Abstract
Presentiamo due tecniche microchirurgiche minimamente invasive nei roditori per la somministrazione di farmaci specifici nell'orecchio medio in modo che possa raggiungere l'orecchio interno. La prima procedura consiste di perforazione della bolla timpanica, definito bullostomy; la seconda è una iniezione di transtimpanica. Entrambi emulare le procedure intratympanic clinici umani.
Il chitosano-glicerofosfato (CGP) e buffer di lattato Ringer's (RL) sono stati utilizzati come veicoli biocompatibili per la consegna locale di droga. CGP è un polimero biodegradabile non tossico ampiamente utilizzati in applicazioni farmaceutiche. Si tratta di un liquido viscoso a temperatura ambiente ma congela ad una fase solida semi a temperatura corporea. RL è una soluzione isotonica utilizzato per somministrazioni endovenose nell'uomo. Un piccolo volume di questo veicolo è posto proprio sulla nicchia Finestra rotonda (RW) mediante un bullostomy. Una iniezione di transtimpanica riempie l'orecchio medio e consente meno controllo, ma un più ampio accesso al orecchio interno.
Entrambe le procedure sono adatti come metodi di somministrazione dei farmaci nell'orecchio medio del mouse, anche se l'iniezione transtimpanica ha dimostrato di essere meno invasivo rispetto a bullostomy.
Introduction
Sordità è il deficit sensoriale umana più frequente e colpisce il 5,3% della popolazione mondiale e il 30% degli individui di età superiore ai 65 ( http://www.who.int/topics/deafness/en , aggiornato 2016). La perdita dell'udito colpisce l'acquisizione del linguaggio nei bambini e accelera il declino cognitivo nelle persone anziane. Pertanto, è un importante problema sanitario con un impatto socio-economico enorme. Essa può essere causata da difetti genetici, fattori ambientali o una combinazione di entrambi 1, che alla fine induce danno e la morte delle cellule ciliate ei neuroni nella coclea. Queste cellule non si rigenerano nei mammiferi, quindi, la perdita cellulare e la perdita di udito concomitante non possono essere ripristinate. Opzioni cliniche sono basate su dispositivi protesici, tra cui apparecchi acustici e cocleare, orecchio medio e impianti a conduzione ossea 2. Purtroppo, non ci sono specifiche trea medico ristoratoretments per ipoacusia e quindi diverse linee di ricerca sono focalizzate sullo sviluppo di terapie preventive e riparative. Nuove opzioni terapeutiche includono terapie geniche e cellulari, nonché lo sviluppo di piccole molecole per la terapia farmacologica 2.
Una delle sfide più importanti nella terapia farmacologica cocleare è la consegna della droga. Trattamenti sistemici hanno limitato l'efficacia nella coclea a causa della barriera emato-labirinto 3, endotelio continuo contatto con i vasi sanguigni cocleare, che agisce come una barriera fisica e biochimica per mantenere interna omeostasi fluido dell'orecchio, limitando così il passaggio farmaco per l'orecchio interno. Si è permeabile solo piccole molecole liposolubili, anche se la permeabilità può essere aumentata durante l'infiammazione cocleare, e anche con l'uso di diuretici o agenti osmotici. Il volume di farmaco che raggiunge infine la coclea dopo somministrazione sistemica è ridotta;Pertanto, sono richieste dosi elevate che possono causare tossicità organica. Inoltre, il metabolismo epatico del farmaco può produrre metaboliti tossici o inattivi 4, 5, 6, 7. Al contrario, interventi locali permettono il posizionamento di una quantità limitata noto del farmaco nell'orecchio medio o interno senza effetti collaterali indesiderati 4, 7, 8, 9. Nella pratica clinica attuale, le amministrazioni intratympanic sono limitati a determinate patologie cocleari, come ad esempio la gentamicina nella malattia di Meniere 10, corticosteroidi a sordità improvvisa, la malattia di Meniere, immuno-mediata e il rumore indotto perdita di udito, 11, 12, 13, 1Fattore di crescita 4, 15 e insulino-simile 1 (IGF1) in sordità improvvisa 4, 16, 17.
Le formulazioni per l'amministrazione locale dovrebbe conservare l'omeostasi delicata (pH e osmolarità) di fluidi cocleari. Inoltre, è molto importante per mantenere la sterilità durante tutto il processo per evitare la contaminazione batterica del liquido cerebrospinale. L'ingrediente utilizzato per la somministrazione di farmaci dovrebbe essere biocompatibile, nonototoxic e della consistenza adeguata. soluzioni liquide sono raccomandati per iniezioni intracochlear, ma non sono adatti per il percorso intratympanic causa il passaggio attraverso il tubo di Eustachio. In questo caso, i farmaci vengono solitamente effettuate dai gel semi-solido per aumentare la loro permanenza nell'orecchio medio 4, 18, 19. syste di consegna alternativoms utilizzati come vettori per aumentare il passaggio del farmaco all'orecchio interno sono nanoparticelle 20 e adenovirus 21 Qui confrontati due veicoli: CGP e una soluzione RL. CGP è un idrogel formato da chitosano, un polisaccaride lineare composto di D-glucosamina e N-acetil-D-glucosamina ottenuto da gusci di crostacei, e β-glicerofosfato, un poliolo che forma uno scudo di acqua intorno alle catene chitosano e lo mantiene in forma liquida. CGP è termosensibile e può essere degradata da lisozimi, consentendo un rilascio prolungato farmaco nell'orecchio medio 22, 23, 24, 25. Idrogel chitosano-base sono veicoli adatti per applicazioni cliniche, come la somministrazione di farmaci a causa della loro mancanza di immunogenicità e la mancanza di attivazione di reazioni infiammatorie locali 23, 24. Sulla OTHer mano, tampone RL è una soluzione isotonica apirogena (273 mOsm / L e pH 6,5) destinati alla somministrazione endovenosa nell'uomo come fonte di acqua ed elettroliti, soprattutto in perdita di sangue, traumi o ustioni perchè i sottoprodotti del metabolismo lattato nel fegato contrastare l'acidosi.
Qui si descrive e confrontare i due metodi chirurgici che sono stati raffinati per la consegna locale di droga all'orecchio interno del mouse. Il profilo di sicurezza di entrambe le tecniche è stata valutata mediante test funzionali, morfologici e molecolari. Audizione è stata valutata utilizzando risposta uditiva del tronco encefalico (ABR) 26, 27 eseguiti prima e dopo microchirurgia in tempi diversi. procedure di end-point sono stati usati per sezionare la coclea e confrontare l'impatto anatomica, cellulare e molecolare di questi due interventi di microchirurgia.
Protocol
Assicurarsi che le procedure di gestione degli animali sono in conformità alle norme internazionali e nazionali. Il protocollo segue la Comunità europea 2010/63 / UE e spagnolo RD 53/2013 linee guida, rispettivamente.
Manipolazione 1. Animal generale
- Topi di alimentazione ad libitum con una dieta standard e acqua potabile. controllo sanitario e del benessere seguendo Federazione per laboratorio Animal Science Associazioni (FELASA) raccomandazioni.
Valutazione 2. Audizione
NOTA: Traccia impatto funzionale di interventi di microchirurgia di test dell'udito prima e molte volte dopo l'intervento chirurgico (in questo lavoro 2, 7, 14 e 28 d postmicrosurgery) con procedure non invasive come l'ABR 9.
- Per il test ABR, anestetizzare i topi con protocolli effetto di breve durata cioè iniezione intraperitoneale di ketamina (100 mg / kg di peso corporeo (BW) e xilazina (10mg / kg, BW). In alternativa, eseguire test dell'udito in anestesia inalante.
NOTA: Poiché i parametri ABR possono essere influenzate dal protocollo anestetico 28, utilizzare la stessa tutto l'esperimento. - Controllare la profondità dell'anestesia testando riflesso toe-pinch.
NOTA: quando il riflesso di ritiro scompare, l'animale ha raggiunto una profondità adeguata di anestesia per eseguire il test uditivo. - Proteggere gli occhi da essiccazione e cheratocongiuntivite sicca secondario somministrazione topica di integratori lacrimali, come gel metilcellulosa basata idrossipropilici.
- Mantenere il mouse a temperatura fisiologica (37,5-38 ° C) durante l'intera procedura. Per evitare interferenze elettriche, utilizzare un caldo pastiglie pompa acqua e riscaldamento. Monitorare la temperatura corporea con sonde rettali. Fare sempre attenzione a non surriscaldare l'animale.
NOTA: Si consiglia di pulire la piastra elettrica con un disinfettante superficie tra i topi.0; Per l'induzione dell'anestesia e recupero, di coperture riscaldabili elettriche, ad incandescenza o luci a infrarossi può essere utilizzato. - procedura ABR
NOTA: Per la registrazione ABR, utilizzare una postazione computer con una scheda audio interna per creare forme d'onda (da digitale ad analogico, uscita DA, conversione) e per digitalizzare le forme d'onda di risposta elettrici (da analogico a, entrata AD digitale), un attenuatore, un oscilloscopio e un amplificatore a bassa impedenza. I moderni workstation uditivi (ovvero Tucker Davis Techonologies) includono tutti questi componenti in un unico sistema compatto.- Posizionare il mouse anestetizzato in posizione prona sui rilievi di riscaldamento all'interno di una camera di attenuazione del suono per evitare interferenze rumore ambientale e riverbero (Figura 1).
- Fornire stimoli acustici nel canale uditivo esterno. Utilizzare stimoli predefiniti o nuovi segnali progettati con il software appropriato. Collegare l'uscita workstation DA all'altoparlante selezionato.
NOTA: Frecampo elettrico o chiuso campo altoparlanti inseriti nel canale uditivo esterno possono essere usati. I primi sono preferiti quando si lavora con i topi a causa della difficoltà di inserimento sonda e calibrazione audio in sistemi chiusi. Altoparlanti campo libero stimolano entrambe le orecchie e suscitare una risposta binaurale. Per ottenere risposte prevalentemente mono con altoparlanti campo libero, l'attività controlaterale deve essere eliminato dalla occlusione (cioè con tappi per le orecchie) o mascherando il rumore.- Posizionare altoparlante campo libero ad una distanza fissa (generalmente 5-20 cm) affacciata alla testa o orecchio selezionato con il centro del diffusore allineato con il canale uditivo esterno. Assicurarsi che non vi siano ostacoli tra l'altoparlante e l'orecchio e che il padiglione auricolare è completamente aperta.
- Posizionare inossidabile agoelettrodi sottocutanei come segue: i) attivo () elettrodo positivo nel cuoio capelluto tra le orecchie (oltre il vertice del cranio), ii) l'elettrodo di riferimento (negativo), nella parotidezona sottostante il padiglione auricolare, e iii) l'elettrodo di terra nella regione dell'arto posteriore, la coda o posteriore (Figura 1).
- Controllare l'impedenza elettrica negli elettrodi positivi e negativi. Assicurarsi che l'impedenza è inferiore a 3 kOhm (idealmente 1 kOhm). Se è superiore, riposizionare, pulita con alcool o sostituire gli elettrodi.
- Per la registrazione ABR, generare clic a banda larga e frequenze di tono puro e presente a diminuire di intensità 90-10 dB rispetto al livello di pressione sonora (SPL) in 5-10 dB SPL passi 27, 29, 30.
- Presente breve clic o tono scoppiare stimoli (1-5 ms) che iniziano con alto livello (ad esempio 80 o 90 dB SPL) e riducendo l'intensità in 5-10 dB SPL passi. Registrare la risposta elettrica nei primi 10 ms dopo la stimolazione (evocati risposte ABR vengono ordinate 6-8 ms).
NOTA: per questo motivo, i tassi di stimolazionenon deve essere superiore a 50 stimoli / s (velocità normale 20-50).
- Presente breve clic o tono scoppiare stimoli (1-5 ms) che iniziano con alto livello (ad esempio 80 o 90 dB SPL) e riducendo l'intensità in 5-10 dB SPL passi. Registrare la risposta elettrica nei primi 10 ms dopo la stimolazione (evocati risposte ABR vengono ordinate 6-8 ms).
- Amplifica, registrare e media la risposta elettrica evocata a ogni stimolo e intensità. Utilizzare un amplificatore con basso rumore e un buon rapporto segnale-rumore, e collegarlo all'ingresso AD.
NOTA: ABRs hanno ampiezze molto basse, tipicamente inferiore a 1 mV (da picco a picco) e devono essere registrati utilizzando un amplificatore a rumore molto basso. Nei topi udito normale, chiare onde ABR emergono dopo una media di 100 - 200 risposte, tuttavia per ottenere registrazioni di alta qualità, o, nel caso di ipoacusia, più ripetizioni sono raccomandati (750-1,000) 27. - Visivamente determinare la soglia ABR durante la prova.
NOTA: La soglia ABR è la più bassa intensità stimoli sonori che suscita registrazione con onde da I a IV chiaramente visibili e media tensione 2 SD picco-picco sopra il fondo attività media 31 un ABR affidabile. Questi dati deve essere confermata duanello analisi off-line, insieme ad altri parametri tra cui picco e interpicco latenza e onda ampiezze. - Effettuare analisi dei dati manualmente o automaticamente.
- Per l'analisi manuale, identificare i 4-5 onde ABR (I, II, III, ... ecc.) E segnare i picchi (P1, P2, P3 ...) e valli (N1, N2, N3 ...) per ogni onda. Una volta completata l'analisi, esportare i dati in fogli di calcolo o file di testo.
NOTA: Il software specifico per la registrazione risposta elettrica di solito esegue automaticamente l'analisi. Misurazioni aggiuntive possono essere determinati nella registrazione ABR in risposta ad una intensità fissa (cioè 70 o 80 dB SPL) o intensità relative a soglie click individuali (cioè 15 dB SPL sopra soglia).
- Per l'analisi manuale, identificare i 4-5 onde ABR (I, II, III, ... ecc.) E segnare i picchi (P1, P2, P3 ...) e valli (N1, N2, N3 ...) per ogni onda. Una volta completata l'analisi, esportare i dati in fogli di calcolo o file di testo.
- Effettuare analisi statistica dei dati ABR utilizzando il software appropriato. A seconda del disegno sperimentale, l'uso standard accoppiato T-test o analisi della varianza (ANOVA) per confrontare principale para ABRTERS nei diversi gruppi di 26, 30.
NOTA: In studi longitudinali, molti dati funzionali vengono raccolti dallo stesso animale in diversi punti temporali (cioè prima e dopo microchirurgia). In questo caso, un modello ripetuto test generico misura lineare fornisce una dettagliata analisi della varianza.
3. Preparazione del veicolo
- Preparare e utilizzare le soluzioni di veicoli in condizioni sterili.
NOTA: Le soluzioni liquide sono di solito eliminati rapidamente attraverso la tromba di Eustachio. Diversi sistemi di consegna iniettabili possono essere usati per aumentare il tempo di permanenza del farmaco nell'orecchio medio, compresi idrogel e nanoparticelle 32.- Per preparare CGP-idrogel, sciogliere il 75% chitosano deacetilato in acido acetico 0,2 M di ottenere una soluzione di chitosano 1,5-2% (peso / peso). Aggiungere 9% di glicerofosfato (peso / peso) di questa soluzione 7. Preparare la soluzioneappena prima della somministrazione e memorizzare l'idrogel a 4 ° C fino all'utilizzo.
NOTA: Il CGP-idrogel è moderatamente viscosa, ma ancora iniettabili a questa temperatura. Sotto 4 ° C si trasforma in una fase solida, bloccando la sua applicazione. Dopo l'applicazione, CGP subisce una transizione di fase ad un gel semi-solido in circa 15 min a 37 ° C. - Aliquota (0,5 mL) di tampone RL commerciale e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo.
