Abstract
We presenteren twee minimaal invasieve microchirurgische technieken bij knaagdieren voor specifieke geneesmiddelafgifte in het middenoor zodat het binnenoor kan bereiken. De eerste procedure bestaat uit perforatie van het trommelvlies bulla, genaamd bullostomy; de tweede is een transtympanic injectie. Beide emuleren menselijke klinische intratympanic procedures.
Chitosan-glycerofosfaat (CGP) en Ringer's lactaatbuffer (RL) werden als biocompatibele voertuigen voor lokale geneesmiddelafgifte. CGP is een niet-toxisch bioafbreekbaar polymeer schaal gebruikt in farmaceutische toepassingen. Het is een viskeuze vloeistof bij kamertemperatuur maar stolt aan gemengde vaste fase bij lichaamstemperatuur. RL is een isotonische oplossing voor intraveneuze toediening bij mensen. Een klein volume van het voertuig juist op het ronde venster (RW) niche geschreven door middel van een bullostomy. Een transtympanic injectie vult het middenoor en laat minder controle maar ruimere toegang tot het binnenoor.
Beide procedures zijn geschikt als geneesmiddelafgiftesystemen methoden in de muis middenoor, maar transtympanic injectie bleek minder invasief worden vergeleken met bullostomy.
Introduction
Slechthorendheid is de meest voorkomende menselijke sensorische tekort en treft 5,3% van de wereldwijde bevolking, en 30% van de personen ouder dan 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , bijgewerkt 2016). Gehoorverlies beïnvloedt taalverwerving bij kinderen en versnelt cognitieve achteruitgang bij oudere mensen. Daarom is het een belangrijke gezondheidszorg probleem met een enorme socio-economische impact. Het kan worden veroorzaakt door genetische afwijkingen, omgevingsfactoren of een combinatie van beide 1, die uiteindelijk schade en dood van neuronen en haarcellen in het slakkenhuis induceren. Deze cellen niet regenereren bij zoogdieren, dus cellulaire verlies en daarmee gepaard gaande gehoorverlies kan niet worden teruggedraaid. Klinische opties zijn gebaseerd op protheses, zoals gehoorapparaten en cochleaire, middenoor en beengeleiding implantaten 2. Helaas zijn er geen specifieke medische herstellende Treatments voor slechthorendheid en dus verschillende onderzoekslijnen zijn gericht op de ontwikkeling van preventieve en herstellende therapieën. Nieuwe therapeutische opties omvatten gentherapie, celtherapie, alsook de ontwikkeling van kleine moleculen voor farmacologische therapie 2.
Een van de belangrijkste uitdagingen in cochleaire farmacologische therapie is drug delivery. Systemische behandelingen beperkt werkzaam in de cochlea door de bloed-labyrint barrière 3 continu endotheel in contact met cochleaire bloedvaten, die fungeert als een fysieke en biochemische barrière voor binnenoor vloeistof homeostase derhalve beperkt geneesmiddel doorgang naar het binnenoor. Het doorlaatbaar slechts kleine oplosbare moleculen, hoewel permeabiliteit tijdens cochleaire ontsteking kan worden verhoogd, en ook met het gebruik van diuretica of osmotische middelen. De hoeveelheid geneesmiddel die uiteindelijk de cochlea na systemische toediening wordt verminderd bereikt;Daarom, hoge doses dat biologische toxiciteit kunnen veroorzaken zijn vereist. Bovendien kan levermetabolisme van het geneesmiddel toxische of inactieve metabolieten 4, 5, 6, 7 produceren. Daarentegen lokale interventies kan de plaatsing van een bekende beperkte hoeveelheid van het geneesmiddel in het midden of binnenoor zonder ongewenste bijwerkingen 4, 7, 8, 9. In de huidige klinische praktijk worden intratympanic toedieningen beperkt tot bepaalde cochleaire pathologieën, zoals gentamicine in de ziekte van Menière 10, corticosteroïden plotselinge doofheid, ziekte van Meniere, immuungemedieerde en gehoorverlies door lawaai, 11, 12, 13, 14, 15 en insuline-achtige groeifactor 1 (IGF1) in plotselinge doofheid 4, 16, 17.
Formuleringen voor lokaal bestuur moet de delicate homeostase (pH en osmolariteit) van cochleaire vloeistoffen te behouden. Bovendien is het zeer belangrijk om de steriliteit te handhaven tijdens het gehele proces om bacteriële besmetting van de cerebrospinale vloeistof voorkomen. De hulpstof wordt gebruikt voor drug delivery moet biocompatibel, nonototoxic en van de juiste consistentie. Vloeibare oplossingen worden aanbevolen voor intracochlear injecties, maar zijn niet geschikt voor de intratympanic route door de vereffening via de buis van Eustachius. In dit geval worden gewoonlijk gedragen door drugs halfvaste gels om hun duurzaamheid in het middenoor 4, 18, 19 te verhogen. Alternatief levering systems die dragers voor de doorgang van het geneesmiddel te verhogen tot het binnenoor zijn nanodeeltjes 20 en 21 adenovirussen hier vergeleken we twee voertuigen: CGP en RL een oplossing. CGP is een hydrogel gevormd door chitosan, een lineaire polysaccharide bestaande uit D-glucosamine en N-acetyl-D-glucosamine verkregen uit schalen van schaaldieren en β-glycerofosfaat, een polyol die een schild van water vormt rond de chitosanketens en houdt deze in vloeibare vorm. CGP is warmtegevoelig en kan worden afgebroken door lysozymen waardoor een aanhoudende geneesmiddelafgifte in het middenoor 22, 23, 24, 25. Chitosan-base hydrogelen geschikte vectoren voor klinische toepassingen zoals geneesmiddelafgifte vanwege hun gebrek aan immunogeniciteit en gebrek aan activering van lokale ontstekingsreacties 23, 24. Op de OTHER kant RL buffer een pyrogeenvrije isotone oplossing (273 mOsm / l en pH 6,5) bestemd voor toediening in mensen als een bron van water en elektrolyten, vooral in bloedverlies, trauma of brandwonden omdat de bijproducten van lactaatmetabolisme in de lever tegen acidose.
Hier beschrijven we en vergelijking van twee chirurgische methoden die zijn verbeterd voor lokale medicijnafgifte om de muis binnenoor. Het veiligheidsprofiel van beide technieken werd geëvalueerd met behulp van functionele, morfologische en moleculaire tests. Gehoord werd geëvalueerd middels BAER-test (ABR) 26, 27 uitgevoerd voor en na microchirurgie op verschillende tijdstippen. Eindpunt procedures werden gebruikt om de cochlea ontleden en vergelijk de anatomische, cellulaire en moleculaire effect van beide microchirurgische procedures.
Protocol
Zorg ervoor dat de procedures dier handling zijn in overeenstemming met de internationale en nationale regelgeving. Het protocol volgt de Europese Gemeenschap 2010/63 / EU en de Spaanse RD 53/2013 richtlijnen, respectievelijk.
1. Algemeen Animal Handling
- Feed muizen ad libitum met een standaard dieet en het drinken van water. gezondheidsinspectie en welzijn door het volgen van Federatie voor Proefdierkunde Associations (FELASA) aanbevelingen.
2. Hoorzitting Assessment
OPMERKING: Spoor functionele gevolgen van microchirurgische procedures testen gehoor voor en vaak na operatie (in dit werk 2, 7, 14 en 28 d postmicrosurgery) met niet-invasieve procedures, zoals ABR 9.
- ABR testen verdoven muizen met korte werkingsduur protocollen dwz intraperitoneale injectie van ketamine (100 mg / kg lichaamsgewicht (BW) en xylazine (10mg / kg BW). Als alternatief, het uitvoeren van het gehoor testen onder inhalatie-anesthesie.
OPMERKING: Omdat ABR parameters kunnen worden beïnvloed door verdoving protocol 28, gebruiken de zelfde gedurende het experiment. - Controleer de diepte van de anesthesie door het testen van de teen-snuifje reflex.
OPMERKING: Wanneer de terugtrekking reflex verdwijnt, heeft het dier een geschikte diepte van anesthesie bereikt auditieve testen uit te voeren. - Bescherm de ogen tegen uitdroging en secundaire keratoconjunctivitis sicca door lokale toediening van traan supplementen, zoals hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gels.
- Houd de muis bij fysiologische temperatuur (37,5-38 ° C) gedurende de gehele procedure. Om elektrische interferentie te voorkomen, gebruikt u een warm water pomp en verwarming pads. Bewaaklichaam temperatuur rectale sondes. Wees altijd voorzichtig het dier niet oververhit raken.
LET OP: Wij adviseren het schoonmaken van de verwarming pad met een oppervlakte desinfectiemiddel tussen muizen.0; Voor de anesthesie inductie en herstel, elektrische verwarming pads, gloeilampen of infrarood licht kan worden gebruikt. - ABR procedure
LET OP: Voor ABR registratie, gebruik maken van een computer werkstation met een inboard geluidskaart golfvormen te maken (digitaal naar analoog, DA output, conversie) en elektrische reactie golfvormen digitaliseren (analoog naar digitaal, AD-ingang), een demper, een oscilloscoop en een lage impedantie versterker. Modern auditieve werkstations (dwz Tucker Davis Techonologies) omvat al deze componenten in één compact systeem.- Plaats de verdoofde muis in buikligging de verwarming pads in een geluiddempende kamer naar omgevingsgeluid interferentie en nagalm (figuur 1) te vermijden.
- Lever akoestische stimuli in de uitwendige gehoorgang. Gebruik vooraf ingestelde stimuli of nieuwe signalen ontworpen met de juiste software. Sluit de DA-werkstation output naar de geselecteerde luidspreker.
LET OP: Free-veld of gesloten veld luidsprekers in de uitwendige gehoorgang ingebracht kan worden gebruikt. Eerstgenoemde hebben de voorkeur bij het werken met muizen vanwege de moeilijkheid opnemers en insertie van het geluid in gesloten systemen. Vrij veld speakers stimuleren beide oren en wekken een binaural reactie. Overwegend mono reacties met vrije veld speakers te verkrijgen, contralaterale activiteit moet worden geëlimineerd door occlusie (dwz met oordopjes) of door het maskeren van het lawaai.- Plaats lege veld spreker op een vaste afstand (gewoonlijk 5-20 cm) naar het hoofd of oor gekozen met het midden van de luidspreker uitgelijnd met de uitwendige gehoorgang. Zorg ervoor dat er geen obstakels zijn tussen de spreker en het oor en de oorschelp wordt volledig geopend.
- Plaats roestvrijstalen subdermale naald elektroden als volgt: i) de actieve (positieve) elektrode in de hoofdhuid tussen de oren (over de top van de schedel), ii) de referentie (negatieve) elektrode in de parotisgebied onder de oorschelp en iii) de aardelektrode in de rug, staart of achterpoot regio (Figuur 1).
- Controleer de elektrische impedantie in de positieve en negatieve elektroden. Zorg ervoor dat de impedantie is minder dan 3 kOhm (idealiter 1 kOhm). Als deze hoger is, verplaatsen, schoon met alcohol of vervang de elektroden.
- ABR opnemen genereren breedband klikken en zuivere toonfrequenties en aanwezig bij afnemende intensiteiten 90-10 dB ten opzichte van het geluidsdrukniveau (SPL) 5-10 dB SPL stappen 27, 29, 30.
- Present korte klik of toon burst stimuli (1-5 ms) beginnen met een hoog niveau (dat wil zeggen 80 of 90 dB SPL) en het verminderen van de intensiteit van 5-10 dB SPL stappen. Registreer de elektrische respons in de eerste 10 ms na de stimulatie (ABR opgewekte responsen verschijnen 6-8 ms).
OPMERKING: Om deze reden, stimulatie tarievenmag niet hoger zijn dan 50 stimuli / s (normaal tarief 20-50).
- Present korte klik of toon burst stimuli (1-5 ms) beginnen met een hoog niveau (dat wil zeggen 80 of 90 dB SPL) en het verminderen van de intensiteit van 5-10 dB SPL stappen. Registreer de elektrische respons in de eerste 10 ms na de stimulatie (ABR opgewekte responsen verschijnen 6-8 ms).
- Versterken, opnemen en het gemiddelde van de opgewekte elektrische reactie op elke stimulus en intensiteit. Gebruik een versterker met weinig ruis en een goede signaal-ruisverhouding, en sluit deze aan op de AD-ingang.
OPMERKING: ABR zeer lage amplitude, meestal onder 1 mV (piek-piek) en moeten worden geregistreerd met een versterker met een zeer laag geluidsniveau. In een normaal gehoor muizen, duidelijk ABR golven ontstaan na middeling 100-200 reacties, maar van hoge kwaliteit opnames te verkrijgen, of in het geval van slechthorendheid, meer herhalingen aanbevolen (750-1000) 27. - Visueel de ABR drempel tijdens de test te bepalen.
OPMERKING: De ABR drempelwaarde tarieven geluidsstimuli intensiteit die een betrouwbare ABR uitlokt opname met golven I tot IV duidelijk zichtbaar en middelgrote piek-piekspanning 2 SD boven de gemiddelde achtergrondactiviteit 31. Deze gegevens worden bevestigd during off-line analyse, samen met andere parameters zoals piek- en interpeak latency, en golf amplitudes. - Voer data-analyse handmatig of automatisch.
- Voor handmatige analyse, het identificeren van de 4-5 ABR golven (I, II, III, ... enz.) En teken de pieken (P1, P2, P3 ...) en dalen (N1, N2, N3, ...) voor elke golf. Zodra de analyse is voltooid, gegevens exporteren naar spreadsheet of tekstbestand.
LET OP: Specifieke software voor elektrische respons opname voert meestal de analyse automatisch. Aanvullende metingen kunnen worden bepaald in het ABR opname in reactie op een bepaalde intensiteit (bijvoorbeeld 70 of 80 dB SPL) of intensiteiten ten opzichte van individuele drempels klik (dwz 15 dB SPL overschrijdt drempel).
- Voor handmatige analyse, het identificeren van de 4-5 ABR golven (I, II, III, ... enz.) En teken de pieken (P1, P2, P3 ...) en dalen (N1, N2, N3, ...) voor elke golf. Zodra de analyse is voltooid, gegevens exporteren naar spreadsheet of tekstbestand.
- Voer statistische analyse van ABR gegevens met behulp van de juiste software. Afhankelijk van het experimenteel ontwerp, gebruik standaard gepaarde T-test of een analyse van de variantie (ANOVA) om te vergelijken belangrijkste ABR parameters in de verschillende groepen 26, 30.
LET OP: In longitudinale studies, zijn veel functionele gegevens verzameld van hetzelfde dier op verschillende temporele punten (dat wil zeggen vóór en na microchirurgie). In dit geval, een algemeen lineair model herhaalde meting test geeft een gedetailleerde variantieanalyse.
3. Vehicle Voorbereiding
- Voor te bereiden en te gebruiken voertuig oplossingen onder steriele omstandigheden.
LET OP: Vloeibare oplossingen zijn meestal snel opgelost door middel van de buis van Eustachius. Verschillende injecteerbare afgiftesystemen kunnen worden gebruikt om de verblijftijd van het geneesmiddel te verhogen in het middenoor, zoals hydrogels en 32 nanodeeltjes.- Om CGP-hydrogel bereiden lossen 75% gedeacetyleerd chitosan in 0,2 M azijnzuur waardoor een 1,5-2% (gew / gew) chitosan oplossing. Voeg 9% glycerofosfaat (w / w) aan deze oplossing 7. Bereid de oplossingvlak voor toediening en bewaar de hydrogel bij 4 ° C tot gebruik.
OPMERKING: De CGP-hydrogel matig viskeuze maar injecteerbare bij deze temperatuur. Onder 4 ° C verandert naar een vaste fase, het blokkeren van de toepassing. Na het aanbrengen CGP ondergaat een faseovergang naar een halfvast gel in ongeveer 15 minuten bij 37 ° C. - Aliquot (0,5 ml) commercieel RL buffer en bewaar bij 4 ° C tot gebruik.
- Om CGP-hydrogel bereiden lossen 75% gedeacetyleerd chitosan in 0,2 M azijnzuur waardoor een 1,5-2% (gew / gew) chitosan oplossing. Voeg 9% glycerofosfaat (w / w) aan deze oplossing 7. Bereid de oplossingvlak voor toediening en bewaar de hydrogel bij 4 ° C tot gebruik.
4. Microchirurgie
- Induceren algemene anesthesie met ketamine gebaseerde combinaties sedativa en analgetica (bijvoorbeeld ketamine 100 mg / kg, medetomidine 0,05 mg / kg en phentanile 0,025 mg / kg) door intraperitoneale injectie, gevolgd door inhalatie middelen (bijv isofluraan).
- Na het toedienen van injecteerbare middelen, past de verdoving gezichtsmasker om de muis snuit en sluit de O2 levering aan isofluraan damp. Handhaving van de inhalatie-anesthesie tijdens demicrochirurgie en bewaken van de verdoving vliegtuig met de teen-snuifje reflex en ademhaling. Begin chirurgische voorbereiding als de reflex is volledig afgeschaft en de muis presenteert regelmatige ademhaling.
- Handhaving van de lichaamstemperatuur met verwarming pads gedurende de gehele procedure en de ogen te beschermen tegen het hoornvlies keratitis met een hydroxypropyl-methylcellulose gebaseerde gel.
