Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא

doi: 10.3791/54968 Published: December 24, 2016

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

תאי דנדריטים (DCS) הם תאי מציגי אנטיגן המקצועיים החשובים ביותר של מערכת החיסון שלנו. בשלה DCS (iDCs) מתגוררת בעור או ברקמות ריריות ולכן הם בין תאי מערכת החיסון הראשונים אינטראקציה עם פתוגנים פולשים. DCs לייצג את הגשר בין מולד במערכת החיסונית אדפטיבית 1, שכן הם יכולים להפעיל T- ו- B-cell מהתשובות הבאות זיהוי הפתוגן. יתר על כן, הם תורמים תגובות פרו-דלקתיות חיסוניות בגלל הפרשת כמויות גבוהות של ציטוקינים, כגון IL-1β, IL-6, IL-12. DCs גם להפעיל תאי NK ולמשוך תאי חיסון אחרים לאתר של זיהום על ידי chemotaxis.

DCs ניתן לחלק תאים דנדריטים בשלים (iDCs) ותאים דנדריטיים בוגרים (mDCs) 2 מבוסס על מורפולוגיה ותפקודם. לאחר ההכרה של אנטיגנים זרים על ידי אחד הקולטנים זיהוי דפוסים רבים (למשל, קולטנים דמוי אגרה, C-typeלקטינים, או משלימים קולטנים) מבוטא בשפע על פני התא, iDCs עוברים שינויים גדולים מתחילים להבשיל. במהלך תהליך התבגרות זה, קולטנים ללכוד אנטיגן למטה מוסדרים, ואילו מולקולות חיוניות מצגת אנטיגן למעלה מוסדרות 3. בוגר DCs עד להסדיר את מתחמי histocompatibility הגדולות I ו- II (MHC I ו- II), מולקולות גירוי שיתוף כמו CD80 ו CD86, שחיוניים מצגת אנטיגן והפעלה של לימפוציטים מסוג T. בנוסף, הביטוי של CCR7 הקולטן chemokine על פני התא מושרה, המאפשרת הגירה של DCs מרקמות הפריפריה אל קשרי הלימפה. ההגירה הוא הקל על ידי "גלגול" של DCs יחד ליגנד chemokine 19 (CCL19 / MIP-3B) ו -21 ליגנד chemokine (CCL21 / SLC) שיפוע לבלוטות הלימפה 4-6.

בעקבות הגירה, mDCs להציג אנטיגן מעובד כדי נאיבי CD4 + ו- CD8 + T תאים, ובכך initiating תגובה חיסונית אדפטיבית נגד הפתוגן הפולש 7. אינטראקציה זו עם תאי T של בלוטות הלימפה קשורה גם עם התפשטות הנגיף 8. מחקרים אחרים במבחנה גילו כי DCs ביעילות ללכוד ולהעביר HIV לתאי T וכי תוצאות שידור זה זיהום נמרץ 9-12. ניסויים אלו מדגישים כי DCs מנצל in vivo HIV כמו הסעות מהפריפריה אל קשרי הלימפה. במהלך מצגת אנטיגן, DCS להפריש אינטרלויקנים מפתח המעצבים את ההתמיינות של תאי עוזר מפעיל T, ולכן, התוצאה של התגובה החיסונית כולה נגד החיידק נקבעה אינטראקציה מאוד זה. מלבד סוג 1 (Th1) וסוג 2 (Th2) מפעיל תאי T, תת אחרים של התאים המסייעים CD4 + T (למשל, סוג 17 (TH17) וסוג 22 (Th22) תאי T) תוארו, ואינדוקציה שלהם פונקציה נחקרה ביסודיות. DCs יתר מעורביםהדור של תאי T רגולטוריים (Tregs) 13,14. תאים אלה הם אימונוסופרסיבי ויכולים להפסיק או למטה להסדיר אינדוקציה או התפשטות של תאי T מפעיל ועל כן הם חיוניים לפיתוח חסינות וסובלנות.

DCs קונבנציונאלי האדם (cDCs) המורכבים מכמה תת קבוצות של תאים עם ממוצא מיאלואידית (כלומר, תאים לנגרהנס (LCS) ואת עורי DCs ביניים) או ממוצא הלימפה (כלומר, DCs plasmacytoid (PDC)). בניסויים במבחנה או אסטרטגיות חיסון DC, DCS-derived מונוציטים משמש באופן שגרתי כמודל DCs העור. תאים אלו מראים דמיון בפיזיולוגיה, מורפולוגיה, ותפקוד התאים הדנדריטים מיאלואידית קונבנציונאלי. הם מופקים על ידי תוספת של interleukin 4 (IL-4) ו גרנולוציט-מקרופאג גורם מגרה המושבה (GM-CSF) כדי מונוציטים מבודד מתורמים בריאים 12,15-18. תאי דנדריטים יכולים גם להיות מבודדים ישירות ביופסיות עורי או ברירית, או יכולים אפילו בדואר התפתח CD34 + ובתאי hematopoietic המבודדים דגימות דם חבל הטבור השיגו ברחם לשעבר. הנה, אנחנו מדגימים איך מונוציטים מבודדות מגורה מדם אדם אנטי-קרוש לאחר תא דם היקפיים mononuclear (PBMC) והעשרה על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. לאחר הדגירה במשך 5 ימים, מונוציטים אדם בתנאים מסוימים הם מובחן לתוך iDCs והם מוכנים פרוצדורות בסביבה הלא-קלינית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

הצהרת אתיקה: נכתבה הסכמה מהדעת התקבלה כל תורמי הדם המשתתפות ידי המכון המרכזי עירוי דם & חיסוני מח', אינסברוק, אוסטריה. שימוש דגימות שאריות אנונימי למטרות מדעיות אושר על ידי ועדת האתיקה של האוניברסיטה לרפואה של אינסברוק.

1. עשיית עושר של תאי הדם ההיקפי mononuclear (PBMCs)

  1. ריכוז של PBMCs ידי צנטריפוגה.
    1. פתח את חבילת דם לדם פיצול צינורות צנטריפוגות סטרילי 50 מ"ל פי כמות הדם שהתקבלו.
    2. במידת הצורך, להתאים את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם פוספט שנאגרו מלוחים של Dulbecco סטרילי (D-PBS).
    3. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא הבלם.
    4. צייר את השכבה העליונה המכיל פלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את boundarשכבת y באין מפריע.
      הערה: אם פלזמה עצמית במקום FCS משמשת כדי להשלים את מדיום התרבות, הפלזמה יש לאסוף חום מומת בשלב זה.
    5. אוספים את התאים mononuclear (שכבות גבול) משני צינורות 50 מ"ל צנטריפוגות ולהעביר אותם לתוך צינור מ"ל אחד סטרילי 50 בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי.
    6. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור באמצעות D-PBS סטרילית.
    7. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות ב RT ללא בלם.
    8. צייר את השכבה העליונה המכילה את הפלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את שכבת הגבול באין מפריע.
    9. אוספים את התאים mononuclear (שכבות גבול) מן הצינורות צנטריפוגות 50 מ"ל ולהעביר אותם לשתי צינורות סטרילי 50 מ"ל אוסף בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי.
    10. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם D-PBS סטרילית.
  2. הַפרָדָהשל PBMCs על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות (איור 1).
    1. הכן ארבעה צינורות 50 מ"ל ו פיפטה 15 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות לתוך צינור אחד.
    2. קח 25 מ"ל של תאים ונקווה / דם מהצינור אוסף (שלב 1.1.10) ובזהירות כיסוי המדיום שיפוע צפיפות.
    3. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 700 XG במשך 30 דקות ב RT ללא בלם.
  3. איסוף וטיהור של PBMCs.
    1. צייר את השכבה העליונה המכילה את הפלזמה וטסיות בעזרת פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל סטרילי, עוזב את שכבת PBMC באין מפריע.
    2. אסוף את שלבי PBMC מכל צינורות לרכז את התאים שני צינורות סטרילי 50 מ"ל בעזרת פיפטה סרולוגיות 25 מ"ל סטרילי.
    3. כוון את עוצמת הקול ל -50 מ"ל לכל צינור עם D-PBS סטרילית. מניחים את צינורות לתוך צנטריפוגות ספין אותם ב 400 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
    4. לשאוב את supernatant מחדש להשעות אתתאי D-PBS סטרילית. פינת התאים משני צינורות ולהתאים את עוצמת הקול עד 50 מ"ל עם D-PBS סטרילית.
    5. מניחים את הצינורות לתוך בצנטריפוגה ספין אותם ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
    6. לשאוב את supernatant מחדש להשעות את התאים D-PBS סטרילית. כוון את עוצמת הקול עד 50 מ"ל עם D-PBS ו פיפטה סטרילית 50 μl כדי צינור 1.5 מ"ל המכיל 450 μl של D-PBS.
    7. וורטקס הצינור 1.5 מ"ל במרץ לספור את התאים בתא נויבאואר או כל מכשיר ספירת תאים אחרים.
    8. מניחים את צינורות 50 מ"ל לתוך בצנטריפוגה ספין אותם ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.