- Per preparare CGP-idrogel, sciogliere il 75% chitosano deacetilato in acido acetico 0,2 M di ottenere una soluzione di chitosano 1,5-2% (peso / peso). Aggiungere 9% di glicerofosfato (peso / peso) di questa soluzione 7. Preparare la soluzioneappena prima della somministrazione e memorizzare l'idrogel a 4 ° C fino all'utilizzo.
4. interventi di microchirurgia
- Indurre l'anestesia generale con la chetamina base di sedativi e analgesici (cioè ketamina 100 mg / Kg, medetomidina 0,05 mg / kg e phentanile 0,025 mg / kg) per via intraperitoneale, seguita da agenti inalatori (cioè isoflurano).
- Dopo la somministrazione di agenti iniettabili, regolare la maschera anestetico al muso del mouse e collegare l'alimentazione O 2 al vapore isoflurano. Mantenere l'anestesia per inalazione durante lamicrochirurgia e monitorare il piano anestetico con il riflesso punta pinch e modello di respirazione. Iniziare la preparazione chirurgica quando il riflesso è totalmente abolita e il mouse presenta respiro regolare.
- Mantenere la temperatura corporea con rilievi di riscaldamento durante l'intera procedura e proteggere gli occhi da cheratite corneale con un gel a base di metilcellulosa idrossipropil.
- Preparare una area chirurgica pulita utilizzando teli sterili. Sterilizzare gli strumenti di microchirurgia con uno sterilizzatore vetro tallone prima dell'intervento chirurgico. Mantenere condizioni di sterilità durante tutta la procedura chirurgica (guanti sterili, tende, strumenti chirurgici, etc.).
- microchirurgia
- Bullostomy
NOTA: Bullostomy è una procedura unilaterale. Operare un orecchio del mouse e utilizzare l'orecchio controlaterale come controllo.- Posizionare il mouse in posizione supina decubito. Preparare l'area chirurgica sulla superficie ventrale del collo con tagliaunghie arimuovere la pelliccia. Pulire la pelle con soluzione antisettica a base di iodio povidone, e coprire con teli sterili.
- Usando un bisturi, fare un'incisione di 2 cm longitudinale dalla mandibola alla clavicola.
- Sotto ingrandimento con un microscopio chirurgico, identificare le ghiandole sottomandibolari e separare entrambi con pinze. Ritrarre le ghiandole sottomandibolari e localizzare l'origine del muscolo digastrico e il nervo facciale.
- Fare un'incisione nell'origine del muscolo digastrico con una forbice, e ritrattare ventrale, esponendo l'aspetto di fondo inferiore-mediale della bolla timpanica.
- Effettuare un'apertura nella bolla da perforazione con un ago 27 G (Figura 2A). Localizzare l'arteria stapediale e la membrana caudale RW ad esso (Figura 2B). Pulire il sangue dalla zona forata con una spugna di gelatina riassorbibile.
- Utilizzando un catetere G 34 e un bicchiere micro siringa, iniettare lentamente 3-5 μL di soluzione di veicolo (CGP-idrogel o RL) attraverso il bullostomy direttamente sulla nicchia RW, riempiendolo (Figura 2C). Sigillare la bullostomy con 1-2 gocce di colla tessuto.
- Ritorno ghiandole sottomandibolari alla loro posizione iniziale e chiudere le incisioni cutanee con 5-0 seta sutura chirurgica. Applicare un antisettico intorno l'incisione per evitare l'infezione della ferita clorexidina-based. NOTA: suture assorbibili e non assorbibili possono essere usati. suture non assorbibili devono essere rimossi in 2 settimane. Seta non è raccomandato per la chiusura della pelle in quanto il suo uso è associato ad infezione da incisione e reazioni tissutali locali.
- iniezione transtimpanica bilaterale
- Posizionare il mouse in decubito laterale e preparare un'area chirurgica asettica sotto del condotto uditivo esterno, come descritto in 4.3.1.1.
- Effettuare un'incisione a 0,5 centimetri longitudinale nella parte del condotto uditivo esterno verticale vicino al trago e sezione la piega cutanea interna del padiglione auricolare (opzionale).
- Individuare la membrana timpanica alla fine del condotto uditivo esterno utilizzando un microscopio chirurgico (Figura 2E) e identificare la pars superiori flaccida e pars inferiori Tensa, che è diviso in sezioni anteriore e posteriore dalla maniglia del martello (Figura 2F) .
- Fai un piccolo myringostomy nella porzione caudale della pars flaccida. Fare un'incisione supplementare nel Tensa pars della membrana timpanica, per consentire l'evacuazione dell'aria durante l'iniezione 33. Delicatamente iniettare 10-15 ml di veicolo (CGP-idrogel o RL) soluzione con una siringa di vetro micro collegato ad un catetere G 34 attraverso la pars flaccida, vicino alla nicchia RW finché l'orecchio medio è chiaramente pieno.
- Chiudere le incisioni cutanee con una sutura chirurgica 5-0 seta e pulito come descritto in 4.3.1.7.
- Posizionare il mouse sul lato opposto e opermangiò l'orecchio controlaterale (passi 4.3.2.1 a 4.3.2.5).
- Bullostomy
- Mantenere il mouse su una piastra elettrica fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione.