- Bereid een schone chirurgische gebied met behulp van steriele doeken. Steriliseer de microchirurgische instrumenten met een glazen kraal sterilisator voorafgaand aan de operatie. Handhaaf steriele omstandigheden tijdens de hele chirurgische procedure (steriele handschoenen, doeken, chirurgische instrumenten, enz.).
- microchirurgie
- Bullostomy
LET OP: Bullostomy is een eenzijdige procedure. Bedien een oor van de muis en gebruik de contralaterale oor als controle.- Plaats de muis in een decubitus rugligging. Bereid de chirurgische gebied aan de ventrale oppervlak van de nek met behulp van klippers aanVerwijder de vacht. Reinig de huid met povidonjood gebaseerde antiseptische oplossing, en bedek het met steriele doeken.
- Met behulp van een scalpel een longitudinale incisie 2 cm vanaf de onderkaak tot de clavicula.
- Onder vergroting met een chirurgische microscoop, identificeren de submandibulaire klieren en scheiden beide met een pincet. Trek de onderkaakspeekselklier en lokaliseren van de oorsprong van de musculus digastricus en het gezicht zenuw.
- Een insnijding in de oorsprong van de musculus digastricus met een schaar, uitlopen en ventraal, waardoor de onderliggende inferieure mediale zijde van het trommelvlies bulla.
- Maak een opening in de bulla door boren in met een 27 G naald (Figuur 2A). Lokaliseren stapediale slagader en RW membraan caudaal (figuur 2B). Reinig het bloed uit de geboorde ruimte met een absorbeerbare gelatine spons.
- Met behulp van een 34 G catheter en een glas micro-injectiespuit en injecteer langzaam 3-5 μL vehikeloplossing (CGP-hydrogel of RL) via bullostomy direct op de RW niche, te vullen (Figuur 2C). Sluit de bullostomy met 1-2 druppels van weefsel lijm.
- Zet de onderkaakspeekselklier naar hun oorspronkelijke positie en sluit de huid insnijdingen met 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad. Breng een chloorhexidine gebaseerd antiseptische rond de incisie te vermijden wondinfectie. OPMERKING: absorbeerbare en niet resorbeerbare hechtingen worden gebruikt. Niet absorbeerbare hechtingen worden verwijderd in 2 weken. Zijde wordt niet aanbevolen voor de sluiting huid omdat het gebruik ervan wordt geassocieerd met incisie infectie en lokale weefselreacties.
- Bilaterale transtympanic injectie
- Plaats de muis in de laterale decubitus positie en bereidt een aseptische chirurgische gebied onder de externe gehoorgang zoals beschreven in 4.3.1.1.
- Voeg een 0,5 cm longitudinale incisie in het verticale deel van de uitwendige gehoorgang dichtbij de tragus en seel de interne cutane vouw van de oorschelp (optioneel).
- Zoek het trommelvlies aan het eind van de uitwendige gehoorgang met een chirurgische microscoop (Figuur 2E) en identificeert de bovenste pars flaccida en de inferieure pars tensa, die in voorste en achterste gedeelten verdeeld door het handvat van de hamer (figuur 2F) .
- Maak een kleine myringostomy in het caudale deel van de pars flaccida. Maak een extra incisie in de pars tensa van het trommelvlies, de lucht evacuatie mogelijk te maken tijdens de injectie 33. Injecteer voorzichtig 10-15 uL drager (CGP-hydrogel of RL) oplossing met een glazen micro injectiespuit verbonden met een 34 G katheter door de pars flaccida, dicht bij de RW nis totdat het middenoor duidelijk vol.
- Sluit de huid insnijdingen met een 5-0 zijden chirurgisch hechtdraad en schoon zoals beschreven in 4.3.1.7.
- Plaats de muis op de andere kant en operaten de contralaterale oor (stappen 4.3.2.1 tot 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Houd de muis op een verwarmingselement, totdat het voldoende bewustzijn heeft herwonnen om borstligging handhaven. Heeft een dier dat een operatie heeft ondergaan om het gezelschap van andere dieren tot volledig hersteld niet meer terug.
- Controleer de conditie, de activiteit en de eventuele tekenen van pijn of spanning. Analgetica leveren indien nodig (dat wil zeggen Buprenorfine 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Geef je mening over de chirurgische wond dagelijks en verwijder de huid sluitingen 7-14 dagen na de operatie na te hebben vastgesteld dat de wond genezen is.
5. morfologische Evaluatie van Cochlear cytoarchitecture
- Euthanaseren de muis aan het einde van het experiment (in dit werk 28 dagen postmicrosurgery), met een intraperitoneale overdosis pentobarbital (100 mg / kg) aan de lange termijn van de operatie te bestuderen.
- Voer een transcardial perfusie met koude 0,1 M fosfaat-gebufferdZoutoplossing (PBS), pH 7,5, gevolgd door 4% (w / v) paraformaldehyde (PFA) in 0,1 M PBS, pH 7,5 zoals beschreven 26.
LET OP: Paraformaldehyde is zeer giftig; contact met de huid, ogen of slijmvliezen te voorkomen. Vermijd het inademen van het poeder tijdens de meting en voorbereiding. - Gebruik een stereomicroscoop om ontleden het binnenoor van het slaapbeen beschreven 34, 35 zonder scheiding van de vestibulaire en cochleaire componenten van het binnenoor.
- Bevestig de geïsoleerde binnenoor met 4% (gew / vol) PFA in 0,1 M PBS, pH 7,5 bij 4 ° C gedurende 12 uur onder zacht schudden. 3x wassen gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Ontkalken de monsters met 10% ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) bereid in 0,1 M PBS, pH 6,5 bij 4 ° C gedurende 10 d onder constant schudden, veranderen de EDTA elke 3 d.
- Wanneer cochleae een zachte consistentie te verwerven, te verwijderen EDTA en was 3x gedurende 5 min met 0,1 M PBS, pH 7,5, with schudden bij kamertemperatuur.