בידוד 2. של מונוציטים ידי אנטי אנושי CD14 מגנטי חלקיקים

  1. תיוג של PBMCs עם חלקיקים מגנטיים.
    1. התאם את הריכוז PBMC עד 8 x 10 מ"ל 7 תאים / באמצעות חיץ בידוד.
    2. וורטקס חלקיקים מגנטיים אנטי אנושי CD14 thoroughly ולהוסיף 50 μl של חלקיקים עבור כל 1 x 10 7 PBMCs.
    3. מערבבים את ההשעיה-חלקיק תא ביסודיות דגירה אותו ב RT במשך 30 דקות.
  2. ההפרדה של שברים חיוביים ושליליים.
    1. התאם את הווליום עד 12 מ"ל באמצעות חיץ בידוד.
    2. הכן שישה צינורות סטרילית מסביב לתחתית פיפטה 2 מיליליטר של השעית תא-חלקיקים לתוך צינור אחד.
    3. מיד למקום את הצינורות על המגנט. דגירה אותם במשך 10 דקות ב RT.
    4. שמור את הצינורות על המגנט ובזהירות לצייר את supernatant. Supernatant מכיל את החלק היחסי שלילית.
    5. הסר את הצינור מתוך המגנט ולהוסיף 2 מ"ל של חיץ בידוד.
    6. בעדינות מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    7. מניחים את הצינורות בחזרה על המגנט. דגירה במשך 5 דקות ב RT.
    8. שמור את הצינורות על המגנט ובזהירות לצייר את supernatant. Supernatant מכיל את החלק היחסי שלילית.
    9. הסר את הצינורות מן מגנט ומוסיפים 2 מ"ל של חיץ בידוד צינור אחד. בעדינות מחדש להשעות את התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה.
    10. העברת חלק חיובי לצינור 50 מ"ל סטרילי ולהתאים את עוצמת הקול ל -50 מ"ל באמצעות D-PBS סטרילית.

3. גירוי של מונוציטים מבודדים עם IL-4 ו- GM-CSF

  1. מניחים את הצינור לתוך צנטריפוגות ומסובב אותו ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
  2. לשאוב supernatant מחדש להשעות את התאים 50 מ"ל של D-PBS.
  3. פיפטה 50 μl לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 450 μl של D-PBS. וורטקס הצינור 1.5 מ"ל במרץ לספור את התאים בתא נויבאואר או מכשיר ספירת תאים אחרת.
  4. מניחים את הצינור 50 מ"ל לתוך צנטריפוגות ומסובב אותו ב 400 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C עם הבלם.
    הערה: אם חלק שלילי, המכיל לימפוציטים מדם היקפי (PBLs), נדרש גם, לבצע שטיפה ועוד היד נטויה צעדים דומים ל- tצינור של החלק החיובי (שלבי 3.1-3.5).
  5. התאם את הריכוז התא 1 x 10 6 / מ"ל עם המדיום תרבות מחומם מראש (בינוני RPMI 1640 בתוספת 10% חום מומת FBS ו 1% פתרון L-גלוטמין) ו פיפטה 3 מ"ל / גם לתוך 6 צלחות היטב.
    הערה: אם אתה משתמש פלזמה עצמית חומה מומת, להחליף את FCS 10% עם 1-5% פלזמה עצמית, על פי ניסיוני ההגדרה.
  6. לעורר את מונוציטים עם-4 IL אנושי רקומביננטי (250 U / ml) ו- GM-CSF אנושי רקומביננטי (1,000 U / ml) על ידי pipetting הציטוקינים ישירות לתוך המדיום תרבות. לדגור על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2.
  7. Re-לגרות את התאים עם IL-4 (250 U / ml) ו- GM-CSF (1000 U / ml) לאחר 48 שעות על ידי pipetting הציטוקינים ישירות לתוך מדיום התרבות.
    הערה: אם קיימים סימני ההחמצה שמוצגים על ידי אינדיקטור pH בטווח הבינוני, להחליף מחצית הבינונית עם מדיום התרבות מחומם מראש.
  8. קציר אינו בוגר תאים דנדריטים ביום 5 עבורמטה-זרם ניסויים על ידי pipetting תאים בתרבית מתוך צלחת 6-היטב לתוך צינור צנטריפוגה 50 מ"ל לאחר pipetting בינוני התרבות למעלה ולמטה כמה פעמים.
  9. ספירת התאים להכתים מדגם של מונוציטים מבודד עם נוגדנים אנטי אנושי נגד CD11b, CD11c, ו- DC-כניסה / CD209, יחד עם צבע כדאיות התא. כדי למנוע מחייב נוקבים של נוגדנים במהלך מכתים משטח, השימוש קולטן Fc חוסם ריאגנטים או אלבומין בסרום שור (BSA) מאגרים מומלץ מאוד.
  10. לנתח את המדגם באמצעות צבע כדאיות התא, על פי פרוטוקול של היצרן, על ידי ביצוע cytometry זרימה כדי להעריך את טוהר הכדאיות של iDCs שנוצר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