- Monitorare la condizione fisica, l'attività e la presenza di segni di dolore o di stress. Fornire analgesici se necessario (cioè Buprenorfina 0,05 mg / kg, Carprofen 5-10 mg / kg). Rivedere la ferita chirurgica quotidiana e rimuovere le chiusure della pelle 7-14 giorni dopo l'intervento chirurgico dopo aver verificato che la ferita è guarita.
5. morfologica Valutazione del Cochlear citoarchitettura
- Euthanize il mouse alla fine dell'esperimento (in questo lavoro 28 giorni postmicrosurgery), con una overdose pentobarbital intraperitoneale (100 mg / kg) per studiare gli effetti a lungo termine della chirurgia.
- Eseguire un perfusione transcardial con freddo 0,1 M fosfato-tamponataSaline (PBS), pH 7,5, seguito da 4% (v / peso) paraformaldeide (PFA) in PBS 0,1 M, pH 7,5 come descritto 26.
ATTENZIONE: Paraformaldeide è altamente tossico; evitare il contatto con la pelle, gli occhi o le mucose. Evitare di respirare la polvere durante la misurazione e la preparazione. - Utilizzare uno stereomicroscopio per sezionare l'orecchio interno dall'osso temporale come descritto 34, 35 senza separare vestibolare e componenti cocleari dell'orecchio interno.
- Fissare la isolato orecchio interno con 4% (peso / v) PFA in 0,1 M PBS pH 7,5 a 4 ° C per 12 ore agitando delicatamente. Lavare 3x per 5 minuti con 0,1 M PBS, pH 7,5.
- Disincrostare il campioni con acido etilendiamminotetraacetico 10% (EDTA), preparati in 0.1 M PBS pH 6,5 a 4 ° C per 10 d con agitazione costante, cambiando la soluzione di EDTA ogni 3 d.
- Quando coclee acquisire una consistenza morbida, rimuovere EDTA e lavare 3x per 5 minuti con 0,1 M PBS, pH 7,5, wiesimo agitazione a temperatura ambiente.
- Incorporare i campioni in paraffina come descritto 34 e fanno 7 micron di spessore sezioni cocleari parallele al modiolus.
- Per valutare citoarchitettura cocleare, sezioni macchia con ematossilina e eosina (H & E) 30 e utilizzare un microscopio ottico collegato ad una macchina fotografica digitale per catturare immagini con 4X e 20X lenti.
6. Cochlear espressione genica
- Pulire la superficie di lavoro e strumenti chirurgici con una soluzione di decontaminazione RNAsi.
- Euthanize il mouse come descritto in 5.1 e rapidamente sezionare l'orecchio interno dall'osso temporale, utilizzando un microscopio. Immergere l'orecchio interno in un piatto di vetro contenente acido ribonucleico protettore (RNA) e il reagente stabilizzante.
- Rimuovere la rocca petrosa rimanente con una pinza gioielliere e separare delicatamente la coclea dal vestibolo con le forbici occhio di Vanna 35.
- immediatamente trasfer la coclea in una provetta da microcentrifuga 2 con 80 la protezione e stabilizzatore soluzione microlitri RNA e congelare il tessuto posizionando il tubo in ghiaccio secco. Conserva campioni cocleari a -70 ° C fino al momento dell'uso.
- Isolamento dell'RNA cocleare come descritto 35 e determinare la qualità e la quantità spettrofotometricamente.
- Generare cDNA cocleare da uguali quantità di RNA totale mouse utilizzando un kit commerciale di trascrizione inversa.
- Eseguire qRT-PCR per amplificare acido desossiribonucleico complementare (cDNA) in triplice copia per misurare trascritti genici 35, 36.
NOTA: In questo lavoro pro- e anti-infiammatori trascritti genici di Il1b, IL-6, Tgfb1, TNFa, Il10 e Dusp1 sono stati misurati. - Calcolare rapporti espressione relativi normalizzando i livelli di soglia bersaglio ciclo trascrizione (Ct) e la media aritmetica del livello del gene di riferimento e la relativa quantificazione normalizzando ilgruppo problema livelli di trascrizione alla media aritmetica del gruppo calibratore 37.
Representative Results
Audizione è stato testato da ABR prima e al più volte dopo microchirurgia per valutare l'impatto sulla funzione uditiva (Figura 1A). Registri ABR sono stati eseguiti in anestesia per evitare di animali di movimento e tensione manufatti e quindi migliorare la sua riproducibilità 27. Intraperitoneale somministrata la chetamina base o isoflurano inalatoria sono stati solitamente utilizzato per anestetizzare gli animali durante le prove ABR. La combinazione ketamina / xylazina fornisce una (2-3 minuti) induzione breve durata d'azione e una, fase di mantenimento stabile e sicuro durante l'esecuzione di registri ABR. Va notato che isoflurano può influenzare sensibilità di misura ABR 38. Per i registri ABR, elettrodi sottocutanei sono collocati in posizioni specifiche (Figura 1B) e l'impedenza elettrica viene misurata. Se l'impedenza è 3 kOhm o superiore, posizionamento dell'elettrodo deve essere controllato per evitare altrazioni in ABR onda ampiezza.
Consegna intratympanic viene eseguita in topi da due interventi di microchirurgia (Figura 2). L'esposizione della bolla durante bullostomy comporta retrazione delle ghiandole sottomandibolari e muscolo digastrico. Questa procedura viene eseguita con estrema cura perché l'arteria carotide ed il nervo vago sono molto vicini (Figura 2A). Successivamente, la bolla è forato per localizzare l'arteria stapediale e la membrana RW (Figura 2B). Per evitare la rottura dell'osso, una piccola apertura 0,5 mm realizzato con un ago 27 G prima foratura. Il 34 G catetere viene diretto attraverso il bullostomy verso la membrana RW e un piccolo volume di veicolo è consegnato nella finestra nicchia (Figura 2C). L'iniezione transtimpanica viene eseguita attraverso un'incisione nella pars flaccida della membrana timpanica con un ago 27 G; uno più grande può provocare aorecchio nella membrana. Prima dell'iniezione, si consiglia di fare una incisione supplementare nel Tensa pars per consentire l'uscita dell'aria durante l'iniezione del veicolo (figura 2F). E 'fondamentale per evitare danni dell'arteria stapediale, un ramo della carotide interna, che porterebbe ad emorragia pericolosa per la vita.
I topi con bullostomy o transtimpanica interventi chirurgici udito tutto l'esperimento, simile ai controlli non operati (Figura 3) conservati. soglie ABR in risposta ai clic e scoppia tono non è cambiata significativamente dopo microchirurgia rispetto ai valori basali. Non sono state osservate differenze significative tra i bullostomy e gli approcci transtimpanica. studi morfologici sono stati effettuati per confermare la consegna del veicolo corretto nell'orecchio medio e per valutare i possibili cambiamenti causati dalle procedure in citoarchitettura cocleare. Nessuno dei principali cocleari regioni salterazioni morfologiche howed e animali da entrambe le procedure hanno presentato una simile morfologia di tutte le strutture cocleari (figura 4a). Inoltre, i profili cocleari per l'espressione genica di citochine pro e anti-infiammatori sono stati studiati. Nonostante la mancanza di differenze funzionali nei dati ABR tra le due procedure, bullostomy causato una risposta infiammatoria più forte rispetto all'approccio transtimpanica (Figura 4B).
Figura 1. Disegno sperimentale e valutazione dell'udito. (A) Diagramma della procedura sperimentale. Audizione è stata valutata con ABR prima e dopo la microchirurgia. campioni cocleari sono stati ottenuti 28 giorni dopo la microchirurgia. (B) topo anestetizzato in posizione prona sopra il rilievo di riscaldamento all'interno di una camera del suono di attenuazione, con elettrodo sottocutaneoes posti in cuoio tra le orecchie sopra il vertice del cranio (attivo, positivo); nella regione parotidea sotto della pinna (riferimento negativo) e nella parte posteriore (terra). L'altoparlante campo libero è posta ad una distanza fissa (5 cm) rivolto verso l'orecchio destro. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. Microchirurgia per l'applicazione del veicolo. (A) Vista ventrale della bolla timpanica. Il bullostomy viene eseguita caudale al nervo facciale con un ago 27 G. (B) e l'arteria RWN stapediale possono essere osservati attraverso la perforazione. (C) Il 34 G catetere viene diretto attraverso il bullostomy verso la nicchia RW. (D) Un mese dopo la bullostomy, un piccolo osseacicatrice è presente nel sito di apertura (freccia). (E) vista laterale dell'orecchio, mostrando l'incisione nel condotto uditivo esterno e della membrana timpanica (quadrato). (F) Particolare della membrana timpanica. Una puntura è stata fatta al quadrante superiore caudale della membrana timpanica con un 27 ago G (asterisco nero, nella pars flaccida); l'iniezione è stata fatta attraverso questo perforazione utilizzando un catetere 34 G. Un foro aggiuntivo è stato effettuato nel quadrante inferiore craniale della membrana (asterisco bianco, nel Tensa pars) prima dell'iniezione per bilanciare la pressione timpanica. (G) Veduta del G catetere 34 attraverso la puntura della membrana timpanica. (H) Veduta del cocleare regione 24 ore dopo la microchirurgia. RWN riempito con soluzione di veicolo (asterisco). Lat, laterale; Ro, rostrale; Fare, dorsale; Ma, malleus; Co, coclea; OW, finestra ovale; RWN, finestra rotonda di nicchia. Barre di scala = 200 micron in A, D, F; Barre di scala = 100 micron di B, C, H; Scala bar = 1,000 micron di E, G. prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. Audizione di valutazione. Evoluzione delle soglie ABR (media ± SEM, in dB SPL) in risposta al click (A) e Tone Burst (B) stimoli, prima e 7, 14 e 28 giorni dopo la micro-chirurgia in maschio di otto settimane di età C57BL / 6J topi. Bullostomy (arancione; n = 11); iniezione transtimpanica (blu; n = 6); non gestito (grigio; n = 11), Fate clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 4. Cochlear Morfologia e analisi di espressione genica. (A) Morfologia delle principali strutture cocleari alla base della coclea. Haematoxilin-eosina delle sezioni metà modiolar paraffina (7 micron), di orecchie da topi non operati, e topi uno mesi dopo l'intervento di microchirurgia per bullostomy o iniezione transtimpanica. Il comparto supporti Scala (a, b, c) presenta tutti i componenti principali. Dettagli di ciascuna di tali strutture (scatole numerate) sono mostrati nelle immagini successive: ganglio spirale (1), organo del Corti (2), legamento a spirale (3) e vascularis stria (4). cellule ciliate interne (asterisco); cellule ciliate esterne (testa di freccia). Barre di scala = 100 micron di a, b, c; Barre di scala = 50 micron in un-1,2,3,4. (B) l'espressione Cochlear dei marker infiammatori 28 d dopo la microchirurgia. Confronto tra bullostomy (arancione) e iniezione transtimpanica (blu) e ai topi non operati (bianco). *: Vs non operatigruppi gestite; ^: Confronto tra i gruppi gestite. Livelli di espressione genica sono rappresentati come 2 - ΔΔCt, oppure il n-fold differenza relativa al group.Values non operati vengono presentati come media ± SEM di triplicati da piscina campioni di 3 topi per ogni condizione. La significatività statistica: ** p ≤0.01; *** P ≤0.001; ^^ P ≤0.01; ^^^ P ≤0.001. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Discussion
Drug delivery locale all'orecchio interno può essere fatta direttamente per iniezione intracochlear o indirettamente dalla somministrazione intratympanic, posizionando il farmaco nell'orecchio medio 4, 19, 39. amministrazione Intracochlear fornisce controllato e preciso la somministrazione di farmaci per la coclea, evitando la diffusione attraverso le membrane delle finestre, basale-per-apicale gradienti di concentrazione e la clearance attraverso la tromba di Eustachio. Tuttavia, di solito è una procedura altamente invasiva che richiede una complessa e delicata microchirurgia 7, 39. In questo contesto, l'industria sta sviluppando nuovi, spalmati, dispositivi impiantabili per il rilascio del farmaco prolungato 40, 41. D'altra parte, la somministrazione intratympanic è una procedura minimamente invasiva e facile da eseguire che consente l'iniezione di grandi volumi del dTAPPETO nell'orecchio medio, anche se la farmacocinetica non è facile da controllare. La maggior parte del farmaco viene eliminato attraverso il tubo di Eustachio e la frazione restante deve diffondere attraverso la membrana RW per raggiungere la coclea 18. RW è il sito di massimo assorbimento delle sostanze dall'orecchio medio nel perilinfa pieno timpanica condotto della coclea 7. Si tratta di una struttura a tre strati semipermeabile, anche se la sua permeabilità dipende dalle caratteristiche farmacologiche (dimensioni, concentrazione, solubilità e carica elettrica) e di sistemi di trasporto transmembrana (diffusione, trasporto attivo o fagocitosi) 42. La finestra ovale e capsule otic sono entrate alternative, ma meno efficaci a coclea 43, 44.
Qui mostriamo e confrontare i due metodi di microchirurgia per la somministrazione mirata di droga nell'orecchio centrale del mouse: bullostomy e transtympaprocedure di iniezione nic. passaggi critici comuni a queste procedure includono: i) una valutazione dell'udito prima e dopo la microchirurgia, ii) preparazione di una soluzione di veicolo omogenea in condizioni sterili, iii) attento controllo della procedura anestetica e controllo della temperatura corporea degli animali e costanti, iv ) lento posizionamento del volume appropriato del veicolo targeting RW, e iv) il prelievo di campioni cocleari per completare l'analisi molecolare e morfologica.
Approcci retroauricolare e ventrali per bullostomy sono state descritte 7, 45. Abbiamo usato il ravvicinamento ventrale perché nella nostra esperienza ha portato a meno morbilità e ha fornito un migliore accesso al 46 RW. Iniezioni transtimpanica sono di solito effettuate attraverso la pars Tensa della membrana timpanica, anteriore o posteriore al manubrio martello 12. Inquesto lavoro abbiamo effettuato una modifica della tecnica, l'iniezione attraverso la pars flaccida là del martello con un precedente foratura aggiuntiva della Tensa pars per consentire l'evacuazione dell'aria durante l'iniezione.
L'iniezione transtimpanica era meno invasiva rispetto alla bullostomy, anche se entrambi erano microchirurgia rapida (20 e 5 minuti per orecchio per bullostomy e l'approccio transtimpanica, rispettivamente), con brevi tempi di recupero post-operatorio e non morbilità. Ancora più importante, entrambe le procedure mantenuti udienza ed i parametri ABR erano identici a quelli determinati prima della microchirurgia. L'approccio transtimpanica richiede meno tempo rispetto al bullostomy e può essere eseguita in entrambe le orecchie dello stesso animale durante lo stesso intervento. Vantaggi di iniezione transtimpanica sono così che possa essere eseguita bilateralmente e ripetuta, se necessario. D'altra parte, bullostomy fornisce accesso visivo diretto alla membrana RW e consente Filling della nicchia RW. Al contrario, l'iniezione transtimpanica non consente il controllo di stage veicolo nella nicchia RW.
Le procedure riportate in questo lavoro viene descritto come eseguire una consegna del veicolo locale di droga per l'orecchio medio per le applicazioni pre-cliniche quali la valutazione di ototossicità e valutazione di efficacia in perdita dell'udito. Due procedure di microchirurgia sono descritte che forniscono metodi alternativi con vantaggi e svantaggi specifici. Sia preservare l'udito e non causano alterazioni morfologiche. infiammazione locale è descritto come un potenziale complicazione di bullostomy. Un insieme di tecniche complementari sono anche descritti per le procedure post-chirurgiche, tra cui l'udito, le valutazioni di espressione marcatore morfologiche e infiammatorie. Le future applicazioni di queste tecniche includono la valutazione preclinica di nuove terapie per la perdita, tra cui approcci genetici, cellulari e farmacologiche udito, in modelli animali. intratympanic Administrationi garantire l'erogazione del trattamento nell'orecchio medio, a contatto con la finestra rotonde membrana, facilitando il passaggio nella perilymph senza evidenti danni cocleare.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare i genomica e le strutture non invasiva neurofunzionale di valutazione (IIBM, CSIC-UAM) per il loro supporto tecnico. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni degli spagnoli "Ministerio de Economia y Competitividad" (FEDER-SAF2014-53979-R) e l'Unione Europea (FP7-AFHELO e FP7-PEOPLE-TARGEAR) per IVN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine (Imalgene) | Merial | # 2529 | CAUTION: avoid contact of the drug with skin or eyes or accidental self-inflicted injections |
| Xylacine (Xilagesic) | Calier | # 6200025225 | |
| Lubricant eye gel (Artific) | Angelini | # 784710 | |
| Water pump | Gaymar | # TP472 | |
| Surface disinfectant | José Collado SA | # CR-36 | |
| Subdermal needle electrodes | Spes Medica | # MN4013D10SM | |
| Low Impedance Headstage (RA4LI) | Tucker-Davis Technologies | ||
| Speakers (MF1 Multi-Field Magnetic Speaker) | Tucker-Davis Technologies | ||
| System 3 Evoked Potential Workstation | Tucker-Davis Technologies | The System is composed of: RP2 processor, RA16 base station, PA5 attenuator, SA1 amplifier, MA3 microphone amplifier, RA4LI impedance headstage and RA4A medusa pre-amplifier | |
| SigGenRP software | Tucker-Davis Technologies | ||
| Warming pads (TP pads) | Gaymar | # TP3E | |
| Statistics software (SPSS) | IBM | ||
| Chitosan (deacetylated) | Sigma-Aldrich | # C3646 | |
| Acetic acid (glacial) | VWR | # 20103.295 | CAUTION: flammable liquid, skin corrosion, respiratory and skin sensitizer |
| Glycerophosphate | Sigma | # SLBG3671V | |
| Ringer´s lactate buffer | Braun | # 1520-ESP | |
| Medetomidine (Domtor) | Esteve | # 02400190 | |
| Phentanile (Fentanest) | Kern Pharma | # 756650.2 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Isoflurane (IsoVet) | Braun | # 469860 | CAUTION: Avoid exposures at ceiling concentrations greater than 2 ppm of any halogenated anesthetic agent over a sampling period not to exceed 1 h. |
| Surgical microscope (OPMI pico) | Zeiss | ||
| Sterile drape (Foliodrape) | Hartmann | # 277546 | |
| Sterilizer | Fine Science Tools | # 18000-45 | |
| Scalpel blade | Swann Morton | # 0205 | CAUTION |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | # 91003-12 | |
| Povidone iodine-based antiseptic (Betadine) | Meda Pharma SAU | # M-12207 | |
| Adventitia scissors (SAS18-R8) | S&T | # 12075-12 | |
| Curved scissors | CM Instrumente | # AJ023-18 | |
| Forceps | CM Instrumente | # BB019-18 | |
| Gelatine sponge (Spongostan) | ProNaMAc | # MS0001 | |
| Microlance 27 G | Becton Dickinson | # 302200 | |
| Microliter syringe (701 RN SYR) | Hamilton | # 80330 | |
| Catheter (Microfil 34 G) | World Precision Instruments | # MF34G-5 | |
| Tissue Adhesive (Vetbond) | 3M | # 1469SB | |
| Needle holder (Round handled needle holder) | Fine Science Tools | # 12075-12 | |
| Silk surgical suture (Braided Silk 5/0) | Arago | # 990011 | |
| Chlorhexidine (Cristalmina) | Salvat | # 787341 | |
| Pentobarbital (Dolethal) | Ventoquinol | # VET00040 | CAUTION: avoid contact of the drug with open wounds or accidental self-inflicted injections |
| Stereomicroscope (Leica) | Meyer Instruments | # MZ75 | |
| Vannas Micro-dissecting (Eye) Scissors Spring Action | Harvard Apparatus | # 28483 | |
| Jeweller’s forceps (Dumont) | Fine Science Tools | # 11252-00 | |
| RNase Decontamination Solution (RNaseZap) | Sigma-Aldrich | # R2020 | |
| RNA Stabilization Solution (RNAlater) | Thermo Fisher Scientific | # R0901 | |
| Purification RNA kit (RNeasy) | Qiagen | # 74104 | |
| cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | # 4368814 | |
| Gene expression assay (TaqMan probes) | Thermo Fisher Scientific | Il1b: Mm00446190_m1 Il6: Mm00446190_m1 Tgfb1: Mm01178820_m1 Tnfa: Mm99999068_m1 Il10: Mm00439614_m1 Dusp1: Mm00457274_g1 Hprt1: Mm00446968_m1 |
|
| Real-time PCR System (7900HT) | Applied Biosystems | # 4329001 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Merck | # 1040051000 | TOXIC: PFA is a potential carcinogen |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Merck | # 405491 | CAUTION: harmful if inhaled, may cause damage to respiratory tract through prolonged or repeated exposure if inhaled. |
| Hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | # HHS16 | |
| Eosin Y | Sigma-Aldrich | # E4382 | Hazards: causes serious eye irritation |
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