- Insluiten de monsters in paraffine zoals beschreven 34 en maak 7 pm dikke cochleaire secties parallel aan de modiolus.
- Om cochleair cytoarchitecture, vlek secties met hematoxyline en eosine (H & E) 30 te evalueren en gebruik een lichtmicroscoop verbonden met een digitale camera om beelden met 4X en 20X lenzen vast te leggen.
6. Cochlear Gene Expression
- Reinig het werkoppervlak en chirurgische instrumenten met RNase decontaminatie oplossing.
- Euthanaseren de muis, zoals beschreven in 5.1 en snel ontleden uit het binnenoor van het slaapbeen behulp van een microscoop. Dompel het binnenoor in een glazen schaaltje met ribonucleïnezuur (RNA) beschermer en stabilisator reagens.
- Verwijder het resterende rotsbeen met juwelier pincet en voorzichtig scheiden het slakkenhuis van de vestibule met behulp van Vanna's eye schaar 35.
- onmiddellijk transfer het slakkenhuis in een 2 ml microcentrifugebuis met 80 pi RNA beschermer en stabilisator oplossing en vries het weefsel door het plaatsen van de buis in droogijs. Behouden cochleair monsters bij -70 ° C tot gebruik.
- Isoleer cochleair RNA zoals beschreven 35 en de kwaliteit en kwantiteit vast spectrofotometrisch.
- Genereer cochleair cDNA uit gelijke hoeveelheden van de totale muis RNA met behulp van een reverse transcriptie commerciële kit.
- Uitvoeren qRT-PCR aanvullende deoxyribonucleïnezuur (cDNA) amplificeren in drievoud gentranscripten 35, 36 te meten.
LET OP: In dit werk pro- en anti-inflammatoire gen transcripties van Il1b, IL6, TGFB1, TNFa, Il10 en Dusp1 werden gemeten. - Bereken relatieve expressie verhoudingen door het normaliseren doelwit transcript cyclus drempel (CT) niveau aan het rekenkundig gemiddelde van de referentie-gen niveau en de relatieve kwantificatie door het normaliseren van deprobleemgroep transcript niveaus aan het rekenkundig gemiddelde van de kalibrator groep 37.
Representative Results
Hoorzitting werd getest door ABR voor en op verschillende tijdstippen na microchirurgie om de impact op auditieve functie (figuur 1A) te evalueren. ABR registers werden uitgevoerd onder verdoving van dieren beweging en de spanning artefacten te voorkomen en daardoor verbeteren van de reproduceerbaarheid 27. Intraperitoneaal ketamine gebaseerd combinaties of inhalatoire isofluraan werden gewoonlijk gebruikt om dieren te verdoven tijdens ABR proeven. De ketamine / xylazine combinatie levert een kortwerkend (2-3 min) inductie en een stabiel, veilig onderhoud fase tijdens het uitvoeren van ABR registers. Opgemerkt zij dat isofluraan kan beïnvloeden ABR meetgevoeligheid 38. ABR registers worden subdermale elektroden in specifieke plaatsen (Figuur 1B) geplaatst en de elektrische impedantie wordt gemeten. Als de impedantie 3 kOhm of hoger elektrode positie moet worden gecontroleerd om te voorkomen altVeel voorkomende handelingen in ABR wave amplitude.
Intratympanic levering wordt uitgevoerd bij muizen door twee microchirurgische procedures (Figuur 2). Blootstelling van de bulla tijdens bullostomy gaat terugtrekken van de onderkaakspeekselklier en musculus digastricus. Deze procedure wordt uitgevoerd met uiterste zorg worden uitgevoerd, omdat de halsslagader en de nervus vagus zijn zeer dicht (Figuur 2A). Vervolgens wordt de bulla geboord stapediale de slagader en RW membraan (Figuur 2B) lokaliseren. Om te voorkomen dat het kraken van het bot, is een kleine 0,5 mm opening gemaakt met een 27 G naald alvorens boren. De katheter 34 G wordt via de bullostomy richting RW membraan en een klein volume medium wordt afgegeven op het venster niche (figuur 2C). De transtympanic injectie wordt uitgevoerd via een incisie in de pars flaccida van het trommelvlies met een 27 G naald; een grotere kunnen veroorzaken bijoor in het membraan. Voorafgaand aan de injectie, raden wij aan het maken van een extra incisie in de pars tensa om de uitstroom van lucht mogelijk te maken tijdens de injectie van het voertuig (figuur 2F). Het is cruciaal om beschadiging van de stapediale slagader, een tak van de interne halsslagader, wat zou leiden tot levensbedreigende bloeden te voorkomen.
Muizen met bullostomy of transtympanic operaties bewaard gehoor gedurende het experiment, vergelijkbaar met niet-geopereerde controles (figuur 3). ABR drempels in reactie op klikken en de toon uitbarstingen niet significant veranderen na microchirurgie in vergelijking met de uitgangswaarden. Er werden geen significante verschillen waargenomen tussen bullostomy en transtympanic benaderingen. Morfologische studies zijn uitgevoerd om correcte aflevering voertuig in het middenoor te bevestigen en de mogelijke veranderingen veroorzaakt door de procedures van cochleaire cytoarchitecture beoordelen. Geen enkele van de belangrijkste cochleair regio showed morfologische veranderingen en dieren uit beide procedures gepresenteerd een vergelijkbare morfologie van cochleaire structuren (Figuur 4A). Bovendien werden de cochleaire profielen van genexpressie van pro- en anti-inflammatoire cytokinen bestudeerd. Ondanks het gebrek aan functionele verschillen in ABR gegevens tussen de twee procedures, bullostomy veroorzaakte een sterkere ontstekingsreactie dan de transtympanic aanpak (Figuur 4B).
Figuur 1. Experimentele Design and Hearing Assessment. (A) Schematische weergave van de experimentele procedure. Hoorzitting werd geëvalueerd met ABR voor en na microchirurgie. Cochlear monsters werden verkregen 28 dagen na microchirurgie. (B) Verdoofd muis in buikligging over de verwarming pad in een geluiddempende kamer, met subdermale electrodes geplaatst in de hoofdhuid tussen de oren over de top van de schedel (actieve, positieve); in de parotis gebied onder de oorschelp (referentie, negatief) en in de rug (grond). De vrije-veld luidspreker wordt geplaatst op een vaste afstand (5 cm) naar het rechteroor. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Microchirurgie voor Vehicle Application. (A) Ventraal aanzicht van het trommelvlies bulla. De bullostomy wordt uitgevoerd caudaal van de gezichtszenuw met een 27 G naald. (B) RWN en stapediale slagader kan worden waargenomen door de perforatie. (C) De 34 G katheter wordt via de bullostomy naar de RW niche. (D) Een maand na de bullostomy, een kleine benigelitteken is aanwezig in de opening plaats (pijlpunt). (E) Zijaanzicht van het oor, die de insnijding in de uitwendige gehoorgang en het trommelvlies (vierkant). (F) Detail van het trommelvlies. Een punctie werd gedaan op de caudale bovenste kwadrant van het trommelvlies met behulp van een 27 G naald (zwarte asterisk, in de pars flaccida); de injectie werd gedaan door middel van deze perforatie met behulp van een 34 G katheter. Een extra gat gemaakt in de schedelholte onderste kwadrant van het membraan (witte asterisk in de pars tensa) voorafgaand aan de injectie om de tympanische druk te herstellen. (G) Zicht op de 34 G katheter via de punctie van het trommelvlies. (H) Uitzicht op de cochleaire regio 24 uur na de microchirurgie. RWN gevuld met drageroplossing (asterisk). Lat, laterale; Ro, rostrale; Do, dorsale; Ma, hamer; Co, slakkenhuis; OW, ovale venster; RWN, ronde venster niche. Schaalbalken = 200 um in A, D, F; Schaalbalken = 100 urn in B, C, H; Schaal bars = 1,000 micrometer in E, G. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Hoorzitting Assessment. Evolutie van ABR drempelwaarden (gemiddelde ± SEM, in dB SPL) in reactie te klikken (A) en tone burst (B) stimuli, vóór en 7, 14 en 28 dagen na micro-operatie bij mannelijke acht weken oude C57BL / 6J muizen. Bullostomy (oranje; n = 11); transtympanic injectie (blauw; n = 6); niet-bediende (grijs; n = 11), Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
jpg "/>
Figuur 4. Cochlear morfologie en genexpressie analyse. (A) Morfologie van de belangrijkste cochleaire structuren bij de basis van het slakkenhuis. Haematoxilin-eosine kleuring van mid-modiolar paraffine secties (7 pm), van de oren van niet-bediende muizen en muizen een maand na microchirurgie tussenkomst van bullostomy of transtympanic injectie. Het scala media compartiment (a, b, c) geeft alle hoofdcomponenten. Details van elk van deze structuren (genummerde vakken) getoond in de volgende afbeeldingen: ganglion spirale (1), orgaan van Corti (2), spiraalvormige ligament (3) en stria vascularis (4). Inner haar cel (asterisk); buitenste haarcellen (hoofd van de pijl). Schaal bar = 100 urn a, b, c; Schaalbalken = 50 urn in-1,2,3,4. (B) Cochlear expressie van ontstekingsfactoren 28 d na de microchirurgie. Vergelijking tussen bullostomy (oranje) en transtympanic injectie (blauw) en de niet-bediende muizen (wit). *: Niet-bediende vs.bediend groepen; ^: Vergelijking tussen groepen bediend. Genexpressie worden voorgesteld als 2 - ΔΔCt of de n-voudig verschil ten opzichte van niet-bediende group.Values worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM van triplo from pool monsters van 3 muizen per conditie. Statistische significantie: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Lokale geneesmiddelafgifte aan het binnenoor kan direct intracochleaire injectie of indirect gebeuren door intratympanic toediening, het plaatsen van het geneesmiddel in het middenoor 4, 19, 39. Intracochlear administratie levert gecontroleerde en precieze drug delivery aan het slakkenhuis, het vermijden van diffusie door raam membranen, basale te apicale concentratie gradiënten en de klaring via de buis van Eustachius. Het is echter gewoonlijk een invasieve procedure die een complexe en delicate microchirurgie 7, 39 vereist. In dit verband is de ontwikkeling van nieuwe industrie, coating, implantaten voor langdurige geneesmiddelafgifte 40, 41. Anderzijds, intratympanic toediening is een minimaal invasieve en eenvoudig uit te voeren procedure de injectie van grotere hoeveelheden van de d toestaatkleed in het middenoor, hoewel de farmacokinetiek is niet gemakkelijk te controleren. Het merendeel van het geneesmiddel wordt uitgeklaard buis van Eustachius en de resterende fractie moet diffunderen door het membraan naar de RW slakkenhuis 18 bereikt. RW is de site van de maximale absorptie van stoffen uit het middenoor in de-perilymfe gevulde trommelvlies duct van het slakkenhuis 7. Het is een semipermeabel drielagenstructuur, hoewel de permeabiliteit afhankelijk van het geneesmiddel eigenschappen (grootte, concentratie, oplosbaarheid en elektrische lading) en transmembraan transportsystemen (diffusie, actief transport of fagocytose) 42. De ovale venster en otic capsules zijn alternatief, maar minder effectief ingangen van slakkenhuis 43, 44.
Hier laten we zien en vergelijking van twee microchirurgische methoden voor gerichte toediening van geneesmiddelen in de muis middenoor: bullostomy en transtympanic injectie procedures. Gemeenschappelijke kritische stappen om deze procedures omvatten: i) een evaluatie van het gehoor voor en na de microchirurgie, ii) het bereiden van een homogene voertuig oplossing onder steriele omstandigheden, iii) zorgvuldige controle van de anesthesieprocedure en bewaking van dierlijke lichaamstemperatuur en constanten, iv ) trage plaatsing van het juiste volume van het voertuig gericht op de RW, en iv) het nemen van cochleaire monsters naar moleculaire en morfologische analyse te voltooien.
Retroauricular en ventrale benaderingen bullostomy zijn beschreven 7, 45. We gebruikten de ventrale onderlinge omdat onze ervaring heeft geresulteerd in minder morbiditeit en verschaft betere toegang tot de RW 46. Transtympanic injecties worden meestal via de pars tensa van het trommelvlies uitgevoerd voor- of achterkant aan de hamersteel manubrium 12. Indit werk hebben we een modificatie van de techniek een injectie door de pars flaccida buiten de hamer met een eerdere aanvullende punctie van de pars tensa lucht kunnen verlaten tijdens de injectie.
De transtympanic injectie was minder invasief dan de bullostomy, hoewel beide microsurgeries waren snel (20 en 5 minuten per oor voor bullostomy en transtympanic benadering respectievelijk), met korte postoperatieve herstel tijden en geen morbiditeit. Belangrijker, zowel hanteert gehoor en ABR parameters waren identiek aan die bepaald voor de microchirurgie. De transtympanic aanpak kost minder tijd dan de bullostomy en kan in beide oren van hetzelfde dier worden uitgevoerd tijdens dezelfde ingreep. Eigenschappen transtympanic injectie derhalve dat bilateraal kan worden uitgevoerd en herhaald, indien nodig. Anderzijds, bullostomy biedt rechtstreekse visuele toegang tot de RW membraan en laat de Filling van het RW niche. In tegenstelling, heeft transtympanic injectie niet toe dat voor de controle van de plaatsing voertuig in de RW niche.
De procedures die in dit werk te beschrijven hoe een lokale drug voertuig levering aan het middenoor voor pre-klinische toepassingen uit te voeren, zoals de evaluatie van ototoxiciteit en de evaluatie van de werkzaamheid in gehoorverlies. Twee microchirurgische procedures beschreven die alternatieve werkwijzen specifieke voor- en nadelen geven. Zowel het behoud van het gehoor en geen morfologische veranderingen veroorzaken. Lokale ontsteking wordt beschreven als een mogelijke complicatie van bullostomy. Een set van complementaire technieken zijn ook beschreven voor postoperatieve procedures, met inbegrip van gehoor, morfologische en inflammatoire marker expressie evaluaties. Toekomstige toepassingen van deze technieken omvatten het preklinische evaluatie van nieuwe therapieën voor gehoorverlies, zoals genetische, cellulaire en farmacologische benaderingen in diermodellen. Intratympanic administrationen zorgen voor de levering van de behandeling in het middenoor, in contact met het ronde venster membraan, het vergemakkelijken van de overgang naar de perilymfe zonder duidelijke cochleair schade.
Acknowledgments
De auteurs willen de Genomics en invasieve neuro Evaluatiefaciliteiten (IIBM, CSIC-UAM) bedanken voor hun technische ondersteuning. Dit werk werd ondersteund door subsidies van de Spaanse "Ministerio de Economia y Competitividad" (EFRO-SAF2014-53979-R) en de Europese Unie (FP7-AFHELO en FP7-PEOPLE-TARGEAR) naar IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
References
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing impairment: a panoply of genes and functions. Neuron. 68 (2), 293-308 (2010).
- Muller, U., Barr-Gillespie, P. G. New treatment options for hearing loss. Nat Rev Drug Discov. 14 (5), 346-365 (2015).
- Okano, T. Immune system of the inner ear as a novel therapeutic target for sensorineural hearing loss. Front Pharmacol. 5, 205 (2014).
- Rivera, T., Sanz, L., Camarero, G., Varela-Nieto, I. Drug delivery to the inner ear: strategies and their therapeutic implications for sensorineural hearing loss. Curr Drug Deliv. 9 (3), 231-242 (2012).
- Horie, R. T., et al. Stealth-nanoparticle strategy for enhancing the efficacy of steroids in mice with noise-induced hearing loss. Nanomedicine (Lond). 5 (9), 1331-1340 (2010).
- Kanzaki, S., et al. Novel in vivo imaging analysis of an inner ear drug delivery system: Drug availability in inner ear following different dose of systemic drug injections. Hear Res. 330 (Pt A), 142-146 (2015).
- Paulson, D. P., et al. A novel controlled local drug delivery system for inner ear disease). Laryngoscope. 118 (4), 706-711 (2008).
- Fetoni, A. R., Troiani, D., Eramo, S. L., Rolesi, R., Paludetti Troiani, G. Efficacy of different routes of administration for Coenzyme Q10 formulation in noise-induced hearing loss: systemic versus transtympanic modality. Acta Otolaryngol. 132 (4), 391-399 (2012).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Direct drug application to the round window: a comparative study of ototoxicity in rats. Otolaryngol Head Neck Surg. 141 (5), 584-590 (2009).
- Pullens, B., van Benthem, P. P. Intratympanic gentamicin for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (3), (2011).
- Lavigne, P., Lavigne, F., Saliba, I. Intratympanic corticosteroids injections: a systematic review of literature. Eur Arch Otorhinolaryngol. , (2015).
- Park, S. H., Moon, I. S. Round window membrane vibration may increase the effect of intratympanic dexamethasone injection. Laryngoscope. 124 (6), 1444-1451 (2014).
- Phillips, J. S., Westerberg, B. Intratympanic steroids for Meniere's disease or syndrome. Cochrane Database Syst Rev. (7), (2011).
- Trune, D. R., Canlon, B. Corticosteroid therapy for hearing and balance disorders. Anat Rec (Hoboken). 295 (11), 1928-1943 (2012).
- Wei, B. P., Stathopoulos, D., O'Leary, S. Steroids for idiopathic sudden sensorineural hearing loss. Cochrane Database Syst Rev. 7, (2013).
- Varela-Nieto, I., Silvia, M. -C., Rodriguez-de la Rosa, L. ourdes, Lassaletta, L. uis, Contreras, J. ulio IGF-I deficiency and hearing loss: molecular clues and clinical implications. Pediatr Endocrinol Rev. 10 (4), 12 (2013).
- Nakagawa, T., et al. Audiometric outcomes of topical IGF1 treatment for sudden deafness refractory to systemic steroids. Otol Neurotol. 33 (6), 941-946 (2012).
- Liu, H., et al. Evaluation of intratympanic formulations for inner ear delivery: methodology and sustained release formulation testing. Drug Dev Ind Pharm. 40 (7), 896-903 (2014).
- Nakagawa, T., Ito, J. Local drug delivery to the inner ear using biodegradable materials. Ther Deliv. 2 (6), 807-814 (2011).
- Buckiova, D., et al. Minimally invasive drug delivery to the cochlea through application of nanoparticles to the round window membrane. Nanomedicine. 7 (9), 1339-1354 (2012).
- Stover, T., Yagi, M., Raphael, Y. Cochlear gene transfer: round window versus cochleostomy inoculation. Hear Res. 136 (1-2), 124-130 (1999).
- Ahmed, T. A., Aljaeid, B. M. Preparation, characterization, and potential application of chitosan, chitosan derivatives, and chitosan metal nanoparticles in pharmaceutical drug delivery. Drug Des Devel Ther. 10, 483-507 (2016).
- Bhattarai, N., Gunn, J., Zhang, M. Chitosan-based hydrogels for controlled, localized drug delivery. Adv Drug Deliv Rev. 62 (1), 83-99 (2010).
- Rao, S. B., Sharma, C. P. Use of chitosan as a biomaterial: studies on its safety and hemostatic potential. J Biomed Mater Res. 34 (1), 21-28 (1997).
- Supper, S., et al. Thermosensitive chitosan/glycerophosphate-based hydrogel and its derivatives in pharmaceutical and biomedical applications. Expert Opin Drug Deliv. 11 (2), 249-267 (2014).
- Riquelme, R., et al. A comparative study of age-related hearing loss in wild type and insulin-like growth factor I deficient mice. Front Neuroanat. 4, 27 (2010).
- Willott, J. F. Measurement of the auditory brainstem response (ABR) to study auditory sensitivity in mice. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 8 Unit8 21B (2006).
- Cederholm, J. M., et al. Differential actions of isoflurane and ketamine-based anaesthetics on cochlear function in the mouse. Hear Res. 292 (1-2), 71-79 (2012).
- Cediel, R., Riquelme, R., Contreras, J., Diaz, A., Varela-Nieto, I. Sensorineural hearing loss in insulin-like growth factor I-null mice: a new model of human deafness. Eur J Neurosci. 23 (2), 587-590 (2006).
- Murillo-Cuesta, S., et al. Insulin receptor substrate 2 (IRS2)-deficient mice show sensorineural hearing loss that is delayed by concomitant protein tyrosine phosphatase 1B (PTP1B) loss of function. Mol Med. 18, 260-269 (2012).
- Ngan, E. M., May, B. J. Relationship between the auditory brainstem response and auditory nerve thresholds in cats with hearing loss. Hear Res. 156 (1-2), 44-52 (2001).
- El Kechai, N., et al. Recent advances in local drug delivery to the inner ear. Int J Pharm. 494 (1), 83-101 (2015).
- Grewal, A. S., Nedzelski, J. M., Chen, J. M., Lin, V. Y. Dexamethasone uptake in the murine organ of Corti with transtympanic versus systemic administration. J Otolaryngol Head Neck Surg. 42, 19 (2013).
- Camarero, G., et al. Delayed inner ear maturation and neuronal loss in postnatal Igf-1-deficient mice. J Neurosci. 21 (19), 7630-7641 (2001).
- Rodriguez-de la Rosa, L., et al. Comparative gene expression study of the vestibular organ of the Igf1 deficient mouse using whole-transcript arrays. Hear Res. 330 (Pt A), 62-77 (2015).
- Sanchez-Calderon, H., et al. RNA microarray analysis in prenatal mouse cochlea reveals novel IGF-I target genes: implication of MEF2 and FOXM1 transcription factors. PLoS One. 5 (1), e8699 (2010).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Ruebhausen, M. R., Brozoski, T. J., Bauer, C. A. A comparison of the effects of isoflurane and ketamine anesthesia on auditory brainstem response (ABR) thresholds in rats. Hear Res. 287 (1-2), 25-29 (2012).
- Borkholder, D. A., Zhu, X., Frisina, R. D. Round window membrane intracochlear drug delivery enhanced by induced advection. J Control Release. 174, 171-176 (2014).
- Astolfi, L., et al. Cochlear implants and drug delivery: In vitro evaluation of dexamethasone release. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (2), 267-273 (2014).
- Roche, J. P., Hansen, M. R. On the Horizon: Cochlear Implant Technology. Otolaryngol Clin North Am. 48 (6), 1097-1116 (2015).
- Duan, M. -l, Zhi-qiang, C. Permeability of round window membrane and its role for drug delivery: our own findings and literature review. Journal of Otology. 4 (1), 34-43 (2009).
- Mikulec, A. A., Plontke, S. K., Hartsock, J. J., Salt, A. N. Entry of substances into perilymph through the bone of the otic capsule after intratympanic applications in guinea pigs: implications for local drug delivery in humans. Otol Neurotol. 30 (2), 131-138 (2009).
- Kang, W. S., et al. Intracochlear Drug Delivery Through the Oval Window in Fresh Cadaveric Human Temporal Bones. Otol Neurotol. 37 (3), 218-222 (2016).
- Lajud, S. A., et al. A regulated delivery system for inner ear drug application. J Control Release. 166 (3), 268-276 (2013).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hear Res. 151 (1-2), 106-114 (2001).