לאחר צנטריפוגה של דם קרוש אנטי באמצעות כרית סוכרוז, תאי הדם היקפיים mononuclear (PBMCs) מועשרים בתוך שלבים על גבי מדיום שיפוע צפיפות (איור 1). לאחר PBMCs נמשכים לסירוגין, ניתוח FACS מתבצע על מנת לאפיין את אוכלוסיות תאים שונות בתוך PBMCs באמצעות סמנים השושלת (למשל, CD3 עבור לימפוציטים מסוג T, CD14 עבור מונוציטים, ו CD19 עבור לימפוציטים מסוג B). איור 2 א מראה את התוצאות של ניתוח FACS נציג PBMCs שנאספו ומוכתמת לאחר צנטריפוגה שיפוע צפיפות. מתוך האוכלוסייה המגודרת (איור 2 א, עלילה עליונה), זיהינו לימפוציטים 4.03% B, 28.20 מונוציטים%, ותאים אחרים 67.62% (איור 2 א, עלילה באמצע), מתוכם 43.62% היו לימפוציטים מסוג T (איור 2 א, עלילה נמוכה ).

PBMCs מודגרת אז wחלקיקים מגנטיים ה- i CD14, ובעקבות דגירה על מגנט, השבר השלילי המכיל לימפוציטים מדם ההיקפיים (PBLs) מנותחים על ידי FACS בשיטת המיון של סמני שושלת הנ"ל. לעומת PBMCs, מדדנו באחוזים דומים של לימפוציטים מסוג B (4.65%, איור 2B, עלילה באמצע), שיעור גבוה יותר של תאים אחרים (88.61%, איור 2B, עלילה באמצע), ובאחוזים מופחתים מאוד של מונוציטים (6.59%, איור 2B , העלילה באמצע). אפיון של השבר החיובי (איור 3) הפגין יעילויות הפרדה גבוהות, שכן את הטוהר של התאים המבודדים הוא מעל 97% (איור 3, עלילה שמאלית), מתוכם 99.56% (איור 3, עלילה מימין) הביע רמות גבוהות של CD14 על פני התא.

IL4 ו- GM-CSF גירוי של מונוציטים במשך 5 ימים התוצאה היא בידול לתוך תאים דנדריטים הנגזרות מונוציטיםים, אשר דומים עורי תאים דנדריטים במורפולוגיה, התנהגות, וביטוי קולטן 19. ניתוח FACS של תאי דנדריטים נגזרים מונוציטים ביום 5 מראה אוכלוסייה הומולוגית (איור 4, הורישה את חלקה) מבטאי רמות גבוהות של CD11b, CD11c (לא מוצג), ואת C-סוג לקטיני DC-הכניסה. אין ביטוי CD83 סמן התבגרות DC מזוהה (איור 4, נכון עלילה), ותאים שיאבדו את CD14 סמן מונוציטים (לא מוצג).

איור 2
איור 1: הפרדת מרכיבי הדם על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. PBMCs מועשר בתוך שלבים על גבי מדיום ההפרדה על ידי צנטריפוגה שיפוע צפיפות. שכבות לפני (משמאל) ואחרי (מימין) צנטריפוגה מוצגות. אנאלחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2
איור 2: תזרים cytometric מנתח של PBMCs (א) ו PBLs (B). (א) PBMCs נקצר, מוכתם עבור סמני שושלת (עכבר-אנטי אנושי CD3, CD14, ונוגדני CD19), ונותח על ידי cytometry זרימה. מגרשים דוט של תוצאת נציג מוצגים. (ב) החלק השלילי המכיל PBLs מאופיין סמני שושלת (עכבר-אנטי אנושי CD3, CD14, CD19 ו נוגדנים) ונותח על ידי cytometry זרימה. מגרשים דוט של תוצאת נציג מוצגים. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3

איור 4
איור 4: תזרים cytometric מנתח של תאים דנדריטים הנגזרות מונוציטים. מונוציטים הם מגורה במשך 5 ימים עם IL4 ו- GM-CSF ו מוכתם עבור סמנים אופייניים DC, כמו CD11b, CD11c (לא מוצג), לקטינים C מסוג DC-כניסה, ואת CD83 סמן התבגרות. מגרשים דוט של תוצאת נציג מוצגים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

פרוטוקול זה מתאר את הדור של תאים דנדריטים הנגזרות מונוציטים (MDDCs) דרך הבידוד של מונוציטים האדם מדם קרוש אנטי באמצעות assay מבוססי ננו-חלקיקים מגנטיים. בפרוטוקול זה, השלבים צנטריפוגה מבוצעים זרם הליך בידוד תא, מה שמוביל העשרת שבר PBMC. למרות שתאים הם אבדו במהלך צנטריפוגה, כדי כיסוי התוכן של חבילת דם מלאה על מדיום שיפוע צפיפות ידרוש 200-300 מיליליטר של מדיום מפל צפיפויות ולכן אינו יכול להיחשב עלות יעילה. בנוסף, להעשרת PBMCs ידי תוצאות צנטריפוגה באוכלוסייה תא מנקה, אשר השפעה חיובית על עיקול נכסי חלקיקים מגנטיים אנטי אנושי CD14 במהלך תהליך הבידוד. בידוד מגנטי ננו-חלקיקים של תוצאות מונוציטים בקרב אוכלוסיה מונוציטים קיימא, אשר ניתן להשתמש בהם עוד לבידול במבחנה תת או מקרופאגים שונים DC.

= "Jove_content"> יתרונות של טכניקה זו לעומת פרוטוקולים אחרים השתמשו בעבר, כמו טיהור בתיווך דבקות על תרביות רקמה או צלחות פלסטיק מצופה ג'לטין, הם הטוהר הגבוה ההומוגניות של אוכלוסיית התאים הבודדה, כמו גם את הנוחות ומהירות. באופן כללי, חשוב לעבוד במהירות אך ביסודיות כשעובדים עם תאים כדי להימנע מחשיפה ממושכת בתנאים הלא פיזיולוגי. החלקיקים המגנטיים אנטי אנושי CD14 בשימוש בפרוטוקול זה מותאם במיוחד את הבחירה או דלדול חיובית של לויקוציטים נושאי CD14; ולכן, החלקיקים המגנטיים ישירות לאגד את התאים של עניין ולא יוסרו לאחר ההליך. זה יכול להיות בעיה כי החוקרים להתייחס לפני בניסויים מסוימים או ניתוחים מבוצעים, שכן תוצאות עלולות להיות מושפעות או הוחלפו על ידי חלקיקים מגנטיים כלוא. לחלופין, מבחני סלקציה שליליים זמינים, אשר נועדו לרוקן תאים לא רצויים וכדי kEep התאים של עניין ללא פגע. עבור הדור של MDDCs, חלקיקים מגנטיים אנטי אנושי CD14 המשמש לבודד מונוציטים להציג שום סיבוך, משום שבעת בידול לתוך MDDCs, מונוציטים מגורה ציטוקינים למטה להסדיר את הקולטן CD14. לפיכך, החלקיקים המגנטיים מוסרים ללא elution נוסף או נהלי ניתוק, ואת MDDCs נבדק שלילי לביטוי הקולטן CD14 על ידי cytometry זרימה. מאז בינוני התרבות המכיל FCS משמש במהלך ההתמיינות בפרוטוקול זה, MDDCs שהושג כאן הם לשימוש מחקרי בלבד. לקבלת MDDCs במסגרות קליניות, חומרי הדפסה מיוחדים ללא צורך בסרום פותחו. בנוסף, פלזמה עצמית ניתן לאסוף לאחר שלב צנטריפוגה הראשון (שלב 1.1.4), חום מומת, והשתמש במדיום התרבות. מלבד פלזמה עצמית, מפלזמה אנושית-זמינה מסחרי ניתן גם להוסיף עד בינוני התרבות להימנע תגובתיות רקע אפשריות מבחנים לטווח ארוך בשל Xenogenחלבונים EIC ב FCS.

לחלופין, תאי דנדריטים ניתן לבודד ישירות עורי או ביופסיות ברירית או ניתן לפתח מ CD34 + ובתאי hematopoietic המבודדים דגימות דם חבל הטבור השיגו ברחם לשעבר.

אף על פי כן, MDDCs הוא המודל בשימוש הנרחב ביותר עבור תאים דנדריטים, מאז הבידוד הישיר של DCs ביופסיות מורכב יותר לבצע. זה גם יכול להוביל מספרים סלולריים לא יעילים כי לעתים קרובות להשתנות עקב הבדלים באיכות התורמת. בעיות דומות עלולות להתרחש כאשר DCs נוצרות מתאי CD34 + גזע שבודדו מדם טבורי.

ביישומים עתידיים, תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs) יכולים לשמש במקום בידוד חרוז-מגנטי CD14 של מונוציטים מדם. היתרונות של השימוש iPSCs הם כי לא רק תת DC, אבל כל התאים hematopoietic של עניין, יכול להיווצר מתורם אחד (תאי T, תאי B, ו- C NKאמות) וכי iPSCs המטופל ספציפי יכולים לשמש כדי לאפיין את יחסי הגומלין של תאים חיסוניים עצמיים באופן אישי.

השלב הקריטי ביותר במהלך הבידוד של מונוציטים הוא צעד צנטריפוגה שיפוע צפיפות, מאז פרידה המדויקת של תאי דם האדומים ולבנים מושג רק כאשר הבלם של צנטריפוגות כבוי. זו קובעת את התוצאה של יעילות הבידוד למטה-זרם.

לסיכום, פרוטוקול זה הוא בצורה מאוד מהירה, יעילה וחסכונית כדי ליצור אוכלוסיית תאים דנדריטיים הנגזרות מונוציטים קיימא הומוגנית דרך הבידוד של מונוציטים האדם מדם נגד קרוש.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 BD Biosciences 555415
APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e BD Biosciences 551073
BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles BD Biosciences 557769
BD Imagnet BD Biosciences 552311
BSA (Albumin Fraction V) Carl Roth EG-Nr 2923225
Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates Costar 3506
Density gradient media: Ficoll-Paque Premium GE Healthcare Bio-Sciences 17-5442-03
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) Sigma-Aldrich D8537
Falcon 10 ml Serological Pipet Corning 357551
Falcon 25 ml Serological Pipet Corning 357525
Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube Corning 352070
Falcon Round-Bottom Tubes Corning 352054
FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a BD Biosciences 555339
Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) Tonbo biosciences 13-0870
GM-CSF MACS Miltenyi Biotec 130-093-862
Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) Gibco 10500-064
Hettich Rotanta 460R Hettich ---
IL-4 CC PromoKine C-61401
Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) BD Biosciences 552362
L-Glutamine solution Sigma-Aldrich G7513
Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin VWR 211-0015
PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 BD Biosciences 555398
PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 BD Biosciences 551265
RPMI-1640 medium Sigma-Aldrich R0883
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 Invitrogen 15575020

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  2. Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
  3. Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
  4. Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
  5. Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
  6. Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
  7. Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
  8. Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
  9. Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
  10. McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
  11. Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
  12. Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
  13. Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
  14. Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
  15. Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
  16. Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
  17. Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
  18. Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
  19. Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
דור של תאי דנדריטים אדם נגזר מונוציטים מן הדם מלא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).More

Posch, W., Lass-Flörl, C., Wilflingseder, D. Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood. J. Vis. Exp. (118), e54968, doi:10.3791/54968 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter