Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Engineering
Click here for the English version

Engineering

نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل

Published: December 20, 2016 doi: 10.3791/54924
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1
1Physics Department, Durham University
* These authors contributed equally

Summary

ونحن نقدم وسيلة لتحقيق صور قرار اللجنة الفرعية نانومتر مع اتساع التشكيل (التنصت واسطة) مجهر القوة الذرية في السائل. ويتجلى هذا الأسلوب على مجهر القوة الذرية التجارية. نحن شرح الأساس المنطقي وراء خياراتنا من المعلمات واقتراح استراتيجيات لقرار الأمثل.

Introduction

منذ اختراع لها، قبل ثلاثة عقود، القوة الذرية المجهر (AFM) 1 وضعت نفسها كأسلوب لاختيار للتحقيق في عينات على مقياس النانو، وخصوصا حيث بلغ متوسط فوق مناطق سطح العيانية هو غير ممكن ومطلوب المعلومات المحلية. في قياس AFM نموذجي، يتم استخدام انحراف ناتئ مرونة لقياس قوة التفاعل بين عدد قليل من الجزيئات وتلميح ULTRASHARP شنت في نهاية ناتئ. اعتمادا على نوع من التفاعلات والجداول الزمنية في الاعتبار، مجموعة واسعة من المعلومات يمكن أن تستمد، بما في ذلك الخصائص اللزجة من الأغشية البيولوجية الناعمة 2،3، وقوة من مادة كيميائية واحدة أو السندات الجزيئية 4،5، وتفاصيل ذري ل سطح 6-8، المغناطيسي 9، بالسعة 10، وإجراء 11، الحرارية والكيميائية 12،13 14 منشأة من عينات 16 و في بيئات متعددة مثل فراغ 17، الغاز 11،18 أو السائل 19،20، لأنها لا تعتمد على قوة محددة بين التحقيق وعينة .

في الممارسة العملية، ومع ذلك، تشغيل AFM في ظروف أخرى من المحيط يمكن أن يكون تحديا والعديد من النتائج المنشورة لا يزال الحصول في الهواء. وثمة صعوبة وأضاف يأتي من حقيقة أنه من الضروري في العادة لتشغيل فؤاد في وضع ديناميكي (تهتز طرف) من أجل الحفاظ على كل من طرف وعينة عن طريق تجنب الاحتكاك قوات كبيرة. على الرغم من أن أكثر تحديا، يمكن أن عملية ديناميكية من حيث المبدأ تقديم مزيد من المعلومات حول العينات التى تم تحليلها، ومع عدم فقدان القرار المكانية. على مدى العقد الماضي، شهد مجال AFM الديناميكي في السائل التطورات الهامة، من ظهور فؤاد معدل الفيديو 21-23، لقياسات متعددة التردد 26 - 31. يستخدم الآن عملية AFM بينما مغمورة في السائل بشكل روتيني في علم الأحياء والفيزياء الحيوية 32 - 36، والبحوث البوليمر 37، الكيمياء الكهربائية 38-40 والصلبة والسائلة واجهات توصيف 41-44. وجود سائل حول ناتئ تهتز يغير كثيرا دينامياتها 45 فضلا عن التفاعل بين طرف وعينة 29،42. عند استخدامها بشكل مناسب، وسائل يمكن استغلالها لتعزيز قرار التصوير 26،29، مع تحسن نموذجي أمر تقريبا من حيث الحجم مقارنة مع أفضل قرار الذي تحقق في الظروف المحيطة 46.

في AFM، يعتمد على أعلى دقة المكاني للتحقيق لقياس خاص على كل من جودة AFM نفسها وطبيعة ركان التفاعل سبر 20،47،48. في الوقت الحاضر، فإن معظم الراقية، AFMs المتاحة تجاريا الحالية مستويات الضوضاء التي هي قريبة إلى أن من الحد الحراري 12 حتى العامل الحاسم لقرار عادة ما يكون التفاعل طرف عينة. وهو بفاعلية التدرج المكاني لهذا التفاعل هو الذي يحدد القرار: القياسات القائمة على المدى القصير، وتدهور بسرعة التفاعل تسفر عن نتائج دقة أعلى مما كانت عليه عندما التفاعلات المدى الطويل هي في اللعب. في السائل، يمكن أن قوات اذابة تحسين دقة التصوير لأنها تميل إلى تختفي خلال سوى عدد قليل من أقطار الجزيئية للسائل (عادة <1 نانومتر) عندما تتحرك بعيدا عن سطح العينة 49. هذه القوى تنبع من التفاعل بين جزيئات السائل وسطح العينة. وهناك السائل مع تقارب قوي لسطح تميل إلى أن تكون أكثر أمر، وأقل قدرة على الحركة من الصب السائل في واجهة مع عينة 29،42،50. كنتيجة لــ،ان الامر سيستغرق المزيد من الطاقة لتهتز غيض فؤاد لتهجير جزيئات السائل بينية من معظم السائل 42، مما يجعل قياس حساسة للغاية للتغيرات المحلية في خصائص السائل بينية على مقياس النانو -The اذابة المناظر الطبيعية.

من أجل استغلال قوات اذابة، يجب أن تؤخذ بعين الاعتبار العديد من الجوانب العملية. أولا، واتساع التذبذب من طرف يجب أن تكون قابلة للمقارنة لمجموعة من القوات اذابة، وعادة <1 نانومتر. وثانيا، فإن السائل المستخدم يجب أن تشكل المناظر الطبيعية اذابة واضحة المعالم على سطح العينة. ظاهريا، وهذا هو ما يعادل تتطلب "التبول" السائل لعينة النظر فيها. على سبيل المثال، في المياه فمن الأسهل لتحقيق الدقة المستوى الجزيئي على الميكا ماء من على 42،51 الجرافيت مسعور. وأخيرا، يجب تحديد ثابت الربيع من ناتئ دعم طرف على نحو ملائم 52،53. عند العمل في هذه يخدعditions، وAFM لا توفر سوى صور عالية المستوى الجزيئي واجهة، ولكن هذا يرجع أيضا معلومات حول تشابه عينة السائل المحلي والتي يمكن استخدامها للحصول على المعلومات الكيميائية عن سطح العينة 54.

وسائط ديناميكية الأكثر شيوعا من عملية لفؤاد في السائل هي السعة التشكيل (AM، أيضا "وضع التنصت ') AFM والتردد التحوير (FM) فؤاد. في الحالة الأولى 55، وغيض النقطية بفحص العينة في حين يتم الاحتفاظ سعة الاهتزاز ثابت من حلقة التغذية المرتدة التي باستمرار إعادة ضبط المسافة طرف عينة. يتم الحصول على صورة طبوغرافية لعينة من التصحيح التي تطبقها حلقة مفرغة. في FM-AFM 28،41،56، هو تردد التذبذب للناتئ / غيض أن يتم الاحتفاظ ثابت بينما الطرف بفحص عينة. وتقدم كل من التقنيات قرار الطبوغرافية مماثل في السائل 36،57. الكمي للتفاعل طرف عينة يميل إلى أن يكون أكثر الاجهادghtforward ودقيقة في FM-AFM، ولكن AM-AFM هو أسهل لتنفيذ، أكثر قوة، ويسمح العمل مع الكابولي ليونة، وهو مفيد لدراسة عينات بسهولة تشوه أو الحساسة. إلى حد كبير، AM-AFM هو أكثر انتشارا بين المستخدمين AFM، جزئيا لأسباب تاريخية ولكن أيضا يرجع ذلك إلى حقيقة أنه من الأسهل من الناحية الفنية السيطرة عليها.

على الرغم من أن يتم الحفاظ على اتساع ثابت من رد الفعل أثناء التصوير AM-AFM، ولا يسمح للالفاصلة بين مرحلة التذبذب طرف والتذبذب يقود إلى تغيير بحرية. والفاصلة المرحلة يمكن أن توفر معلومات مفيدة عن التفاعلات طرف عينة، التي تتعلق الطاقة تبدد خلال التذبذب من طرف على التفاعل مع العينة 58. ومن ثم مرحلة التصوير يمكن الحصول عليها في الوقت نفسه إلى التصوير الطوبوغرافي، وغالبا ما يكون مكملا في تسليط الضوء على عدم التجانس من سطح العينة. وقد استخدم التصوير مرحلة لرسم الخرائط مختلف التفاعلات، بما في ذلك ديرسم الخرائط مصحح للطاقة التصاق 42، والخصائص اللزجة 58 والمناظر الطبيعية ترطيب واجهة 44.

عمليا، والحصول على صور عالية الدقة في السائل لا يزال غير تافهة بسبب وجود عدد كبير من المعلمات للسيطرة، وعدم وجود بسيط بروتوكول، المنظم التي تعمل في كل حالة. جودة الصورة تعتمد عادة على هندسة ناتئ ومرونة، والكيمياء طرف، واتساع التذبذب، وصلابة عينة، من بين أمور أخرى 55. قياسات AFM هي أيضا، بحكم التعريف، اضطرابي إلى النظام. ونتيجة لذلك، وتغيير المتغيرات التصوير والظروف البيئية دون اعتبارات الملائمة يمكن أن يؤدي إلى صعوبات في استنساخ و / أو ملاحظات تدليسا ونتائج زائفة.

هنا، نقدم بروتوكول لدينا لتحقيق صور عالية الدقة من العينات المادية وغير المادية في حل، وذلك باستخدام أدوات تجارية تعمل في amplitude التشكيل. هدفنا هو أن نقدم لإجراء عملية لتحقيق الاستفادة المثلى من المعالم الرئيسية التي يحتمل أن تؤثر في قرار على عينات مختلفة، موضحا في كل حالة الأساس المنطقي لخياراتنا من المبادئ الفيزيائية الكامنة وراء عملية التصوير. نحن التفاصيل نهجا خطوة بخطوة، من تنظيف الركيزة والإعداد، لاختيار ناتئ، وتعديل المعلمات التصوير واستكشاف المشاكل المشتركة. يجب شرح المنطق العلمي وراء الخيارات وإجراءاتنا عالية الدقة تساعد على اتخاذ خيارات عقلانية عندما تكييف منهجية، وتكون بمثابة نقطة انطلاق لأنظمة رواية التصوير.

طوال هذا النص نستخدم صباحا إلى الرجوع إلى وضعية التشغيل السعة التشكيل من فؤاد. نشير إلى المعلمة ردود الفعل ظلت ثابتة خلال إما انحراف ناتئ (وضع الاتصال) أو سعة التذبذب (الوضع AM) كقيمة المضبوطة مسبقا. في وضع صباحا، هو الدافع وراء ناتئ خارجياإما عن طريق التذبذب الصوتية أو الليزر نابض تركز في قاعدة ناتئ. سعة القرص هي شدة إشارة متذبذبة الخارجية. القيمة المطلقة من السعة الحيوية اللازمة لتحقيق سعة التذبذب نظرا للناتئ تعتمد على الكثير من العوامل مثل طريقة القيادة (الصوتية، ضوئي؛ ضوحراري أو مغناطيسيا)، تثبيت ناتئ والمعلمات (صلابة، والهندسة) ومحاذاة الليزر. وبالتالي فإن القيمة الدقيقة للمحرك سعة ليست ذات صلة ولكن يتم تعديل ذلك في كل تجربة وذلك لتوفير سعة التذبذب المناسبة (وقابلة للقياس الكمي) للتعزية. عندما ناتئ مدفوعة بعيدا من العينة ولا التخميد من الاهتزاز يحدث من خلال التفاعل طرف عينة، ويسمى السعة التذبذب في التذبذب السعة المجانية. مع اقتراب رأس تهتز سطح العينة، تبدأ سعتها إلى الانخفاض. إذا تم تمكين ردود الفعل، وسوف بيزو ض CONSTantly إعادة ضبط امتداده بحيث عارضة السعة المضبوطة مسبقا محددة، ثابتة. القيمة المضبوطة مسبقا هي عادة دائما أصغر من السعة المجانية. ومن الشائع للإشارة إلى نسبة المضبوطة مسبقا، فإن نسبة السعة المضبوطة مسبقا (التصوير السعة) على مدى اتساع الحرة. أصغر نسبة المضبوطة مسبقا، أقسى الظروف التصوير هي.

Protocol

1. تنظيف الأدوات والأسطح الأخرى

ملاحظة: عندما تهدف لارتفاع القرار، أي شكل من أشكال التلوث يمكن أن يكون لها عواقب ضارة. ولذلك فمن الضروري لضمان أن جميع الأدوات المستخدمة في التعامل مع العينة، يتم تنظيف الركيزة أو AFM نصائح بدقة. ينطبق ما يلي على أي سطح أو أداة (على سبيل المثال، ملاقط) التي قد تأتي في اتصال مع العينة، ناتئ، أو خلية AFM، بما في ذلك مرحلة العينة نفسها.

  1. حمام-يصوتن الصكوك في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ، <5 العضوية جزء في المليون)، تليها الأيسوبروبانول (99.7٪ النقاء)، يليه الماء مرة أخرى عالى النقاء، كل لمدة 10 دقيقة. عندما يكون ذلك ممكنا، استخدم الأيسوبروبانول تحت غطاء الدخان للحد من استنشاق الدخان.
  2. الجافة تحت تدفق النيتروجين.
  3. إذا الغمر الكامل غير ممكن (على سبيل المثال، للحامل ناتئ / إلكترونيات)، جسديا تنظيف السطح من قبل القضاء مع واحد رقائق والأنسجة من الوبر منخفضة (الأنسجة الخفيف واجب مساحات) غارقة في ultrapuإعادة المياه، الأيسوبروبانول والماء عالى النقاء، بالتتابع. اترك السطح ليجف في الهواء (عادة في غضون 15 إلى 30 دقيقة).

2. إعداد الركيزة

ملاحظة: الركيزة تعين على سطح صلب يدعم مباشرة العينات، وعادة في اتصال جسدي مع كل من الماسح الضوئي AFM والعينة. معظم AFMs لديها جبل المغناطيسي والأقراص الصلب يمكن استخدامها، ولكن في نفس البروتوكول هو أيضا مناسبة لركائز مثل الشرائح الزجاجية. نحن هنا نفترض قرص الصلب الذي تم اضافته قرص الميكا. والهدف من هذا الإجراء هو الحد بقدر مصادر خارجية المحتملة للتلوث التي يمكن أن تؤثر على التصوير. قفازات يجب أن ترتديه في جميع الأوقات.

  1. حمام-يصوتن القرص الصلب العينة في الماء عالى النقاء (18.2 MΩ)، تليها الأيسوبروبانول، وأخيرا من الماء عالى النقاء مرة أخرى، كل لمدة 10 دقيقة.
  2. تجفيف أقراص تحت تدفق النيتروجين.
  3. إعداد كمية صغيرة من الغراء الايبوكسي مع الكواشف يخلط جيدا ومكان ~ 1081؛ ل على القرص الصلب.
  4. يلصق الركيزة (الميكا بلدية موسكو، شافي 2 الكريستال والزجاج وغيرها) إلى القرص الصلب عن طريق الضغط على الركيزة. السماح للالايبوكسي لعلاج لعدة ساعات في درجة حرارة مرتفعة (انظر مواصفات الشركة الصانعة).
  5. تأكد من أن لا الايبوكسي يتعرض مباشرة للهواء، حول حواف الركيزة. سيحدث هذا إذا تم استخدام كمية زائدة من الايبوكسي وقد تصبح مصدرا للتلوث.
    1. لالركيزة الميكا، اضغط بقوة ~ شريط لاصق 2.5 سم واسعة على الركيزة، بحيث يتم تغطية كامل الوجه، وقشر بسلاسة تشغيله. استخدام شريط لاصق أقل ما يقال، وقشر الميكا عن طريق سحب موازية لسطح. المواد التي تم إزالتها مرئيا على الشريط. كرر هذه العملية 2-3 مرات، حتى الميكا هو مرآة السلس للعين.
    2. للزجاج / شافي 2، إذا كنت بحاجة إلى مزيد من التعديل سطح الكيميائية، تكرار الروتين حمام-صوتنة من الخطوات 2.1-2.2. بدلا من ذلك، استخدم Uوحدة التعرض الخامس (18 W مصابيح الأشعة فوق البنفسجية مبيد للجراثيم C) لمدة 30-60 دقيقة، اعتمادا على الطاقة) لpyrolyze أي المواد العضوية التي قد تكون تركت على السطح. يجعل هذا الإجراء أيضا على سطح أكثر محبة للماء دون زيادة كبيرة خشونة.

3. إعداد الكابولي ونصيحة

  1. تزج رقاقة ناتئ في حمام من الأيزوبروبانول، يليه الماء عالى النقاء، كل لمدة 60 دقيقة.
  2. إذا كان ناتئ / غيض يتطلب تنظيف واسعة (على سبيل المثال، بعد التخزين لفترات طويلة في مربع هلام)، إضافة تمرغ 30 دقيقة في الأسيتون (> 99.5٪ النقاء) قبل الخطوة 1 (انظر أيضا تلوث قسم معالجة). تخزين نصائح في صناديق هلام، في تجربتنا، واحدة من المصدر الرئيسي للتلوث التي يمكن أن تحدث بسرعة جدا 59.
  3. كشف معلومات سرية للأشعة فوق البنفسجية لفترة وجيزة ضوء (<5 دقائق) وذلك لصالح تشكيل مواقع ترطيب مستقرة 60. تجنب التعرض المفرط مرات أطول لأنها يمكن أن تلحق الضرر طرف أو المؤتمر الوطني العراقيrease دائرة نصف قطرها من انحناء.
  4. إدراج تعزية إلى صاحب ناتئ في AFM وماصة ~ 50 ميكرولتر من محلول التصوير (طبيعة الحل سيعتمد على عينة قيد التحقيق، ولكن في هذه الحالة استخدام حل 10 ملم من كلوريد الروبيديوم في الماء عالى النقاء) على ناتئ و تلميح إلى ما قبل الرطب هو؛ هذا سوف تحد من ظهور فقاعات الهواء عند الاقتراب من العينة.

4. مجموعة المتابعة من AFM خلية

  1. جبل القرص العينة والركيزة على خشبة المسرح عينة وإضافة قطرات من سائل التصوير (السائل عادة 2-3 مم في أعلى نقطة لها).
  2. توصيل حامل ناتئ إلى AFM.
  3. جلب ناتئ وعينة الى مقربة بحيث تشكل جسرا الشعرية بين السوائل على ناتئ / طرف والعينة.

5. تهيئة القياس والمعايرة من الكابولي

  1. محاذاة الليزر قياس (عادة ما تكون حمراء) على مقربة من طرف الإلكترونيةالثانية للتعزية. اعتمادا على نموذج فؤاد، أن تفعل ذلك إما عن طريق ضوابط البرنامج أو عن طريق الضبط اليدوي للموقف الليزر. الحصول على الطيف ناتئ الطاقة الحرارية في السائل (انظر الشكل 1A). وتسجل عملية التقلبات الحرارية للناتئ باستخدام الليزر، من أجل العثور على تردد الرنين الرئيسي للتعزية في (eigenmode الأساسي). في معظم AFM الحديثة، ويتم ذلك من خلال الإجراءات الآلية في ضوابط البرنامج، ولكن قد تختلف التفاصيل من AFM إلى AFM.

شكل 1
الشكل 1: ضبط ومعايرة ناتئ. ج: الطيف الضوضاء الحرارية للانحراف العمودي ناتئ في (الأسود) مع مذبذب التوافقي (SHO) تناسب بسيط من eigenmode الأساسية (الأحمر). هنا صدى هو 18.7 كيلو هرتز في الماء. أول ثلاثة ترددات الرنين التي تتوافق مع أول ثلاثة eigenmodes العاطفة هي مضيئةghted مع الأسهم الزرقاء. باء: معايرة معكوس الضوئية ليفر حساسية ناتئ في. يتم استخدام انحراف خطية من ناتئ الضغط على سطح صلب (غير تشوه) لقياس عامل التحويل (InvOLS) بين انحراف يقاس فولت والقيمة المقابلة في نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

  1. تسجيل انحراف مقابل منحنى المسافة مع ناتئ على ركيزة صلبة (على سبيل المثال، والميكا أو الزجاج) ومعايرة انحراف عن طريق فرض أن انحدار منحنى في المنطقة انحراف الخطية (كما في الشكل 1B) هو الوحدة 61-63.
    ملاحظة: وجدت هذه العملية عامل التحويل بين انحراف يقاس على مكشاف ضوئي (فولت) وانحراف الحقيقي للتعزية (في نانومتر) - كنوسفل كما معكوس الضوئية ليفر الحساسية (InvOLS). معايرة قد يؤدي إلى تلف طرف، ولذلك فمن الأفضل لإجراء ذلك بعد أن يتم الانتهاء من جميع القياسات. استخدام قيمة InvOLS المشتق من ناتئ آخر من نفس النوع خلال تجربة سابقة للحصول على تقدير (عادة> 90٪ دقيقة) من السعة الحقيقية قبل المعايرة.
  2. تناسب ذروة صدى في الطيف الحراري مع بسيطة نموذجا مذبذب التوافقي 64-66 لانتاج ثابت ربيع ناتئ. مؤتمتة هذا الإجراء في معظم برامج AFM و لا يتطلب عادة المعرفة المتخصصة للنموذج المذكور.
  3. ضبط ناتئ. العثور على استجابة اتساع ناتئ عندما مدفوعة من الخارج (على سبيل المثال، سمعيا أو الإثارة ضوئي؛ ضوحراري) عبر مجموعة من الترددات على مقربة من ترددها صدى الاسمي. ضبط تردد القيادة إلى قرب الحد الأقصى في هذا الطيف، قليلا إلى اليسار. إذا كان ناتئ هو acouقد تظهر مدفوعة stically، العديد من ماكسيما زائفة عندما ضبط.
    1. حدد ذروة صدى أقرب وقت ممكن ل(وضمن مغلف) صدى المحددة في الطيف الحراري باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة من AFM لكن تفاصيل قد تعتمد على نوع البرنامج والنسخة التي تسيطر على فؤاد.

6. نهج والفحص الأولي لعينة

  1. تعيين السعة القيادة بحيث التذبذب السعة الحرة هي حوالي 5 نانومتر. وهذا يتوافق عادة إلى 0،2-0،8 الخامس على معظم AFMs (في حالة عدم معايرة InvOLS). ضبط المضبوطة مسبقا السعة إلى ~ 80٪ من السعة المجانية.
  2. تعيين مكاسب ردود الفعل عالية نسبيا (القيمة المطلقة يعتمد على AFM) ولكن تأكد من عدم الاستقرار أو الرنين يحدث.
  3. تعيين معدل المسح الأولي وحجم المسح الضوئي إلى قيم صغيرة (على سبيل المثال، إلى ~ 1 هرتز و 10 نانومتر على التوالي). هذا يساعد على الحفاظ على معلومات سرية في حال تم تعديل بعض المعلمات ردود الفعل سيئةعن طريق تجنب المسح الضوئي لمسافات كبيرة. ويمكن زيادة حجم المسح في وقت لاحق إلى قيمة أكبر (على سبيل المثال، 100 نانومتر) في حالة ظهور شروط المسح مناسبة.
  4. تحديد ارتفاع التقريبي للسطح (في بعض الحالات يجب أن يتم ذلك بصريا) قبل هذا النهج.
  5. بدء نهج طرف على سطح باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة فؤاد. والتفاصيل الدقيقة لهذه العملية تعتمد على نموذج من AFM والبرامج المستخدمة.
    1. إذا كان هناك مشاكل مع النهج عند استخدام تعزية لينة، وإجراء النهج في وضع الاتصال. في هذه الحالة، تأكد من أن المكاسب هي أقل مما كانت عليه في وضع صباحا، وتعيين المضبوطة مسبقا إلى قيمة منخفضة نسبيا (0.1-0.2 الخامس بعد تركز الليزر على مكشاف ضوئي) للحفاظ على معلومات سرية.
    2. تقييم ما إذا كانت معلومات سرية قد وصلت إلى السطح دون بدأت صورة عن طريق تغيير طفيف في القيمة المضبوطة مسبقا (الزيادة في وضع الاتصال أو نقصان في وضع AM). إذا غيض على السطح، وأثر على رانه امتداد للZ-بيزو يجب أن تكون لا تذكر. عادة يتم عرض الاقتراحات حية للZ-بيزو بيانيا في برنامج السيطرة على معظم فؤاد. إذا كان التغيير المضبوطة مسبقا يتسبب في حركة واضحة للبيزو، وهذا يدل على كاذبة الانخراط. في الحالة الأخيرة، وإعادة بدء النهج من موقع طرف الحالي، وذلك باستخدام أعلى قليلا (الاتصال) أو أقل (ص) المضبوطة مسبقا.
  6. مرة واحدة غيض قد وصل إلى السطح، والتراجع عن Z-بيزو (عادة ببساطة عن طريق الضغط على 'وقف') و Retune ناتئ (كرر الخطوة 5.4)؛ ومن المرجح أن تحولت تردد الرنين إلى قيمة أقل بسبب التفاعلات طرف عينة.
  7. تغيير نقطة مجموعة إلى ~ 80٪ من السعة المجانية ضبطها حديثا (في هذه المسافة طرف عينة).
  8. إشراك ناتئ وإجراء 10 × 10 نانومتر 2 فحص السطح في وضع AM للتحقق من أن المعلمات التصوير هي مناسبة.
    1. تأكد من أن تتبع (المسح من اليسار إلى اليمين) وتقفي (يمين المسح إلى اليسار)لمحات ركب. إن لم يكن زيادة خفض المضبوطة مسبقا ومحاولة زيادة الربح.
    2. خفض الأرباح إذا أصبحت صورة صاخبة.
  9. كرر هذه العملية مع كبير - 1 × 1 ميكرون 2-5 × 5 ميكرون 2 - فحص العينة توفير هذا ممكن. على عينات لينة أو البيولوجية، وهذا قد يؤدي إلى تلوث طرف.

7. عالية الدقة التصوير

  1. تقليل حجم المسح الضوئي إلى قيمة مناسبة لتصور ملامح (على سبيل المثال، 100 × 100 نانومتر 2 للبلورات البروتين أو 20 × 20 نانومتر 2 لالميكا أو الكالسيت).
  2. الحد من سعة محرك ناتئ يكفي لحلقة التغذية المرتدة لسحب تلقائيا Z-بيزو، وبالتالي غيض من على سطح الأرض. في حين أن ناتئ بعيدا عن السطح، وضبط سعة محرك الأقراص بحيث أن السعة ناتئ هي ~ 1-2 نانومتر (الذروة إلى الذروة).
  3. باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة AFM، PROGRESsively تقليل المضبوطة مسبقا بضع عشرات من بالسيارات في وقت واحد حتى يمتد Z-بيزو مرة أخرى نحو السطح ويتم استرداد الصورة الأصلية. الحفاظ على السعة المضبوطة مسبقا بين 75٪ و 95٪ من السعة المجانية الجديدة.
  4. إعادة ضبط المكاسب باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة AFM. أعلى المكاسب يمكن استخدامها في سعة الدنيا دون إدخال ضجيج كبير.
    1. كرر 7،2-7،4 الخطوات وذلك لتحديد أفضل مزيج من حر السعة، المضبوطة مسبقا واكتساب عالية الدقة. تعتمد على الظروف المثلى على عينة (أفقي اذابة وخصائص ترطيب السائل)، ولكن أيضا ناتئ (ربيع دائم، وتصلب).
    2. استكشاف مجموعات مختلفة من سعة لتحسين ظروف التصوير. قد يكون من الضروري زيادة مرة أخرى السعة المجانية 42. في مثل هذه الحالة، وضبط لأول مرة المضبوطة مسبقا إلى قيمة أعلى ثم زيادة محرك الأقراص (أي إجراء عكسي من استخدامها لتقليل السعة).
    3. الحفاظ على setpoiالإقليم الشمالي السعة في حدود 0.5 نانومتر - 1.5 نانومتر (الذروة إلى الذروة) مع النسب المضبوطة مسبقا أبقت فوق 0.7 (عادة 0،75-0،95). واجهات solvophilic، استخدم الكابولي مع ثابت ربيع 0،5-2 نيوتن / متر. وهذا يكفي للتلميح إلى إزالة معظم السائل بينية دون ضرب السطح. يقترح وبحكم التجربة في مكافئ. 4 من إشارة 29.

Representative Results

تم تطبيق البروتوكول هو موضح في المقطع السابق بنجاح مع عدة AFMs التجارية لتحقيق صور الجزيئي أو المستوى الذري. تم الحصول على جميع الصور مع سعة العمل بين 0.5 نانومتر و 1.5 نانومتر تعديلها بشكل فردي بعد إجراء الخطوات 7،1-7،4. يمكن الحصول على نتائج أكثر من مجموعة واسعة من لينة (الشكل 2) وقاسية (الشكل 3) عينات. في كل حالة، ويسلط الضوء على الميزات المثيرة للاهتمام. واحدة من مزايا كبيرة من هذه التقنية هو أن سعة التذبذب الصغيرة وعالية مجموعة نقاط التقليل من قوة من جانب طرف على عينة المبذولة، مما يسمح للجمعيات الذات الهشة من الدهون (الشكل 2A) والبروتينات (الشكل 2B و D)، و جزيئات محبة للجهتين (الشكل 2C) ليتم تصويرها دون ضرر في الحل. أصعب المواد البلورية مثل المعادن (أرقام 3A، B، D) وايونات المعادن واحدة كثف على سطح (الشكل 3C) يمكن تصوير باستخدام النهج لأنه في كل حال، من السائل البيني التي يتم تصويرها على نحو فعال مع بروتوكول صفها. قوات اذابة قابلة للمقارنة على عينة أظهرت أرقام 2 و 3: جميع العينات المائية (بشكل عام، "solvophilic" في حالة أرقام 2C، 3B، 3D) فيما يتعلق بحل التصوير. باستمرار، الكابولي مع صلابة مقارنة - استخدمت (0.2 0.8 نيوتن / متر) في جميع الحالات. يجب أن يكون كل من العينة وغيض solvophilic للتأكد من أن جزيئات السائل تشكيل بنية اذابة واضحة المعالم التي يمكن تصويرها. هذه ليست دائما شرطا كافيا، ولكن في معظم الحالات، ولجزيئات السائل صغيرة نسبيا، إلا أن السائل إعادة هياكل نفسها بطريقة تحاكي التماثل العينة. المحرك الرئيسي للارتفاع القرار هو الاختلاف المحلي في تقارب من جزيئات المذيب كثفللأسطح (آنغستروم على نطاق و، في حالة أرقام 2A، 3A، 3C). ولذلك الأنسب للتقنية إلى المواد التي يختلف هيكل المذيبات إلى حد كبير عبر السطح.

الشكل 2
الشكل 2: واجهات لينة المصورة التي كتبها AM-AFM في المحاليل المائية. ج: Dipalmitoyl-فسفاتيديل (DPPC) طبقة ثنائية المادة الدهنية في المرحلة هلام تصويرها في في 150 ملي بوكل. وheadgroups الدهون معبأة سداسي يمكن تمييزها في كل التضاريس والمرحلة، جنبا إلى جنب مع تباين المحلي مشيرا إلى الاختلافات في مواقع محددة في الماء. باء: الأغشية بيربل من ملحاء عصوية ملحية تصويرها في 150 ملي بوكل، 10 ملي تريس، ودرجة الحموضة 7.4. ويسلط الضوء على عدة trimers بروتين رودوبسين جرثومي. المرحلة المعارض على النقيض مختلفة من التضاريس بسبب مواقع ترطيب المحلية على البروتينات. trimers البروتين الفردية يمكن أن تكون مصنوعة من (الخطوط المتقطعة). C: صبغ محبة للجهتين (Z907) جزيئات كثف على السطح من جسيمات متناهية الصغر تيو 2 في خلية شمسية صبغية. وقد اكتسبت الصورة في سلفون إيثيل الأيسوبروبيل. يتم إنشاء مظهر تشبه الاسفنج بواسطة الجزيئات كثف صباغة. D: وضوح الشمس Aquaporin في الأم أغشية عدسة البقري تصوير في المخزن نفسه كما B. إن tetramer aquaporin يتم تمييز. هيكل الفرعي الموافق الحلقات بين حلزونية مرئية في تضاريس بينما تظهر مرحلة تناقض لافت للنظر مختلفة بسبب سلوك غير عادي المياه بالقرب من البروتين. يتم تكييفها الصور من الحكام 36 (ب)، المرجع 38 (C) والمرجع 67 (D). شريط المقياس هو 5 نانومتر (A)، و 10 نانومتر (B)، 3 نانومتر في (C)، و 15 نانومتر (D) على نطاق ولون يدل على التوالي على ارتفاع ومرحلة الاختلاف من 200 م و 15 درجة (A)، و 600 مساء و 4 درجات (ب)، و 2.5 نانومتر و 2.5 درجة (C)، و 1.6 نانومتر و 9.5 درجة (D).تحميل / 54924 / 54924fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: صور الممثل AM-AFM من عينات من الصعب في حلول السوائل. ج: الكالسيت وضوح الشمس [ Equation2 ] سطح تصويرها في محلول الماء عالى النقاء معايرتها. ب: تيتانات السترونتيوم المصورة التي تم الحصول عليها في سلفوكسيد ثنائي ميثيل ([دمس]). كان عالية الدقة غير ممكن في المياه. C: بلدية موسكو الميكا تصوير في 3 ملي RbCl - واحدة أيونات كثف الروبيديوم + مرئية على مواقع شعرية الميكا في كل من مرحلة وارتفاع بالاشعة. D: كربيد السيليكون في تصويرها في DMSO. وترد الترتيبات البلورات المتوقع في صور B و D. يتم تكييفها على الصور من المرجع 68 (أ)، المرجع 42 (B و D)،والمرجع 44 (C). شريط المقياس هو 3 نانومتر (A، B، D) و 5 نانومتر (C). يشير مقياس اللون على التوالي على ارتفاع ومرحلة الاختلاف من 250 م و 14 درجة (A)، و 600 م و 5.5 درجة (B)، 800 م و 15 درجة (C)، و 500 م و 3.5 درجة (D). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

على افتراض أن تم اختيارها السائل التصوير وصلابة ناتئ بشكل مناسب، والخطوات الأكثر أهمية لتحقيق نجاح عالية الدقة هي تعديل السعة التصوير، والنظافة العامة للنظام التحقيق.

سعة مماثلة لسمك المنطقة السائلة بينية (عادة أقل من 2 نانومتر) المسابير الاختلاف أساسا في خصائص بينية المذيبات 42. إذا كانت سعة التذبذب كبيرة جدا، وسوف غيض تهتز اجتياز بعيدة المدى، وحقول القوة غير الخطية 52 التي تمنع استقرار الحركة ناتئ، وضرب حتما العينة بغض النظر عن الظروف التصوير 29، مما أدى إلى تدهور هذا القرار. وبصرف النظر عن الخسارة في القرار، والتوافقيات العليا تبدأ في الظهور في الحركة طرف والنظام يصبح أكثر تعقيدا لنموذج 55. بدلا من ذلك، س إذا كانت السعة التصوير هو صغير جداجزء نلي من واجهة وسبر (عادة طبقات محددة من السائل البيني) والتصوير مستقر يمكن أن يتحقق إلا مع الكابولي شديدة (> 10 نيوتن / متر في الماء 53) لمرضية نسبة الإشارة إلى الضوضاء، مع خطر عينات الناعمة الضارة على الاختلافات ارتفاع كبير. الحاجة إلى الكابولي شديدة هي للتغلب على الضوضاء الحرارية التي يمكن أن تصبح أكثر أهمية أن إشارة يقاس عند العمل مع سعة صغيرة، والتفاعلات طويلة المدى بين طرف والعينة لا تزال موجودة، ولكن ثابتة إلى حد كبير ولا تؤثر على عالية الدقة التباين في الصور التي تم الحصول عليها.

نظافة البيئة التصوير هو أمر بالغ الأهمية عندما يتعلق الأمر عالية الدقة فؤاد. مركبات غير مرغوب فيها في النظام يمكن أن تتداخل مع كل من التصوير والتحليل الطيفي قوة. هناك نوعان رئيسيان من التلوث التي تميل للتأثير على التجارب: (ط) الملوثات مباشرة مرئية عند التصوير ( الشكل (4A). قبل تغيير رأس والعينة، فإنه يستحق الحصول على منحنيات الطيفية مع انحراف كبير، والضغط على نحو فعال من الصعب طرف ضد العينة مرارا وتكرارا. هذا من شأنه أن يضر عادة معلومات جديدة، ولكن يمكن تنظيف بعض الأحيان معلومات سرية قذرة أو حث المواقع ترطيب مستقرة مناسبة للتصوير. و، ومع ذلك، لا بد أن تلاشت هذه الحافة، وبالتالي تكون مناسبة فقط لعينة مسطحة حتى لو تحسن التصوير. في حالة يشتبه التلوث على عينات شديدة، قد يكون من المفيد محاولة لصورة مع eigenmode الثاني من ناتئ قبل محاولة إجراء مدمر إلى حد ما هو موضح أعلاه. وهذا يتطلب ببساطة جنوب غربالحكة تردد القيادة إلى eigenmode الثاني وإعادة تعديل السعة / المضبوطة مسبقا (انظر مناقشة استكشاف الأخطاء وإصلاحها أدناه). صلابة فعالة لزيادة ناتئ كبير عندما كان يعمل على eigenmode الثاني ويجوز دفع أي ملوثات كثف ضعيفة بعيدا عن الحافة بينما التصوير. هذه الاستراتيجية لا يحل محل الحاجة لعينة نظيفة ومعلومات سرية، ولكنه يقدم بعض السبل أخرى للحصول على الصور مرضية عندما تلميح / عينة هو واضح ليست مثالية.

الشكل (4)
الشكل 4: أمثلة من التلوث مراعاتها عند التصوير الميكا بلدية موسكو التي تمنع التصوير ذات الدقة العالية. تصوير ميكا في 5 ملي RbCl - أي الجزيئات الملوثة واضحة: A. ب: تلوث تأخذ شكل مجاميع من أجل من عشرات نانومتر في حين التصوير في الماء عالى النقاء اسميا. C: هياكل تجميعها الذاتي التي شكلتها contamiالجسيمات نانت محبة للجهتين يفترض في الطبيعة. أجري التصوير مرة أخرى في الماء عالى النقاء اسميا. D: أقسام إزاحة رأسية الموافق الخطوط المتقطعة في A و B و C يدل على الانحراف عن سطح مستو بالذرة الميكا و. الحانات النطاق في A و B و C تتوافق إلى 300 نانومتر. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الحالة (ب) هو أكثر شيوعا وتتميز أساسا من حقيقة محبط أن ملامح نانومتر الفرعي ببساطة لا يمكن حلها، بغض النظر عن الظروف التصوير. توقيع هذا النوع من الحالات عادة ما يكون وضوحا في قياس قوة التحليل الطيفي والتي تميل إلى إظهار بعض التناقضات. ويمكن أن تشمل هذه المنحنيات سيئة استنساخه والسعة مقابل منحنيات المسافة التي تحيد كثيرا عن شكل السيني نموذجي 42. إذا الملوثات، الأيونية أو غير ذلك، هي dispersإد متجانس في جميع أنحاء السائل، فإنها قد لا تظهر في التصوير الطوبوغرافي ولكن يمكن أن يعطل بنية الماء من العينة 69، وهو أمر حاسم للحفاظ على منتظم طرف عينة التفاعل 29 و الحصول على دقة عالية 70. قد يكون هناك أيضا تأثيرات مباشرة للملوثات على العينة، خصوصا في التجارب الغازية والبيولوجية. على سبيل المثال، فمن المعروف أن وجود الكحول (من إجراء التنظيف) يمكن fluidify هلام المرحلة دهن طبقات ثنائية 71-73، مما يجعل قرار على مستوى النانومتر الفرعي المستحيل. إذا عالية الدقة غير ممكن، يجب توخي الحذر لأول مرة في عملية التنظيف، مع التركيز بصفة خاصة على أي معدات التي تأتي في اتصال مع الحل التصوير. حتى المركبات مستقرة ظاهريا مثل راتنجات الايبوكسي قد منذاب في السائل إلى حد ما إذا لم يشف تماما.

عالية الدقة التصوير مع AM-AFM هو تطلبا، ويتطلب الصبر وفي كثير من الأحيان العديد من التجارب قبل الوصول إلى أفضل الظروف الممكنة التصوير. يمكن القضايا التجريبية الصغيرة تصبح بسهولة مهمة بما فيه الكفاية لمنع مهارات عالية الدقة واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ضرورية. فيما يلي ندرج بعض المشاكل الأكثر شيوعا التي واجهناها مع الحل المقترح لدينا.

ناتئ ضبط

معظم AFMs التجارية تستخدم الإثارة الصوتية لدفع ناتئ. في مثل هذه الحالة، ضبط ناتئ، كما هو موضح في الخطوة 5.4، بالقرب ترددها الرنانة غالبا ما يقدم أداء كافية للعمل في الهواء. في البيئات السائلة، السائل يميل إلى إحداث بعض اقتران بين أجزاء الميكانيكية المختلفة من AFM مثل رقاقة ناتئ وحامل. وهذا يمكن أن يؤثر على صدى واضح للتعزية، وغالبا ما يتضح من الطيف الترددي ناتئ أن يسلك العديد من القمم والوديان الحادة الشائع وصفها بأنها "غابة من القمم". ونتيجة لذلك، غالبا ما يكون من الصعب العثور على كورتردد محرك ط. وجود هذه القمم أيضا في بيئات الغاز، ولكن نظرا لارتفاع قيمة عامل نوعية ناتئ، واتساع في الأصداء هو أكبر بكثير 74،75. في السائل اختيار ذروة مناسبة لدفع ناتئ قد لا تكون سهلة ويمكن أن يتطلب التجربة والخطأ. في الممارسة العملية، في ذروة تردد مع اختلاف أشد في السعة في "غابة من القمم" حول تردد صدى عادة ما يكون أفضل رهان على الرغم من كونه ليس بالضرورة بالضبط على الرنين وغالبا ما يقدم تردد القيادة كافيا للحصول على التصوير ذات الدقة العالية.

تشويه الصورة

التصوير الانجراف في كثير من الأحيان مشكلة عند تسعى عالية الدقة ويجعل الصور تبدو مشوهة (عادة امتدت). أصله الحراري عموما، إما لأن الماسح الضوئي / فؤاد لم يصل لها توازن درجة حرارة التشغيل، أو لأن جزءا من السائل عينة تتبخر بسرعة (على سبيل المثال، والتصوير في الكحول ). في جميع الحالات، والانجراف يصبح يكاد يذكر في التوازن الحراري. ولذا فمن المفيد أن يثبت درجة حرارة العينة إن أمكن. خلاف ذلك، يجدر ترك AFM لفحص عينة فارغة (مسح الحجم الكبير في معدل المسح بطيئة) لعدة ساعات قبل إجراء التجربة. إذا تبخر ليست قضية، من الأفضل القيام بهذا الإجراء بعد الخطوة 6 من الإجراء، مع الحرص على سحب أول طرف على بعد مسافة قصيرة (على سبيل المثال، 20 ميكرون) من على سطح الأرض. في بعض الأحيان، وسوف تظل الانجراف حتى بعد thermalization واسعة النطاق. وهذا يدل عادة على أن ناتئ أو رقاقة لها وسحب جزئيا العينة في حين التصوير، الأمر الذي يمكن أن يحدث على عينات متماسكة لينة مثل الأغشية الرقيقة أو إذا لم يتم وضع الطرف / ناتئ / رقاقة بشكل مناسب. على رقائق التي تستضيف ناتئ أكثر من / طرف، بل هو غالبا ما تكون مفيدة لكسر ناتئ أن لا تكون قيد الاستعمال بدلا من السماح لهم بسحب فوق السطح.

القوة الأيونية

ntent "> منذ تهيمن على التصوير بواسطة السائل البيني، فإنه من المفيد في بعض الأحيان إلى إضافة بعض الملح عالية الدقة التصوير من سطح اتهم في المياه، ودور الملح ذو شقين: أولا، أنه يعدل المشهد ترطيب لل سطح تصويرها على الامتصاص، والتي غالبا ما يعزز التباين. ثانيا، فإنه يساعد على شاشة التفاعلات كهرباء قوية بين طرف وعينة (على سبيل المثال، على الميكا). عموما، الأيونات أكبر من هذا القبيل البوتاسيوم والروبيديوم والسيزيوم يسمح أفضل الصور نظرا لخصائص الترطيب الخاصة بها 76، وحقيقة أنها في كثير من الأحيان كثف أساسا في حالة ترطيب فريدة من نوعها 77.

سيئة ناتئ / غيض

إذا كان يشتبه في أن ناتئ هو مصدر للتلوث (انظر الأعراض المذكورة أعلاه)، فإنه يجب فحص لأول مرة تحت المجهر الضوئي. إذا المخزنة في مربع هلام، ناتئ قد التقط آثار البوليمرات جل أو زيت السليكون 59 التي يمكن أن تظهرفي الحالات القصوى، والبقع الداكنة، على الجزء الخلفي من ناتئ (كما في الشكل 5A). ضوئي؛ ضوحراري التذبذب للناتئ يمكن أن تحدث بقع مماثلة، ولكن كان ذلك راجعا إلى تدهور / ارتفاع درجة حرارة طلاء ناتئ بواسطة الليزر القيادة. تلوث يميل إلى يبدو عشوائيا على تعزية. ألف (12 ساعة) التنظيف أطول مع الأيزوبروبانول و، ثم، مع الماء عالى النقاء يمكن إزالة أي جزيئات غير مرغوب فيها من ناتئ.

الرقم 5
الرقم 5: مقارنة بين ناتئ جديدة واحدة متطابقة التي استخدمت على نطاق واسع على الأسطح الصلبة وغادرت في مربع هلام لفترة طويلة. ج: الأعلى. الصورة البصرية للتعزية العلامة التجارية الجديدة التي تم تنظيفها (انظر الداخلي). أسفل؛ الصورة البصرية مما يدل على ظهور التلوث المرئي (السهم الأزرق) من مربع هلام. ب: مقارنة بين أطياف الحراري منها الكابولي ".توسيع الأولى ذروة صدى ناتئ القديم واضح (السهم الأخضر) ويتم تحسين بعض وسائط العليا (السهم الأزرق). تم أطياف إزاحة رأسية وقدم على نطاق سجل-سجل لوضوح. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وإذا لم يتحقق القرار نانومتر الفرعي المطلوبة، على الرغم من الصور المقبولة في دقة أقل، فمن الممكن أن الطرف فؤاد أصبح تعديل كيميائيا خلال بيئة التخزين. هذا يمكن معالجته عن طريق التعرض للرقاقة ناتئ إلى مؤكسد فوق البنفسجية لمدة 120 ثانية، والذي يساعد في تكوين مجموعات سطح ماء على طرف 60. يجب توخي الحذر ولكن، كما في الوقت المحدد الضروري قد تختلف اعتمادا على هندسة طرف وقوة الأشعة فوق البنفسجية، والإفراط في التعرض يمكن أن يؤدي إلى تصد من طرف وانخفاض القرار.

الضوضاء الحرارية </ P>

عالية الدقة التصوير يتطلب حساسية كبيرة للتغيرات في القوة ومسافات (عادة القوات شبه السندات الإذنية وشبه آنغستروم مسافات 78). لالكابولي ليونة، والحركة الحرارية الميكانيكية للتعزية بسبب الحركة البراونية (الاهتزاز الحراري) الجوهريه يمكن أن يكون مشكلة. في أول تقدير تقريبي، مع ناتئ من صلابة ك، فمن غير الممكن قياس يتميز أصغر من Equation1 ، واتساع الضوضاء الحرارية، حيث ك B هو ثابت بولتزمان و T هي درجة الحرارة. عمليا، وذلك باستخدام ناتئ مع ترددات الرنين أعلى ينتشر الضوضاء على نطاق وتردد أكبر، ويقلل من مستوى الضوضاء بشكل عام في عرض النطاق قياس 79.

أعلى التصوير eigenmode

يمكن أن يكون مفيدا في بعض الأحيان لتشغيل ناتئ في eigenmode الثانيويرجع ذلك إلى زيادة صلابة فعالة (انظر مناقشة التلوث). عمليا، يتم ذلك ببساطة من خلال قيادة ناتئ في eigenmode الثاني (ذروة صدى الثانية في التردد العالي، انظر الشكل 1A). عندما ضبط ناتئ، ببساطة اختيار eigenmode الثاني بدلا من الرنين الرئيسي وانتقل إلى الخطوة 5.4. لاحظ أن InvOLS ستكون مختلفة عند قيادة ناتئ في eigenmode الثاني. عادة ~ 1/3 من InvOLS يقاس في الخطوة 5.2 لناتئ مستطيلة.

القيد الرئيسي من هذه التقنية هو أنه يتطلب المشهد اذابة مستقر على سطح العينة. يجب أن تكون العينة قوية بما فيه الكفاية للسماح للتشويش السائل بينية دون إحداث تشوه كبير من العينة نفسها. هذا يمكن أن يكون تحديا على لينة جدا وعينات غير مستقرة مثل هذه الجزيئات الحيوية الكبيرة. بالإضافة إلى ذلك، صغيرة السعة AFM كما هو موضح هنا لا يمكن الحصول على معلومات حول الميكانيكية عroperties لعينة، كما غيض ناتئ يقضي معظم وقته في السائل البيني. لهذا، قد يكون من المفيد استخدام أساليب أخرى مثل الكمية النانوميكانيكية رسم الخرائط 80 أو الاستفادة من التوافقيات العليا للحركة ناتئ. وتتعزز الهارمونيكا أعلى عموما عند التصوير في السائل (مع انخفاض العوامل النوعية) 29،81 - 83 ويمكن أن توفر في وقت واحد التضاريس وصلابة من العينات 25،81 - 84 ولكنها تضر عالية الدقة عموما. غيرها من القيود المتأصلة لجميع تقنيات المسح المجهري التحقيق لا تزال سارية المفعول هنا، ولا سيما أن النتائج تنطوي حتما على معلومات حول غيض القياس. استخدام سعة صغيرة هي أيضا ليست مثالية للعينات مع وجود اختلافات ارتفاع كبير. فإن رد الفعل رد فعل حتما أكثر ببطء عندما اختلافات ارتفاع أكبر من السعة والتصوير، وبالتالي المخاطرة عينة وغيض الضرر. استخدام سو يخفف يونة ناتئ هذه المشكلة إلى حد ما.

والميزة الرئيسية لأسلوب المقدمة هنا هو حقيقة أنه يوفر أعلى دقة صورة ممكنة مع فؤاد في السائل لكن يمكن تنفيذها على أي AFM التجاري، شريطة أن مستويات ضجيج آلة منخفضة بما فيه الكفاية. وحققت قرار مماثل على الأوراق التجارية عادة في وضع الاتصال، أو في بعض الأحيان في FM-AFM مع الكابولي شديدة. العمل في AM-وضع ومع الكابولي لينة نسبيا يسمح لخيارات أوسع من العينات، وأسهل للتنفيذ من وزير الخارجية AFM في معظم الأنظمة. يعتمد هذا النهج على استغلال قوات اذابة الموجودة في واجهة بين أي الصلبة والسائلة لتعزيز القرار، والحصول على المعلومات الكيميائية المحلية. ويمكن من حيث المبدأ أن تستخدم في الظروف المحيطة، والاعتماد فقط على طبقات المياه (عادة عدة نانومتر سميكة) بناء على معظم الأسطح بسبب الرطوبة في الهواء ل. المبادئ الأساسية لللا تزال استراتيجية عالية الدقة دون تغيير ولكن معظم من طرف في الهواء، مع وجود جسر الشعرية بين قمة طرف والعينة 85. وقد ثبت عالية الدقة على عينات شديدة في هذه الظروف 86،87. شروط التصوير ولكن مختلفة عن تلك السائل مغمورة بسبب ارتفاع Q-عامل التذبذب ناتئ في. عمليا، وجدنا أنه من الصعب تحقيق عملية مستقرة على عينات لينة أو غير النظامية، ويفترض نظرا للتغيرات الزمنية للجسر الشعرية وزيادة Q-العوامل لصلابة ناتئ معين.

بروتوكول الموصوفة هنا يقدم منهجية لتحقيق الصور ذات الدقة على مستوى الجزيئي للعينات في السائل مع معظم AM-AFMs التجارية الحديثة. ونحن نقدم المنطق العلمي وراء خيارنا من المعلمات التصوير والتأكيد على دور القوات اذابة. نحن أيضا مناقشة المشاكل المشتركة وفي تلوث معين. تفاعلات محددة طرف عينة كاليفورنيان تختلف تلك الرسوم تبعا بشكل كبير على مضمون الحل التصوير، وهندسة ناتئ والمادية، والكيمياء العينة. وفهم عملي لطبيعة القوى المهيمنة الحالية خلال المسح لذا فمن الضروري للتكيف مع هذا البروتوكول إلى نظم جديدة وضمان الحصول على نتائج موثوقة. عندما الأمثل، والمنهج التجريبي قوية لكسب في الموقع رؤى المستوى الجزيئي المحلية من العينات في حل.

Acknowledgments

بتمويل من الهندسة والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (منح 1452230 وEP / M023915 / 1)، والتكنولوجيا الحيوية، ومجلس بحوث العلوم البيولوجية (منح BB / M024830 / 1) واعترف والمجلس الأوروبي (FP7 CIG 631186) بامتنان.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multimode IIIA AFM Brucker NA One of the machine used
Cypher ES AFM Asylum Resarch NA One of the machine used
AFM cantilever/tip Nanoworld Arrow UHF-AUD best for high frequency
AFM cantilever/tip Olympus RC800-PSA versatile and cheap
ultrapure water Milipore NA lab filtering systems can induce contamination
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aaldrich 200-664-3  standard chemical, no further purification
Monovalent salts Sigma-Aaldrich standard chemical, no further purification
Lipids Avanti Polar Lipids lipid bilayers formed using stadard protocols
Crystals MTI polished crystals
Scotch tape 3M Scotch Magic Tape Translucent tape works best. Transparent sticks too strongly

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Binnig, G., Quate, C. F. Atomic Force Microscope. Phys. Rev. Lett. 56 (9), 930-933 (1986).
  2. Rico, F., Su, C., Scheuring, S. Mechanical mapping of single membrane proteins at submolecular resolution. Nano Lett. 11 (9), 3983-3986 (2011).
  3. Payam, A. F., Ramos, J. R., Garcia, R. Molecular and nanoscale compositional contrast of soft matter in liquid: interplay between elastic and dissipative interactions. ACS Nano. 6 (6), 4663-4670 (2012).
  4. Grandbois, M. How Strong Is a Covalent Bond. Science. 283 (5408), 1727-1730 (1999).
  5. Oesterhelt, F. Unfolding Pathways of Individual Bacteriorhodopsins. Science. 288 (5463), 143-146 (2000).
  6. McLean, R. S., Doyle, M., Sauer, B. B. High-Resolution Imaging of Ionic Domains and Crystal Morphology in Ionomers Using AFM Techniques. Macromolecules. 33 (17), 6541-6550 (2000).
  7. Scheuring, S., Reiss-Husson, F., Engel, A., Rigaud, J. L., Ranck, J. L. High-resolution AFM topographs of Rubrivivax gelatinosus light-harvesting complex LH2. EMBO J. 20 (12), 3029-3035 (2001).
  8. Novoselov, K. S., et al. Two-dimensional atomic crystals. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 102 (30), 10451-10453 (2005).
  9. Freeman, M. R., Choi, B. C. Advances in magnetic microscopy. Science. 294 (5546), 1484-1488 (2001).
  10. Bockrath, M., et al. Scanned Conductance Microscopy of Carbon Nanotubes and λ-DNA. Nano Lett. 2 (3), 187-190 (2002).
  11. Oliver, R. A. Advances in AFM for the electrical characterization of semiconductors. Reports Prog. Phys. 71 (7), 076501 (2008).
  12. Butt, H. -J., Jaschke, M. Calculation of thermal noise in atomic force microscopy. Nanotechnology. 6 (1), 1-7 (1995).
  13. Majumdar, A., Carrejo, J. P., Lai, J. Thermal imaging using the atomic force microscope. Appl. Phys. Lett. 62 (20), 2501 (1993).
  14. Vezenov, D. V., Noy, A., Ashby, P. Chemical force microscopy: probing chemical origin of interfacial forces and adhesion. J. Adhes. Sci. Technol. 19 (3-5), 313-364 (2005).
  15. Gerber, C., Lang, H. P. How the doors to the nanoworld were opened. Nat. Nanotechnol. 1 (1), 3-5 (2006).
  16. Bharat, B. Encyclopedia of Nanotechnology. , Springer Netherlands. Dordrecht. (2012).
  17. Giessibl, F. J. Subatomic Features on the Silicon (111)-(7x7) Surface Observed by Atomic Force Microscopy. Science. 289 (5478), 422-425 (2000).
  18. Haugstad, G. Atomic Force Microscopy. , John Wiley & Sons, Inc. Hoboken. (2012).
  19. Moreno-Herrero, F., Colchero, J., Gòmez-Herrero, J., Barò, A. M. Atomic force microscopy contact, tapping, and jumping modes for imaging biological samples in liquids. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 69 (3), Pt 1 031915 (2004).
  20. Gan, Y. Atomic and subnanometer resolution in ambient conditions by atomic force microscopy. Surf. Sci. Rep. 64 (3), 99-121 (2009).
  21. Kodera, N., Yamamoto, D., Ishikawa, R., Ando, T. Video imaging of walking myosin V by high-speed atomic force microscopy. Nature. 468 (7320), 72-76 (2010).
  22. Picco, L. M., et al. High-speed AFM of human chromosomes in liquid. Nanotechnology. 19 (38), 384018 (2008).
  23. Fantner, G. E., et al. Components for high speed atomic force microscopy. Ultramicroscopy. 106 (8-9), 881-887 (2006).
  24. Garcia, R., Herruzo, E. T. The emergence of multifrequency force microscopy. Nat. Nanotechnol. 7 (4), 217-226 (2012).
  25. Raman, A., et al. Mapping nanomechanical properties of live cells using multi-harmonic atomic force microscopy. Nat. Nanotechnol. 6 (12), 809-814 (2011).
  26. Fukuma, T., Higgins, M. J., Jarvis, S. P. Direct imaging of individual intrinsic hydration layers on lipid bilayers at Angstrom resolution. Biophys. J. 92 (10), 3603-3609 (2007).
  27. Higgins, M. J., et al. Structured water layers adjacent to biological membranes. Biophys. J. 91 (7), 2532-2542 (2006).
  28. Kobayashi, K., Oyabu, N., et al. Visualization of hydration layers on muscovite mica in aqueous solution by frequency-modulation atomic force microscopy. J. Chem. Phys. 138 (18), 184704 (2013).
  29. Voïtchovsky, K. Anharmonicity, solvation forces, and resolution in atomic force microscopy at the solid-liquid interface. Phys. Rev. E. Stat. Nonlin. Soft Matter Phys. 88 (2), 022407 (2013).
  30. Müller, D. J., Dufrêne, Y. F. Atomic force microscopy as a multifunctional molecular toolbox in nanobiotechnology. Nat. Nanotechnol. 3 (5), 261-269 (2008).
  31. Alessandrini, A., Seeger, H. M., Di Cerbo, A., Caramaschi, T., Facci, P. What do we really measure in AFM punch-through experiments on supported lipid bilayers. Soft Matter. 7 (15), 7054 (2011).
  32. Schmidt, S., Biegel, E., Müller, V. The ins and outs of Na(+) bioenergetics in Acetobacterium woodii. Biochim. Biophys. Acta. 1787 (6), 691-696 (2009).
  33. Bippes, C. A., Muller, D. J. High-resolution atomic force microscopy and spectroscopy of native membrane proteins. Reports Prog. Phys. 74 (8), 086601 (2011).
  34. Chada, N., et al. Glass is a Viable Substrate for Precision Force Microscopy of Membrane Proteins. Sci. Rep. 5, 12550 (2015).
  35. Möller, C., Allen, M., Elings, V., Engel, A., Müller, D. J. Tapping-mode atomic force microscopy produces faithful high-resolution images of protein surfaces. Biophys. J. 77 (2), 1150-1158 (1999).
  36. Antoranz Contera, S., Voïtchovsky, K., Ryan, J. F. Controlled ionic condensation at the surface of a native extremophile membrane. Nanoscale. 2 (2), 222-229 (2010).
  37. Kumaki, J. Observation of polymer chain structures in two-dimensional films by atomic force microscopy. Polym. J. 48 (1), 3-14 (2015).
  38. Voïtchovsky, K., et al. In Situ Mapping of the Molecular Arrangement of Amphiphilic Dye Molecules at the TiO Surface of Dye-Sensitized Solar Cells. ACS Appl. Mater. Interfaces. 7 (20), 10834-10842 (2015).
  39. Segura, J. J., et al. Adsorbed and near surface structure of ionic liquids at a solid interface. Phys. Chem. Chem. Phys. 15 (9), 3320-3328 (2013).
  40. Hayes, R., Warr, G. G., Atkin, R. Structure and Nanostructure in Ionic Liquids. Chem. Rev. 115 (13), 150601082109009 (2015).
  41. Fukuma, T., Kobayashi, K., Matsushige, K., Yamada, H. True atomic resolution in liquid by frequency-modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 87 (3), 034101 (2005).
  42. Voïtchovsky, K., Kuna, J. J., Contera, S. A., Tosatti, E., Stellacci, F. Direct mapping of the solid-liquid adhesion energy with subnanometre resolution. Nat. Nanotechnol. 5 (6), 401-405 (2010).
  43. Siretanu, I., et al. Direct observation of ionic structure at solid-liquid interfaces: a deep look into the Stern Layer. Sci. Rep. 4, 4956 (2014).
  44. Ricci, M., Spijker, P., Voïtchovsky, K. Water-induced correlation between single ions imaged at the solid-liquid interface. Nat. Commun. 5, 4400 (2014).
  45. Kiracofe, D., Raman, A. On eigenmodes, stiffness, and sensitivity of atomic force microscope cantilevers in air versus liquids. J. Appl. Phys. 107 (3), 033506 (2010).
  46. San Paulo, A., Garcìa, R. High-resolution imaging of antibodies by tapping-mode atomic force microscopy: attractive and repulsive tip-sample interaction regimes. Biophys. J. 78 (3), 1599-1605 (2000).
  47. Garcìa, R., San Paulo, A. Attractive and repulsive tip-sample interaction regimes in tapping-mode atomic force microscopy. Phys. Rev. B. 60 (7), 4961-4967 (1999).
  48. Butt, H. J. Electrostatic interaction in atomic force microscopy. Biophys. J. 60 (4), 777-785 (1991).
  49. Israelachvili, J. N. Intermolecular and Surface Forces. Intermol. Surf. Forces. , (2011).
  50. Yu, C. -J., et al. Order in molecular liquids near solid-liquid interfaces. Appl. Surf. Sci. 182 (3-4), 231-235 (2001).
  51. Ortiz-Young, D., Chiu, H. -C., Kim, S., Voïtchovsky, K., Riedo, E. The interplay between apparent viscosity and wettability in nanoconfined water. Nat. Commun. 4, 2482 (2013).
  52. Patil, S. V., Hoffmann, P. M. Small-Amplitude Atomic Force Microscopy. Adv. Eng. Mater. 7 (8), 707-712 (2005).
  53. Fukuma, T., Jarvis, S. P. Development of liquid-environment frequency modulation atomic force microscope with low noise deflection sensor for cantilevers of various dimensions. Rev. Sci. Instrum. 77 (4), 043701 (2006).
  54. Burkhardt, M., et al. Concept of a molecular charge storage dielectric layer for organic thin-film memory transistors. Adv. Mater. 22 (23), 2525-2528 (2010).
  55. Garcìa, R. Amplitude Modulation Atomic Force Microscopy. , Wiley: Weinheim. (2010).
  56. Uchihashi, T., et al. Quantitative force measurements in liquid using frequency modulation atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 85 (16), 3575 (2004).
  57. Yamada, H., et al. Molecular Resolution Imaging of Protein Molecules in Liquid Using Frequency Modulation Atomic Force Microscopy. Appl. Phys. Express. 2 (9), 095007 (2009).
  58. Stark, M., et al. From Images to Interactions: High-Resolution Phase Imaging in Tapping-Mode Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 80 (6), 3009-3018 (2001).
  59. Lo, Y. -S., et al. Organic and Inorganic Contamination on Commercial AFM Cantilevers. Langmuir. 15 (19), 6522-6526 (1999).
  60. Akrami, S. M. R., Nakayachi, H., Watanabe-Nakayama, T., Asakawa, H., Fukuma, T. Significant improvements in stability and reproducibility of atomic-scale atomic force microscopy in liquid. Nanotechnology. 25 (45), 455701 (2014).
  61. Meyer, G., Amer, N. M. Novel optical approach to atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 53 (12), 1045 (1988).
  62. Alexander, S., et al. An atomic-resolution atomic-force microscope implemented using an optical lever. J. Appl. Phys. 65 (1), 164 (1989).
  63. Green, C. P., et al. Normal and torsional spring constants of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 75 (6), 1988 (2004).
  64. Cleveland, J. P., Manne, S., Bocek, D., Hansma, P. K. A nondestructive method for determining the spring constant of cantilevers for scanning force microscopy. Rev. Sci. Instrum. 64 (2), 403 (1993).
  65. Hutter, J. L., Bechhoefer, J. Calibration of atomic-force microscope tips. Rev. Sci. Instrum. 64 (7), 1868 (1993).
  66. Sader, J. E., Larson, I., Mulvaney, P., White, L. R. Method for the calibration of atomic force microscope cantilevers. Rev. Sci. Instrum. 66 (7), 3789 (1995).
  67. Ricci, M., Quinlan, R., Voitchovsky, K. No Title. Soft Matter. , Forthcoming (2016).
  68. Ricci, M., Spijker, P., Stellacci, F., Molinari, J. -F., Voïtchovsky, K. Direct visualization of single ions in the Stern layer of calcite. Langmuir. 29 (7), 2207-2216 (2013).
  69. Kilpatrick, J. I., Loh, S. -H., Jarvis, S. P. Directly probing the effects of ions on hydration forces at interfaces. J. Am. Chem. Soc. 135 (7), 2628-2634 (2013).
  70. Fukuma, T., et al. Mechanism of atomic force microscopy imaging of three-dimensional hydration structures at a solid-liquid interface. Phys. Rev. B. 92 (15), 155412 (2015).
  71. Maula, T., Westerlund, B., Slotte, J. P. Differential ability of cholesterol-enriched and gel phase domains to resist benzyl alcohol-induced fluidization in multilamellar lipid vesicles. Biochim. Biophys. Acta. 1788 (11), 2454-2461 (2009).
  72. Schroeder, F., Morrison, W. J., Gorka, C., Wood, W. G. Transbilayer effects of ethanol on fluidity of brain membrane leaflets. Biochim. Biophys. Acta - Biomembr. 946 (1), 85-94 (1988).
  73. Tierney, K. J., Block, D. E., Longo, M. L. Elasticity and phase behavior of DPPC membrane modulated by cholesterol, ergosterol, and ethanol. Biophys. J. 89 (4), 2481-2493 (2005).
  74. Basak, S., Raman, A. Dynamics of tapping mode atomic force microscopy in liquids: Theory and experiments. Appl. Phys. Lett. 91 (6), 064107 (2007).
  75. Eslami, B., Solares, S. D. Experimental approach for selecting the excitation frequency for maximum compositional contrast in viscous environments for piezo-driven bimodal atomic force microscopy. J. Appl. Phys. 119 (8), 084901 (2016).
  76. Collins, K. D., Neilson, G. W., Enderby, J. E. Ions in water: characterizing the forces that control chemical processes and biological structure. Biophys. Chem. 128 (2-3), 95-104 (2007).
  77. Lee, S. S., Fenter, P., Park, C., Sturchio, N. C., Nagy, K. L. Hydrated cation speciation at the muscovite (001)-water interface. Langmuir. 26 (22), 16647-16651 (2010).
  78. Liang, S., et al. Thermal noise reduction of mechanical oscillators by actively controlled external dissipative forces. Ultramicroscopy. 84 (1-2), 119-125 (2000).
  79. Hodges, A. R., Bussmann, K. M., Hoh, J. H. Improved atomic force microscope cantilever performance by ion beam modification. Rev. Sci. Instrum. 72 (10), 3880 (2001).
  80. Adamcik, J., Berquand, A., Mezzenga, R. Single-step direct measurement of amyloid fibrils stiffness by peak force quantitative nanomechanical atomic force microscopy. Appl. Phys. Lett. 98 (19), 193701 (2011).
  81. Preiner, J., Tang, J., Pastushenko, V., Hinterdorfer, P. Higher harmonic atomic force microscopy: imaging of biological membranes in liquid. Phys. Rev. Lett. 99 (4), 046102 (2007).
  82. Dulebo, A., et al. Second harmonic atomic force microscopy imaging of live and fixed mammalian cells. Ultramicroscopy. 109 (8), 1056-1060 (2009).
  83. Xu, X., Melcher, J., Basak, S., Reifenberger, R., Raman, A. Compositional contrast of biological materials in liquids using the momentary excitation of higher eigenmodes in dynamic atomic force microscopy. Phys. Rev. Lett. 102 (6), 060801 (2009).
  84. Turner, R. D., Kirkham, J., Devine, D., Thomson, N. H. Second harmonic atomic force microscopy of living Staphylococcus aureus bacteria. Appl. Phys. Lett. 94 (4), 043901 (2009).
  85. Barcons, V., Verdaguer, A., Font, J., Chiesa, M., Santos, S. Nanoscale Capillary Interactions in Dynamic Atomic Force Microscopy. J. Phys. Chem. C. 116 (14), 7757-7766 (2012).
  86. Wastl, D. S., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomically resolved graphitic surfaces in air by atomic force microscopy. ACS Nano. 8 (5), 5233-5239 (2014).
  87. Wastl, D. S., Judmann, M., Weymouth, A. J., Giessibl, F. J. Atomic Resolution of Calcium and Oxygen Sublattices of Calcite in Ambient Conditions by Atomic Force Microscopy Using qPlus Sensors with Sapphire Tips. ACS Nano. 9 (4), 3858-3865 (2015).

Tags

الهندسة، العدد 118، القوة الذرية المجهر، السائل، نانومتر الفرعي القرار التصوير، السعة التشكيل، دهن طبقة ثنائية، biomembranes، بلورات، ناتئ، التوافقيات، eigenmode قوات اذابة
نانومتر الفرعي التصوير القرار مع السعة التشكيل الذرية المجهري القوة في السائل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Miller, E. J., Trewby, W., Farokh… More

Miller, E. J., Trewby, W., Farokh Payam, A., Piantanida, L., Cafolla, C., Voïtchovsky, K. Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid. J. Vis. Exp. (118), e54924, doi:10.3791/54924 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter