viser forekomsten af synlige forurening (blå pil) fra gel kassen. B: Sammenligning af cantilevere respektive termisk spektre.Udvidelse af den gamle cantilever første resonans top er klar (grøn pil) og nogle højere orden modes er forbedret (blå pil). Spectra er lodret forskudt og præsenteres på en log-log skala for klarhed. Klik her for at se en større version af dette tal.
Hvis den nødvendige sub-nanometer opløsning ikke er opnået til trods for acceptable billeder ved lavere opløsning, er det muligt, at AFM spids er blevet kemisk modificeret under oplagring miljø. Dette kan behandles ved udsættelse af cantilever chip til en ultraviolet oxidationsmiddel i 120 sek, som hjælper oprettelsen af hydrofile overfladegrupper på spidsen 60. Der skal sørges imidlertid, som det præcise tidspunkt nødvendigt kan variere efter spids geometri og UV magt, og over-eksponering kan resultere i afstumpningsorganet af spidsen og reduceret opløsning.
Termisk støj </ P>
Høj opløsning billeddannelse kræver stor følsomhed over for variationer i kraft og afstande (typisk sub-PN kræfter og sub-Ångström afstande 78). Til blødere cantilevere kan termo-mekanisk bevægelse af udliggeren på grund af sin iboende Brownsk bevægelse (termisk vibration) være et problem. I første tilnærmelse, med en udligger stivhed k, er det ikke muligt at måle indeholder mindre end , Amplituden af den termiske støj, hvor k B er Boltzmann konstant, og T er temperaturen. Praktisk anvendelse cantilever med højere resonansfrekvenser spreder støj over et større frekvensområde, og reducerer den samlede støjniveau i målebåndbredde 79.
Højere eigenmode imaging
Det kan undertiden være nyttigt at betjene udliggeren ved sin anden eigenmodepå grund af stigningen effektiv stivhed (se diskussion af kontaminering). I praksis gøres dette ved simpelthen at køre udliggeren ved sin anden eigenmode (den anden resonansspids ved højere frekvens, se figur 1A). Når tuning cantilever, skal du blot vælge den anden eigenmode stedet for den vigtigste resonans og fortsæt til trin 5.4. Bemærk at InvOLS vil være anderledes, når cantilever drives ved den anden eigenmode; typisk ~ 1/3 af de InvOLS målt i trin 5.2 for en rektangulær cantilever.
Den væsentligste begrænsning af teknikken er, at den kræver en stabil solvatisering landskab ved overfladen af prøven. Prøven skal være robust nok til at tillade forstyrrende grænseflade-væske uden at fremkalde signifikant deformation af selve prøven. Dette kan være en udfordring på meget bløde og ustabile prøver så store biomolekyler. Derudover lille amplitude AFM som beskrevet her, kan ikke opnå mekanisk information om properties af en prøve, som cantilever spids tilbringer størstedelen af sin tid i grænsefladeteknik væske. Til dette, kan det være en fordel at bruge andre metoder såsom Kvantitativ nanomekaniske Mapping 80 eller gøre brug af højere harmoniske af cantilever bevægelse. Højere mundharmonikaer er generelt forbedret, når billeddannelse i væske (med lav kvalitet-faktorer) 29,81 – 83 og kan give samtidig topografi og stivhed af prøver 25,81 – 84, men de er generelt skadelige for høj opløsning. Andre begrænsninger, der ligger på alle scanning probe mikroskopi teknikker er stadig gældende her, navnlig den omstændighed, at resultaterne uundgåeligt indeholde oplysninger om måling spids. Anvendelsen af små amplituder er heller ikke ideel for prøver med store højdevariationer; tilbagekoblingssløjfen vil uundgåeligt reagere langsommere, når højden variationer er større end den billeddannende amplitude, således risikere prøve og tip skader. Anvendelsen of blødere cantilever afbøder dette problem til en vis grad.
Den største fordel ved fremgangsmåden præsenteres her, er, at det giver den højeste billedopløsning mulig med AFM i væske, men kan implementeres på en hvilken som helst kommerciel AFM, forudsat at støjniveauet i maskinen er lave nok. Sammenlignelige beslutning om kommercielle instrumenter opnås normalt i kontakt mode, eller lejlighedsvis i FM-AFM med stive støtteben. Arbejde i AM-mode og med relativt bløde støtteben giver mulighed for et bredere udvalg af prøver, og er lettere at gennemføre end FM-AFM på de fleste systemer. Tilgangen bygger på at udnytte Solvatiseringen kræfter eksisterer på grænsefladen mellem en fast og flydende at forbedre opløsning og få lokale kemiske oplysninger. Det kan i princippet anvendes i omgivende forhold, bygger kun på vandlag (typisk flere nanometer tyk) bygger op på de fleste overflader på grund af luftens fugtighed. De principper ligger til grund forhøj opløsning strategi forbliver uændret, men de fleste af spidsen er i luften, med kun et kapillært bro mellem spidsen spids og prøven 85. Høj opløsning er påvist på stive prøver i disse betingelser 86,87. Billeddannelsesproduktet betingelser er imidlertid anderledes end nedsænket væske på grund af en højere Q-faktor af udliggerens svingning. Praktisk, fandt vi det vanskeligt at opnå stabil drift over bløde eller uregelmæssige prøver, formodentlig på grund af tidsmæssige ændringer af den kapillære broen og øget Q-faktorer for en given cantilever stivhed.
Den her beskrevne protokol tilbyder en metode til at opnå billeder af prøver molekylær niveau opløsning i væske med de fleste moderne kommercielle AM-AFMs. Vi leverer det videnskabelige rationale bag vores valg af imaging parametre og understrege betydningen af solvatisering kræfter. Vi diskuterer også fælles problemer og især forurening. De specifikke tip-sample interaktioner CAn varierer dramatisk afhængigt af indholdet af den billeddannende opløsning, cantilever geometri og materiale, og prøven kemi. En praktisk forståelse af karakteren af de dominerende kræfter til stede under scanningen er derfor vigtigt at tilpasse denne protokol til nye systemer og sikrer pålidelige resultater. Når optimeret, den eksperimentelle tilgang er stærk til at vinde i situ lokale molekylære niveau indsigter af prøver i opløsning.
The authors have nothing to disclose.
Finansiering fra Teknik og Physical Sciences Research Council (tilskud 1.452.230 og EP / M023915 / 1) Bioteknologi og biologiske videnskab Forskningsråd (give BB / M024830 / 1) og Det Europæiske Råd (FP7 CIG 631.186) er taknemmeligt anerkendt.
Multimode IIIA AFM | Brucker | NA | One of the machine used |
Cypher ES AFM | Asylum Resarch | NA | One of the machine used |
AFM cantilever/tip | Nanoworld | Arrow UHF-AUD | best for high frequency |
AFM cantilever/tip | Olympus | RC800-PSA | versatile and cheap |
ultrapure water | Milipore | NA | lab filtering systems can induce contamination |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aaldrich | 200-664-3 | standard chemical, no further purification |
Monovalent salts | Sigma-Aaldrich | standard chemical, no further purification | |
Lipids | Avanti polar lipids | lipid bilayers formed using stadard protocols | |
Crystals | MTI | polished crystals | |
Scotch tape | 3M | Scotch Magic Tape | Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly |