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Genetics

सिलेज की Metagenomic विश्लेषण

Published: January 13, 2017 doi: 10.3791/54936
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Biosciences, University of Exeter

Introduction

Metagenomics डीएनए के प्रत्यक्ष विश्लेषण पर्यावरण के नमूनों 1 के भीतर पाया जैविक समुदायों से शुद्ध और मूल रूप से unculturable बैक्टीरिया अवसादों 2 में पाया पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया गया था। Metagenomics व्यापक रूप से, मानव Microbiome 3 की पहचान सागर 4 के भीतर और यहां तक कि बैक्टीरियल समुदायों कि कॉफी मशीन 5 पर विकसित के विश्लेषण के लिए माइक्रोबियल आबादी को वर्गीकृत के रूप में आवेदन के एक नंबर के लिए इस्तेमाल किया गया है। अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों की शुरुआत में अधिक से अधिक अनुक्रमण throughput और उत्पादन में हुई। नतीजतन, डीएनए अनुक्रमण अधिक किफायती 6 बन गया है और अनुक्रमण की गहराई है कि किया जा सकता है बहुत बढ़ गया है, metagenomics सक्षम करने के लिए एक शक्तिशाली, विश्लेषणात्मक उपकरण बन गया है।

Metagenomic अनुक्रमण के व्यावहारिक, आणविक पहलू में "फ्रंट-एंड" संवर्द्धन में के विकास को प्रेरित कियासिलिको जैव सूचना विज्ञान वर्गीकरण 7-9, कार्यात्मक एनोटेशन 10,11 और डीएनए अनुक्रम डेटा के दृश्य प्रतिनिधित्व 12,13 के लिए उपलब्ध उपकरणों। उपलब्ध की बढ़ती संख्या, prokaryotic और यूकेरियोटिक 14 जीनोम अनुक्रम माइक्रोबियल समुदायों, जो सदा ही अनुक्रम जीनोम 15 के एक "वापस अंत" संदर्भ डेटाबेस के खिलाफ प्रदर्शन कर रहे हैं के वर्गीकरण में आगे सटीकता की अनुमति देता है। दो मुख्य दृष्टिकोण metagenomic विश्लेषण के लिए अपनाया जा सकता है।

अधिक परंपरागत विधि -16 rRNA जीन कोडिंग जीवाणु जीनोम के क्षेत्र का विश्लेषण है। -16 RRNA अत्यधिक अकेन्द्रिक प्रजातियों के बीच संरक्षित लेकिन नौ हाइपर-चर क्षेत्रों दर्शाती है (V1 - V9) जो प्रजातियों की पहचान 16 के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। अब अनुक्रमण का परिचय (≤ 300 बीपी बनती अंत) विशेष रूप से, दो हाइपर-चर क्षेत्रों में फैले डीएनए दृश्यों के विश्लेषण के लिए अनुमति दीवी 3 - V4 क्षेत्र 17। ऐसे ऑक्सफोर्ड nanopore 18 और 19 PacBIO के रूप में अन्य अनुक्रमण प्रौद्योगिकियों, के क्षेत्र में अग्रिम पूरे -16 rRNA जीन समीपवर्ती अनुक्रम किया जा करने की अनुमति है।

जबकि -16 rDNA आधारित पुस्तकालयों प्रजातियों की पहचान करने के लिए एक लक्षित दृष्टिकोण प्रदान करते हैं और कम प्रतिलिपि संख्या डीएनए का पता लगाने कि स्वाभाविक रूप से शुद्ध नमूने के भीतर होता है सक्षम, बन्दूक अनुक्रमण पुस्तकालयों प्रजातियों का पता लगाने कि डीएनए क्षेत्रों है कि या तो -16 से amplifiable नहीं हैं शामिल कर सकते हैं के लिए अनुमति rRNA मार्कर प्राइमर दृश्यों का इस्तेमाल किया, क्योंकि या टेम्पलेट अनुक्रम और amplifying प्राइमर अनुक्रम के बीच मतभेद भी महान 20,21 हैं। इसके अलावा, हालांकि डीएनए पीसीआर डीएनए प्रतिकृति के एक उच्च निष्ठा है, आधार त्रुटियों फिर भी पीसीआर प्रवर्धन के दौरान हो सकता है और इन त्रुटियों को शामिल किया प्रजातियों 22 होने का गलत वर्गीकरण में परिणाम कर सकते हैं। टेम्पलेट seq की पीसीआर प्रवर्धन में पूर्वाग्रहोंuences भी हो सकता है; एक उच्च जीसी सामग्री के साथ डीएनए के दृश्यों 23 और इसी तरह के थाइमिन ग्लाइकोल के रूप में अप्राकृतिक आधार संशोधनों को अंतिम amplicon पूल में प्रतिनिधित्व के तहत हो सकता है, डीएनए पीसीआर डीएनए के प्रवर्धन में विफलताओं के कारण 24 दृश्यों रोक सकते हैं। इसके विपरीत, एक बन्दूक अनुक्रमण डीएनए पुस्तकालय है कि शुद्ध डीएनए कि एक नमूना से निकाला गया है और बाद में अनुक्रमण के लिए तैयार करने से पहले कम डीएनए श्रृंखला लंबाई में खंडित के सभी का उपयोग करके तैयार किया गया है एक डीएनए पुस्तकालय है। बन्दूक अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न डीएनए दृश्यों के वर्गीकरण और अधिक सटीक जब, -16 rRNA amplicon अनुक्रमण 25 की तुलना में हालांकि वित्तीय लागत तक पहुंचने के लिए एक विश्वसनीय अनुक्रमण गहराई amplicon अनुक्रमण 26 की तुलना में अधिक है की आवश्यकता है। बन्दूक अनुक्रमण metagenomics का प्रमुख लाभ यह है कि नमूने में विभिन्न जीनोम अनुक्रम के क्षेत्रों जीन पूर्वेक्षण के लिए उपलब्ध हैं एक बार वे किया गया हैtaxonomically 27 में वर्गीकृत किया गया है।

Metagenomic अनुक्रम डेटा bioinformatic उपकरणों की एक कभी बढ़ती दूरी से विश्लेषण किया है। इन उपकरणों उदाहरण के लिए, आवेदनों की एक विस्तृत विविधता प्रदर्शन करने में सक्षम हैं, कच्चे अनुक्रम डेटा 28 की गुणवत्ता नियंत्रण विश्लेषण, बनती अंत की ओवरलैपिंग 29 पढ़ता है, नए सिरे से अनुक्रम की विधानसभा contigs और scaffolds 30,31, वर्गीकरण और दृश्य को पढ़ता अनुक्रम पढ़ता है और इकट्ठे दृश्यों 7,12,32,33 और इकट्ठे दृश्यों 34,35 के कार्यात्मक एनोटेशन की।

सिलेज, (Zea mays) इस तरह के मक्का के रूप में किण्वित अनाज से दुनिया भर में किसानों द्वारा उत्पादित, मुख्यतः पशु चारे के रूप में प्रयोग किया जाता है। सिलेज जीवाणु लैक्टोबैसिलस सपा के साथ व्यवहार किया जाता है। किण्वन 36 सहायता करने के लिए लेकिन आज तक, वहाँ सिलेज में पाया अन्य माइक्रोबियल आबादी के सीमित ज्ञान है। fermentation प्रक्रिया अवांछनीय और हानिकारक सूक्ष्म जीवों सिलेज 37 के भीतर प्रचलित होता जा रहा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। Yeasts और नए नए साँचे के अलावा, बैक्टीरिया विशेष रूप से सिलेज fermenting में anaerobic पर्यावरण के लिए अनुकूल हैं और अधिक बार सिलेज 38 की गिरावट के बजाय पशुओं में रोगों के साथ जुड़े रहे हैं। Butyric एसिड बैक्टीरिया अनजाने मिट्टी से जोड़ा जा सकता है रहता है जब सिलेज साइलो भरने और butyric एसिड, लैक्टिक एसिड, anaerobic पाचन का एक उत्पाद परिवर्तित करने के लिए, इस प्रकार सिलेज 39 का पीएच में वृद्धि कर सकते हैं। पीएच में यह वृद्धि नुक़सान बैक्टीरिया में वृद्धि है कि सामान्य रूप से इष्टतम सिलेज किण्वन की स्थिति 38 के तहत विकास को बनाए रखने में असमर्थ हो जाएगा करने के लिए नेतृत्व कर सकते हैं। क्लोस्ट्रीडियम एसपीपी। , लिस्टेरिया एसपीपी। और बेसिलस एसपीपी। , विशेष रूप से डेयरी पशु चारा के लिए सिलेज में, विशेष रूप से चिंता का विषय हैं बैक्टीरियल बीजाणुओं कि gastr बच गया है के रूप मेंointestinal पथ 40 खाद्य श्रृंखला, दुर्लभ मामलों में, पशु और मानव मौत 37,39,41-44 को दर्ज भोजन नुक़सान के लिए नेतृत्व और, कर सकते हैं। इसके अलावा, जबकि यह पशु चिकित्सा उपचार और सिलेज नुक़सान की वजह से पशुओं के नुकसान का सही आर्थिक प्रभाव का अनुमान लगाना मुश्किल है, यह अगर एक प्रकोप भी हो रहा था एक खेत के लिए हानिकारक होने की संभावना है।

यह धारणा है कि एक metagenomic दृष्टिकोण का उपयोग करके हम माइक्रोबियल आबादी है कि सिलेज नमूने में मौजूद हैं और इसके अलावा वर्गीकृत सिलेज नुक़सान के साथ जुड़े माइक्रोबियल समुदायों कि, बारी में, संभावित पशुधन पर एक हानिकारक प्रभाव होता है की पहचान, उपचारात्मक कार्रवाई को सक्षम करने के लिए हो सकता है सिलेज से पहले लिया एक खाद्य स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है।

Protocol

1. साइट स्थान

  1. इस तरह के एक खेत के रूप में एक उपयुक्त साइट से सिलेज नमूना ले लीजिए। इधर, खेत Ballydulea, कं कॉर्क, आयरलैंड (51 ° 51'58.4 "एन 8 ° 16'48.7" डब्ल्यू) में स्थित था।

2. डीएनए निष्कर्षण

नोट: डीएनए निष्कर्षण निर्माता के निर्देशों का पालन एक वाणिज्यिक किट का उपयोग किया गया था। एक नकारात्मक नियंत्रण है, जो कोई नमूना निहित, पुस्तकालय तैयारी विधि भर में इस्तेमाल किया गया था।

  1. 978 μL सोडियम फॉस्फेट बफर और 122 μL मिट्टी lysis बफर के लिए नमूना के 400 मिलीग्राम की आपूर्ति की सेल ट्यूबों में - 100 जोड़े।
  2. 6.0 m / s की गति 40 S के लिए homogenizer में सेल नलियों रखकर नमूने homogenize।
  3. 15 मिनट के लिए 14,000 XG पर और एक साफ सूक्ष्म अपकेंद्रित्र प्रोटीन वेग समाधान के 250 μL (पीपीएस) युक्त ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला सेंट्रीफ्यूज lysates। 10 बार और सेंट्रीफ्यूज inverting द्वारा समाधान मिश्रण5 मिनट के लिए 14,000 XG पर।
  4. एक साफ 15 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूब में 1 एमएल डीएनए बाध्यकारी मैट्रिक्स के लिए सतह पर तैरनेवाला जोड़ें। 3 मिनट के लिए लगातार inverting ट्यूब द्वारा समाधान मिश्रण। मिश्रण 3 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए, फिर सतह पर तैरनेवाला के 500 μL त्यागने की अनुमति दें। शेष सतह पर तैरनेवाला मिक्स।
  5. 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर एक स्पिन फिल्टर और सेंट्रीफ्यूज को निलंबन के 600 μL स्थानांतरण। छानना त्यागें और शेष निलंबन के साथ इस प्रक्रिया को दोहराएँ।
  6. स्पिन फिल्टर के भीतर डीएनए बाध्यकारी मैट्रिक्स को धोने बफर के 500 μL जोड़ें, pipetting द्वारा मिश्रण है, तो 1 मिनट के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र।
  7. छानना त्यागें और 2 मिनट सुनिश्चित करने के लिए सभी धोने बफर हटा दिया जाता है स्पिन फिल्टर फिर से 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र। 5 मिनट के लिए 23 सी में स्पिन फिल्टर सूखी।
  8. पूर्व गर्म (70 सी) DNase मुक्त पानी (डेस) और फिर से निलंबित स्पिन फिल्टर के भीतर डेस के 100 μL में डीएनए बाध्यकारी मैट्रिक्स। एक साफ 1.5 एमएल सूक्ष्म अपकेंद्रित्र Tu को स्पिन फिल्टर स्थानांतरणहो सकता है और 1 मिनट के डीएनए elute करने के लिए 14,000 XG पर अपकेंद्रित्र। -20 सी में शुद्ध डीएनए स्टोर जब तक आगे के विश्लेषण किया जाता है।

3. डीएनए शुद्धि का उपयोग डीएनए शोधन मोती

नोट: metagenomic पुस्तकालय तैयारी से पहले निकाले डीएनए शुद्धि मनकों का उपयोग कर एक शुद्ध डीएनए नमूने सुनिश्चित करने के लिए शुद्ध किया गया था प्राप्त हुई थी।

  1. उपयोग करने से पहले 30 मिनट के लिए 23 सी में मोती सेते हैं। मोतियों की 2 संस्करणों डीएनए नमूने में जोड़ें और 5 मिनट के लिए 23 सी पर समाधान सेते हैं।
  2. 5 मिनट के लिए एक अलग चुंबक पर नमूने प्लेस और फिर सतह पर तैरनेवाला त्यागें। मोती 200 μL ताजा 80% इथेनॉल (EtOH) के साथ दो बार धोएं। एयर 10 मिनट के लिए मोती सूखी।
  3. जुदाई चुंबक से नमूने निकालें और क्षालन बफर (ईबी) के 50 μL जोड़ने के लिए, pipetting द्वारा मिश्रण।
  4. 5 मिनट के लिए 23 सी पर निलंबन सेते हैं, जिसके बाद नमूने वापस 3 मिनट के लिए जुदाई चुंबक पर रखें।
  5. trसतह पर तैरनेवाला, जो डीएनए होता है एक स्वच्छ ट्यूब, ansfer। मोती त्यागें।
  6. खंड चार के अनुसार शुद्ध डीएनए यों।

4. शुद्ध डीएनए की मात्रा

नोट: शुद्ध डीएनए एक fluorometer और डबल असहाय (dsDNA) उच्च संवेदनशीलता (एचएस) परख किट निर्माता के निर्देशों का पालन का उपयोग मात्रा गया था।

  1. बफर के 1 अनुपात अभिकर्मक: एक काम समाधान 199 का उपयोग कर तैयार करें।
  2. प्रत्येक डीएनए मानक के 10 μL काम समाधान के 190 μL जोड़ें।
  3. शुद्ध डीएनए के 10 μL समाधान काम करने के 190 μL जोड़ें। अंतिम मात्रा 200 μL होना चाहिए। 2 मिनट के लिए 23 सी में मानक और डीएनए नमूने सेते हैं।
  4. ऑन-स्क्रीन निर्देशों का उपयोग कर fluorometer पर डीएनए नमूनों से पहले मानकों का विश्लेषण।

5. शॉटगन अनुक्रमण पुस्तकालय तैयारी

नोट: बन्दूक अनुक्रमण पुस्तकालय एक का उपयोग कर तैयार किया गया थावाणिज्यिक पुस्तकालय तैयारी किट निर्माता के निर्देशों का उपयोग कर।

  1. 0.2 एनजी / ईबी का उपयोग कर μL करने के लिए डीएनए नमूने पतला। कोई भी नमूना है जो इस एकाग्रता नीचे पहले से ही है, नकारात्मक नियंत्रण यानी, अपने वर्तमान एकाग्रता पर छोड़ दिया है।
  2. 10 μL के साथ शुद्ध डीएनए के मिश्रण 5 μL बफर और 5 μL एंजाइम मिश्रण। 5 मिनट के लिए 55 सेल्सियस पर नमूने सेते हैं।
  3. बफर को निष्क्रिय करने के 5 μL जोड़ें और 5 मिनट के लिए 23 सी पर समाधान सेते हैं।
  4. नमूना विशिष्ट अनुक्रमण सूचकांकों में से प्रत्येक के 5 μL और 15 पीसीआर की μL मास्टर मिश्रण जोड़ें।
  5. thermocycler में, 10 एस, 30 एस के लिए 55 सी और 30 एस के लिए 72 सी के लिए 3 मिनट, 30 एस के लिए 95 सी के लिए 72 सी पर नमूने सेते हैं, 95 सी के 12 चक्रों से पहले। 5 मिनट के लिए 72 सी पर अंत में नमूने सेते हैं।
  6. तैयार डीएनए के रूप में पहले लेकिन ईबी के 30 μL के अंतिम क्षालन साथ मनका शुद्धि का उपयोग कर शुद्ध।

6. एलibrary मात्रा और गुणवत्ता की जांच

नोट: मात्रा और तैयार पुस्तकालयों की गुणवत्ता में एक वाणिज्यिक किट और उपकरण का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया।

  1. 30 मिनट पहले का उपयोग करने के लिए 23 सी में किट घटकों को सेते हैं।
  2. 2,000 rpm पर 1 मिनट के लिए बफर और भंवर के 2 μL करने के लिए डीएनए के 2 μL जोड़ें।
  3. नमूना स्पिन यह ट्यूब के नीचे है सुनिश्चित करने के लिए।
  4. साधन में नमूना ट्यूबों, विश्लेषण टेप और सुझावों को सम्मिलित करें, और के रूप में सॉफ्टवेयर द्वारा निर्देशित विश्लेषण करते हैं।

7. डीएनए अनुक्रमण

  1. एक अनुक्रमण सेवा और दृश्य करने के लिए तैयार है और मात्रा निर्धारित डीएनए अनुक्रमण पुस्तकालयों नमूने 300 बीपी बनती अंत अनुक्रमण 45 का उपयोग कर स्थानांतरण।

8. कच्चे अनुक्रम डेटा का विश्लेषण

नोट: एक लिनक्स ऑपरेटिंग सिस्टम का उपयोग कर प्रत्येक कार्यक्रम के लिए आदेश प्रोटोकॉल कदम नीचे दिखाई जाती हैं। एस के लिए इस्तेमाल किया पाइपलाइनequence डेटा विश्लेषण चित्र 1 में दिखाया गया है। कार्यक्रम उपयोगकर्ता विश्लेषण करने से पहले से स्थापित करने के लिए कर रहे हैं। यह प्रक्रिया प्रत्येक नमूना के लिए व्यक्तिगत रूप से किया जाना चाहिए।

  1. विश्लेषण और कमांड लाइन / पथ-टु-फाइल / fastqc करने में टाइप करके FastQC 46 का उपयोग डीएनए अनुक्रम डेटा कल्पना, आगे से पीछा किया और रिवर्स कच्चे raw_read1.fastq raw_read2.fastq पढ़ता है।
  2. -o output_fastqc और च fastq द्वारा कच्चे पढ़ें फ़ाइलों के प्रारूप फ़ाइल टाइप करके एक आउटपुट फ़ोल्डर निर्दिष्ट करें।
  3. आउटपुट फ़ाइल (चित्रा 2) देखें।
    पथ-टु-फाइल / fastqc raw_read1.fastq raw_read2.fastq -o output_directory च fastq।

9. गुणवत्ता नियंत्रण ट्रिमिंग और छनन अनुक्रम डेटा

  1. कमांड लाइन जावा जार / पथ-टु-फाइल / trimmomatic-0.35.jar में टाइप करके trimming कार्यक्रम, Trimmomatic 28 चलाएँ।
  2. निर्दिष्ट फ़ाइलों 'पीई' टाइप करके अंत फ़ाइलों रखा जाता है। राज्य कि 16 केंद्रीय जनसंपर्कocessing यूनिट (सीपीयू) -threads 16 टाइप करके इस कार्यक्रम के द्वारा किया जाना चाहिए।
  3. कच्चे आगे का नाम लिखकर क्यूसी की जांच के लिए दो फ़ाइलों की सूची और रिवर्स पढ़ता है। आउटपुट फाइल के उपसर्ग -baseout सिलेज टाइप करके निर्धारित किया जाता है।
  4. ILLUMINACLIP टाइप करके कार्यक्रम के लिए विकल्पों को परिभाषित: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 प्रमुख: 3 अनुगामी: 3 SLIDINGWINDOW: 4: 20: फसल: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36।
  5. एक बार जब पूरा, पहले के रूप में उपयोग करते हुए FastQC छंटनी दृश्यों का विश्लेषण और trimming सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया गया है सुनिश्चित करने के लिए कच्चे अनुक्रम आंकड़ों के उत्पादन की तुलना करें।
    नोट: सॉफ्टवेयर उपकरण, Trimmomatic, छंटनी की अग्रणी कम गुणवत्ता या एन ठिकानों को हटाने के द्वारा आगे पढ़ता (नीचे गुणवत्ता 3), कम गुणवत्ता या एन ठिकानों अनुगामी हटाने (नीचे गुणवत्ता 3) और प्रत्येक एक 4-आधार विस्तृत रपट खिड़की के साथ पढ़ने के लिए स्कैनिंग। मानकों को काटने जब आधार प्रति औसत गुणवत्ता 20 से नीचे चला जाता है और फिर किसी भी नीचे 36 ठिकानों लंबे पढ़ता ड्रॉप करने के लिए निर्धारित किया गया। अंत में, 15 ठिकानों मंगलवार फसली थेओम प्रत्येक के सिर पढ़ा और पढ़ता पढ़ें की शुरुआत से 200 ठिकानों को रखने के लिए फसली थे। यह अंतिम कदम जब लंबे अनुक्रमण कुछ गुणवत्ता के मुद्दों पर काबू पाने के लिए प्रदर्शन किया था (> 200 बीपी) पढ़ता है। ये विशिष्ट नमूने 28 के लिए समायोजित किया जा सकता है।
    जावा जार /path-to-file/trimmomatic-0.35.jar पीई -threads 16 raw_read1.fastq raw_read2.fastq -baseout सिलेज ILLUMINACLIP: NexteraPE-PE.fa: 2: 30: 10 प्रमुख: 3 अनुगामी: 3 SLIDINGWINDOW: 4 : 20 फसल: 200 HEADCROP: 15 MINLEN: 36

10 Metagenome विधानसभा

  1. मर्ज unpaired, छंटनी unpaired पढ़ता के द्वारा पीछा बिल्ली टाइप करके पढ़ता है; silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq। टाइप करके एक नई फ़ाइल के लिए फाइल को लिखें> silage_merged_unpaired.fastq
    बिल्ली silage_read1_unpaired.fastq silage_read2_unpaired.fastq> silage_merged_unpaired.fastq
  2. नए सिरे से इकट्ठा करने के लिए अनुक्रम डीएनए, टंकण / पथ करने से हुकुम (सेंट पीटर्सबर्ग जीनोम कोडांतरक) 30 उपयोग-file / spades.py। निर्दिष्ट करें कि 16 सीपीयू 16 आयकर टाइप करके और उस metagenomic पैरामीटर का उपयोग किया जा करने के लिए --meta टाइप करके करना चाहिए लागू कर रहे हैं।
  3. आगे छंटनी पहचानें का उपयोग कर -1 silage_read1_paired.fastq पढ़ता है और रिवर्स -2 silage_read2_paired.fastq से पढ़ता है। विलय unpaired पढ़ता -s silage_merged_unpaired.fastq द्वारा निर्दिष्ट कर रहे हैं।
  4. silage_spades -o टाइप करके उत्पादन फ़ोल्डर को परिभाषित करें।
    पथ-टु-फाइल / spades.py -t 16 --meta -1 silage_read1_paired.fastq -2 silage_read2_paired.fastq -s silage_merged_unpaired.fastq -o silage_spades

11. बनती अंत पढ़ें ओवरलैप

  1. मर्ज डीएनए अनुक्रम के जोड़े फ्लैश (लघु फास्ट लंबाई समायोजन पढ़ता है) 29 का उपयोग कर पढ़ता में कमांड लाइन / पथ के लिए फ़ाइल / फ्लैश टाइप करके। निर्दिष्ट करें कि 16 सीपीयू सिलेज -o टाइप करके 16 और उत्पादन उपसर्ग आयकर का उपयोग करके किया जाना चाहिए।
  2. छंटनी पहचानें silage_trimmed_R1.fastq silage_trimmed_R2.fastq टाइप करके पढ़ता
    पथ के लिए फ़ाइल / फ्लैश -t 16 -o silage_read1_paired.fastq silage_read2_paired.fastq लगीं

12. वर्गीकरण

  1. प्रकार / पथ-टु-फाइल / Kraken और / पथ-टु-फाइल / मानक --db टाइप करके डेटाबेस निर्दिष्ट करें।
  2. परिभाषित करें कि 16 सीपीयू --threads 16 टाइप करके इस्तेमाल किया जाना चाहिए और FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt --output का उपयोग करके एक आउटपुट फ़ोल्डर की पहचान। इनपुट फ़ाइल नाम टाइप करें; FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    पथ-टु-फाइल / Kraken --db मानक --धागा 16 --output FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt FLASHed_silage.extendedFrags.fastq
    नोट: इकट्ठे डीएनए अनुक्रम Kraken 7 का उपयोग scaffolds के वर्गीकरण सबसे हाल ही में, मानक Kraken डेटाबेस है कि सभी उपलब्ध अकेन्द्रिक जीनोम अनुक्रम निहित के खिलाफ पूरा किया गया।
  3. स्थानांतरण कॉलम 2 और 3 आउटपुट फ़ाइल से और कटौती टाइप करके -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int एक नई फ़ाइल के लिए
    4. कटौती -f2,3 FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.txt> FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int
  4. KtImportTaxonomy टाइप करके क्रोना 12 में नई फ़ाइल आयात करें। FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int टाइप करके इनपुट फ़ाइल निर्दिष्ट करें। FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html -o टाइप करके आउटपुट फ़ाइल को पहचानें।
    पथ-टु-फाइल / ktImportTaxonomy FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.int -o FLASHed_silage_extendedFrags_kraken.out.html

13. कार्यात्मक एनोटेशन

  1. एमजी RAST 47 वेबसाइट, http://metagenomics.anl.gov/ पर जाएं। एक नया उपयोगकर्ता के रूप में पंजीकरण अगर जरूरी है। में प्रवेश करने के बाद, "अपलोड" बटन पर क्लिक करें। चरण 10 से इकट्ठे scaffolds शब्द।
  2. एक बार फाइल अपलोड कर दिया है, पर "भेजें" और निर्देशों का पालन करें क्लिक करें और विश्लेषण के पूरा होने का इंतजार है।
  3. बाद विश्लेषण पूरा हो गया है, लिंक उन्हें देखने के माध्यम से भेजाबीमार एमजी RAST से, या वैकल्पिक रूप से, "प्रगति" पर क्लिक करें। वहाँ पूरा नौकरियों की एक सूची है। प्रासंगिक नौकरी आईडी पर और फिर "डाउनलोड पृष्ठ" के लिए लिंक पर क्लिक करें।
  4. डाउनलोड पृष्ठ पर, शीर्षक "प्रोटीन क्लस्टरिंग 90%" के अंतर्गत, भविष्यवाणी प्रोटीन फ़ाइल, 550.cluster.aa90.faa डाउनलोड करने के लिए प्रोटीन बटन पर क्लिक करें।
  5. प्रोटीन के रूप में कथित एक विशेष एंजाइम cazy वर्ग से संबंधित वर्गीकृत करने के लिए, cazy डेटाबेस से 48 डाउनलोड प्रोटीन की तुलना करें। डाउनलोड कार्बोहाइड्रेट सक्रिय एंजाइमों डाटाबेस (cazy) फाइलों से कर रहे हैं: AA.zip, CE.zip, GH.zip, GT.zip और PL.zip। इन फ़ाइलों को क्रमश: निम्न वर्गों का प्रतिनिधित्व एंजाइम: सहायक क्रियाएँ (एए), कार्बोहाइड्रेट esterases (सीई), ग्लाइकोसाइड हाइड्रोलिसिस (जीएच), Glycosyl transferases (जीटी) और polysaccharide लाइसेस (पीएल)।
  6. डेटाबेस फ़ाइलों को खोलना और cazy डेटाबेस USEARCH UBLAST algor का उपयोग कर प्रोटीन के लिए प्रोटीन समानता का निर्धारण करके प्रोटीन व्याख्याithm 49। 5 डेटाबेस .txt फ़ाइलें प्रकार के माध्यम से पुनरावृति करने के लिए (* .txt में मैं के लिए) एक पार्टी की योजना बनाई पाश का उपयोग करने के लिए "मैं के लिए * .txt में; करते हैं"।
  7. आदेश ublast कलन विधि का उपयोग करने में टाइप / पथ-टु-फाइल / पैरामीटर -ublast साथ usearch8 द्वारा USEARCH चलाएँ। तब प्रोटीन अनुक्रम एमजी RAST, "mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa" से डाउनलोड की गई फ़ाइल का नाम लिखें।
  8. डेटाबेस फ़ाइल को इंगित करने के प्रकार "-db $ मैं" और ई-मूल्य सीमा 1e -5 में निर्दिष्ट करने के लिए, प्रकार "-evalue 1e-5" में इस्तेमाल किया जाएगा।
  9. एक लक्ष्य अनुक्रम की खोज के बाद खोज को समाप्त करने के लिए और इसलिए लक्ष्य एंजाइम वर्ग, जैसे जी एच, प्रकार "-masaccepts 1" करने के लिए संबंधित के रूप में है कि प्रोटीन अनुक्रम को वर्गीकृत।
  10. परिभाषित करने के लिए है कि 16 सीपीयू प्रकार इस्तेमाल किया जाना चाहिए "16 -threads" और atab-अलग पाठ प्रकार "-blast6out" के रूप में आउटपुट फ़ाइल का स्वरूप निर्दिष्ट करने के लिए। आउटपुट फ़ाइल प्रकार "$ i.ublast" की पहचान करने के लिए। पार्टी की योजना बनाई लूप को समाप्त करने, टीype "; किया"
    के लिए * .txt में मैं;
    ऐसा / पथ-टु-फाइल / usearch8 -ublast ../mgmXXXXXX.3.550.cluster.aa90.faa -db $ मैं -evalue 1e-5 -maxaccepts 1 -threads 16 $ i.ublast -blast6out;
    किया हुआ

14. Visualizing cazy एनोटेशन

  1. प्रत्येक एंजाइम एक पार्टी की योजना बनाई पाश का उपयोग वर्ग के लिए एक वेन आरेख के रूप में cazy एनोटेशन से उत्पादन कल्पना, प्रोटीन आईडी सूचियों उत्पन्न करते हैं। "* .ublast में मैं के लिए, क्या" टाइप करें।
  2. आउटपुट फ़ाइल से और एक नई फाइल करने के लिए स्तंभ 1 हस्तांतरण करने के लिए लिखें "बिल्ली $ मैं | कटौती च> 1 $ i.list"।
  3. पाश और प्रकार बर्खास्त "; किया"।
  4. एक पाठ संपादक में .list फ़ाइलें खोलें। , वेबसाइट पर जाएं 5 के रूप में सेट की संख्या का चयन करें और एक अलग बॉक्स में प्रत्येक सूची फाइल की सामग्री चस्पा करें। डाउनलोड एक .SVG फ़ाइल के रूप में जिसके परिणामस्वरूप आरेख।
    मैं * .ublast में;
    बिल्ली $ मैं क्या | कटौती च> 1 $ i.list;
    किया हुआ

Representative Results

Bioinformatic प्रसंस्करण करने से पहले, कच्चे अनुक्रम छंटनी थे पढ़ता है और एडेप्टर Trimmomatic सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 28 हटा दिया गया। Trimming और छानने के कदम के बाद, के पढ़ता अनुक्रम के 50% तक कम हो गया था संख्या में पढ़ता है (तालिका 1)। औसत आधार फ़्रेड स्कोर> 30 गुणवत्ता नियंत्रण के बाद किया गया (चित्रा 2)।

डीएनए दृश्यों के जोड़े जो था अतिव्यापी क्षेत्रों फ्लैश सॉफ्टवेयर का उपयोग कर 29 एकल अब पढ़ता उत्पन्न करने के लिए विलय कर दिया गया, गैर अतिव्यापी एक अलग फाइल में रखा गया था पढ़ता है। 45.47% पढ़ता (105343) को सफलतापूर्वक संयुक्त। की ओवरलैपिंग के बाद फ्लैश का उपयोग पढ़ता की, जिसके परिणामस्वरूप बढ़ाया टुकड़े बैक्टीरियल वर्गीकरण कराना पड़ा Kraken सॉफ्टवेयर 7 का उपयोग कर और बाद में क्रोना सॉफ्टवेयर (चित्रा 3) के साथ कल्पना थे पढ़ता है।

चित्रा 4 में देखा जा सकता है। Metagenome में सबसे प्रचुर मात्रा में प्रजातियों लैक्टोबैसिलस एसपीपी थे। (24%; Firmicutes), Corynebacterium एसपीपी। (8%; Actinobacteria), Propionibacterium एसपीपी। (3%; Actinobacteria) और Prevotella एसपीपी। (3%; Bacteroidetes)। पशुओं के स्वास्थ्य के लिए महत्वपूर्ण है और प्रजाति रोग में फंसा भी मनाया गया; क्लोस्ट्रीडियम एसपीपी। (1%) बेसिलस एसपीपी। (0.6%), लिस्टेरिया एसपीपी। (0.2%) सिलेज नमूने में मौजूद होने की भविष्यवाणी कर रहे थे।

कार्यात्मक एनोटेशन पर इकट्ठे पढ़ता प्रदर्शन किया गया था। Metagenome हुकुम कोडांतरक 30 का उपयोग छंटनी और फ़िल्टर का उपयोग कर इकट्ठा किया गया थाबनती अंत और unpaired 92284 scaffolds पैदा पढ़ता है। आदेश cellulases की पहचान करने के लिए, प्रोटीन एमजी RAST का उपयोग करते हुए भविष्यवाणी की है और कार्बोहाइड्रेट सक्रिय एंजाइमों डाटाबेस (cazy) का उपयोग एनोटेट कर रहे थे। 97,562 की भविष्यवाणी की प्रोटीन का, 6357 को cazy डेटाबेस (चित्रा 5) को बनाने के पांच एंजाइमों वर्गों में से एक में एक ख्यात कार्बोहाइड्रेट सक्रिय एंजाइम के रूप में एनोटेट कर रहे थे। परिणाम InteractiVenn सॉफ्टवेयर 50 से अधिक cazy एंजाइम वर्ग एनोटेशन युक्त उन सहित प्रोटीन एनोटेशन का वितरण दिखा उपयोग कर एक वेन आरेख के रूप में कल्पना थे। इनमें से 3861 ग्लाइकोसाइड hydrolase गतिविधि है भविष्यवाणी की थी और आगे समारोह पुष्टि करने के लिए प्रयोगशाला में विशेषता होगी।

आकृति 1
चित्रा 1: सिलेज के विश्लेषण के लिए डीएनए metagenomics पाइपलाइन। दो मुख्य दृष्टिकोण थेसिलेज, वर्गीकरण और कार्यात्मक एनोटेशन के Microbiome जांच करने के लिए इस्तेमाल किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रति आधार पहले और ट्रिमिंग और एडाप्टर हटाने के बाद अनुक्रम गुणवत्ता। FASTQC से प्रति-आधार अनुक्रम गुणवत्ता साजिश से पता चलता अनुक्रम की लंबाई भर में औसत फ़्रेड स्कोर से पहले और बाद के गुणवत्ता नियंत्रण पढ़ता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: वर्गीकरण Classificaठोस सिलेज की बैक्टीरियल Microbiome की tion। छंटनी और अतिव्यापी अनुक्रम का वर्गीकरण पढ़ता फ्लैश से Kraken 7 उपयोग किया गया था और बाद में क्रोना के साथ कल्पना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: 4 ठोस सिलेज की बैक्टीरियल Microbiome में सबसे प्रचुर मात्रा संघों का वर्गीकरण कक्षा वितरण। चार सबसे प्रचुर मात्रा में संघों के भीतर बैक्टीरिया के प्रत्येक वर्ग का प्रतिशत। Firmicutes: clostridia (लाल) और बेसिली (गहरे नीले रंग); Proteobacteria: डेल्टा / एप्सिलॉन (गुलाबी), अल्फा (पीला नीला), गामा (नारंगी) और बीटा (फ़िरोज़ा); Bacteroidetes: Flavobacteriia (गहरे नीले) और Bacteroidia(हल्का हरा); Actinobacteria: Coriobacteriia (गहरे बैंगनी) और अन्य Actinobacteria (गहरे हरे रंग)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: ठोस सिलेज Microbiome में भविष्यवाणी की proteome के cazy एनोटेशन। ठोस सिलेज Microbiome की भविष्यवाणी की proteome में cazy एनोटेशन के पांच एंजाइम कक्षाओं का वितरण दिखा वेन आरेख। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

# कच्चे पढ़ता # छानने पढ़ता (बनती) # छानने पढ़ता # लगीं पढ़ता
(बनती) (Unpaired)
2,374,949 X2 231679 X2 1892534 105,343

तालिका 1: अनुक्रमण का सारांश तालिका पढ़ता है।

Discussion

सिलिको विश्लेषण में एक माइक्रोबियल समुदायों कि पर्यावरण के नमूनों के भीतर मौजूद हैं के लिए एक उत्कृष्ट अंतर्दृष्टि दे सकते हैं, यह महत्वपूर्ण है कि वर्गीकरण वर्गीकरण का प्रदर्शन किया प्रासंगिक नियंत्रण के साथ सहयोग में और उस अनुक्रमण का एक उपयुक्त गहराई पूरे कब्जा करने के लिए हासिल किया गया प्रदर्शन किया जनसंख्या वर्तमान 51।

किसी भी कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के साथ, वहाँ एक समान लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए कई रास्ते हैं। तरीकों कि हम इस अध्ययन में इस्तेमाल किया है उपयुक्त और सरल तरीकों, कि एक साथ लाया गया है सिलेज Microbiome पर विश्लेषण की एक सीमा प्राप्त करने के लिए के उदाहरण हैं। एक विविधता और जैव सूचना विज्ञान उपकरणों और तकनीकों के एक बढ़ती संख्या के उदाहरण Phylosift 8 और MetaPhlAn2 52 के लिए, metagenomic डेटा का विश्लेषण करने के लिए उपलब्ध हैं, और इन नमूना करने के लिए उनकी प्रासंगिकता के लिए जांच और विश्लेषण अनुरोध करने से पहले मूल्यांकन किया जाना चाहिए53 uired। Metagenomic विश्लेषण के तरीकों वर्गीकरण, अनुक्रमण गहराई और अनुक्रमण की गुणवत्ता के लिए उपलब्ध के लिए डेटाबेस के द्वारा सीमित हैं।

bioinformatic यहां प्रदर्शन प्रसंस्करण के लिए एक स्थानीय, उच्च स्तरीय मशीन पर प्रदर्शन किया गया था; हालांकि क्लाउड-आधारित सिस्टम भी उपलब्ध हैं। ये क्लाउड-आधारित सेवाओं के लिए एक उपयुक्त शक्तिशाली स्थानीय कार्य केंद्र की उच्च लागत निवेश के लिए बिना आवश्यक कम्प्यूटेशनल शक्ति के किराये के लिए अनुमति देते हैं। इस पद्धति का एक संभावित आवेदन कृषि के क्षेत्र में इसके उपयोग से पहले सिलेज आकलन करने के लिए सुनिश्चित करें कि कोई हानिकारक बैक्टीरिया इसलिए उन्हें खाद्य श्रृंखला में प्रवेश करने से रोकने मौजूद हैं होगा।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FastDNA SPIN Kit for Soil MP Bio 116560200 DNA Extraction
DNA FastPrep MP Bio 116004500 DNA Extraction
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63880 DNA Purification
Elution Buffer Qiagen 19806 DNA Purification
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 DNA Quantification
Qubit dsDNA HS Assay Kit Thermo Fisher Q32854 DNA Quantification
Nextera XT DNA Library Prep Kit Illumina FC-131-1024 Library Preparation
Nextera XT Index Kit Illumina FC-131-1001 Library Preparation
TapeStation 2200 Agilent G2964AA DNA Quantification
HS D100 ScreenTape Agilent 5067-5584 DNA Quantification
HS D100 ScreenTape Reagents Agilent 5067-5585 DNA Quantification
TapeStation Tips Agilent 5067-5153 DNA Quantification
TapeStation Tubes Agilent 401428 and 401425 DNA Quantification
HiSeq 2500 Illumina DNA Sequencing - provided by a sequencing service
High Power Analysis Workstation Various Local or cloud based, user preferred system

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आनुवंशिकी अंक 119 metagenomics डीएनए अनुक्रमण बन्दूक अनुक्रमण जैव सूचना विज्ञान सिलेज रोग पशुधन
सिलेज की Metagenomic विश्लेषण
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Tennant, R. K., Sambles, C. M.,… More

Tennant, R. K., Sambles, C. M., Diffey, G. E., Moore, K. A., Love, J. Metagenomic Analysis of Silage. J. Vis. Exp. (119), e54936, doi:10.3791/54936 (2017).

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