Introduction
树突细胞（DC）是免疫系统中最重要的专门的抗原呈递细胞。未成熟DC（iDC中）驻留在皮肤或粘膜组织，因此是所述第一免疫细胞与入侵的病原体相互作用之间。的DC代表先天和适应性免疫系统1之间的桥梁，因为它们可激活下列病原体检测T细胞和B细胞反应。此外，它们有助于由于大量的细胞因子，如IL-1β，IL-6，和IL-12的分泌的促炎性免疫应答。 DCS还可以激活NK细胞，并吸引其他免疫细胞对感染的趋化网站。
的DCs可分为未成熟树突状细胞（iDC中），并根据它们的形态和功能的成熟树突状细胞（的mDC）2。由（许多模式识别受体之一例如 toll样受体，C型识别外来抗原的后凝集素，或补体受体）在细胞表面上大量表达，将iDC发生重大的变化，并开始成熟。在此成熟过程中，受体抗原捕获被下调，而对于抗原呈递必需分子被上调3。成熟DCs上调主要组织相容性复合物I和II（MHC I和II），共刺激分子象CD80和CD86，这对于T淋巴细胞的抗原呈递和活化所必需的。此外，在细胞表面上的趋化因子受体CCR7的表达被诱导，这使得DC的从外周组织至淋巴结的迁移。迁移由沿趋化因子配体19（CCL19 / MIP-3b）的与趋化因子配体21（CCL21 / SLC）梯度到淋巴结4-6 DC的“滚动”促进。
移植完成之后，MDC在目前的处理抗原天真的CD4 +和CD8 + T细胞，从而INItiating对抗入侵病原体7适应性免疫应答。这与在淋巴结的T细胞相互作用也与病毒8的传播有关。 其他体外研究表明，树突有效地捕捉和HIV一场轰轰烈烈的感染9-12转移到T细胞和这个传输的效果。这些实验强调， 在体内的HIV攻击的DCs作为从外围到淋巴结梭。期间抗原呈递树突分泌塑造效应T辅助细胞的分化，并且因此，对微生物的整个免疫反应的结果，在这个非常相互作用判定键白细胞介素。除了1型（Th1细胞）和2型（Th2细胞）的效应T细胞，已经描述的 CD4 + T辅助细胞（ 例如，类型17（Th17细胞）和类型22（TH22）T细胞）的其他子集，以及他们的诱导和功能已经被彻底调查。区议会进一步参与产生调节性T细胞（Treg细胞）13,14。这些细胞具有免疫抑制作用，可以停止或下调诱导或效应T细胞的增殖，因而制定免疫力和宽容的关键。
人类传统的DC器（CDC）包括细胞几种亚型与骨髓来源（即朗格汉斯细胞（LCS）和真皮和间质的DC）或淋巴来源（即浆的DC（pDC细胞））。对于体外实验或DC疫苗接种策略，单核细胞衍生的DCs被常规用作用于皮肤的DCs的模型。这些细胞显示在生理，形态和功能与常规骨髓树突状细胞的相似性。它们通过加入白介素-4（IL-4）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）与来自健康供体12,15-18分离的单核细胞产生的。树突细胞也可以直接从皮肤或粘膜活检分离，或可以甚至bE从CD34 +从获得的子宫外脐带血样本中分离出的造血祖细胞的发展。在这里，我们证明单核细胞是如何分离和密度梯度离心的外周血单核细胞（PBMC）富集之后，从抗凝固的人血的刺激。培养5天后，在特定条件下的人单核是分化成的iDC，并准备用于在非临床环境实验程序。
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Protocol
伦理学声明：书面知情同意从所有参与献血中央研究所输血与免疫学系，奥地利因斯布鲁克获得。使用匿名剩余标本用于科学目的的批准因斯布鲁克医科大学伦理委员会。
1.富集外周血单个核细胞（PBMC中）
- 通过离心外周血单个核细胞的浓度。
- 根据血液中收到的金额开血包和分裂的血液在无菌的50ml离心管中。
- 如果需要的话，调节音量至50ml对于每个管，用无菌的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（D-PBS）中。
- 管放入一个离心机并在400 xg离心无制动旋转它们在室温（RT）下15分钟。
- 抽出用10ml无菌血清吸管含有血浆和血小板的上层，留下boundary层的干扰。
注意：如果自体血浆代替FCS的用于补充培养基中，等离子体必须收集并在此步骤中热灭活。 - 从两个50毫升离心管中收集的单核细胞（边界层），并使用10ml无菌血清吸管将其转移到一个无菌的50ml管中。
- 调节音量至50ml，使用无菌的D-PBS每个管。
- 管放入一个离心机，并在室温在400 xg离心旋转他们15分钟无制动。
- 抽出含有用10ml无菌血清吸管，而使边界层不受干扰的血浆和血小板的上层。
- 从50ml离心管中收集的单核细胞（边界层），并转移到用10ml无菌血清吸管疏导50毫升收集管。
- 调节音量至50ml对于每个管，用无菌的D-PBS中。
- 分割通过密度梯度离心的PBMC（图1）。
- 准备密度梯度介质的四五十毫升管和吸管15毫升到每个试管中。
- 需要25毫升汇集细胞/血液从收集管（步骤1.1.10），并小心地覆盖密度梯度介质。
- 管放入一个离心机，并在室温以700 xg离心旋转他们30分钟无制动。
- 收集和外周血单个核细胞的纯化。
- 抽出含有用10ml无菌血清吸管的血浆和血小板，留下PBMC层不受干扰上层。
- 收集所有的管子相间PBMC并用无菌25毫升血清吸管集中细胞有两种无菌50ml试管。
- 调节音量至50ml对于每个管，用无菌的D-PBS中。管放入一个离心机并在400 xg离心在4℃下与制动旋转他们15分钟。
- 吸出上清液并重新悬浮细胞在无菌的D-PBS。汇集来自两个管中的细胞，并调节音量至50ml，用无菌的D-PBS中。
- 管放入离心机并在400 xg离心在4℃下与制动旋转他们10分钟。
- 吸出上清液并重新悬浮于无菌的D-PBS中的细胞。调节音量至50ml，用无菌的D-PBS和吸管50微升含有450微升的D-PBS的1.5ml试管。
- 涡1.5 ml管大力和计数在纽鲍尔室或任何其他细胞计数仪细胞。
- 在50ml试管放入离心机并在400 xg离心在4℃下与制动旋转他们10分钟。
2.分离单核细胞的通过抗人CD14的磁颗粒
- 与磁性粒子外周血单个核细胞标记。
- 调整PBMC浓度使用隔离缓冲器8×10 7细胞/ ml。
- 涡旋抗人CD14磁性粒子thoroughly和加入50微升的颗粒，每1×10 7外周血单个核细胞。
- 彻底混合细胞颗粒悬浮液，并在室温下孵育它为30分钟。
- 正和负级分的分离。
- 调节音量使用隔离缓冲区12毫升
- 制备细胞颗粒悬浮六无菌圆底管和移液管2毫升到每个管中。
- 立即放置在磁体的管中。孵育它们在室温10分钟。
- 保持磁铁管并仔细清除表面。上清液中含有的阴性部分。
- 从磁铁取出管加2ml分离缓冲。
- 通过上下吹打轻轻重新悬浮细胞。
- 放置管背面上的磁铁。在室温下孵育5分钟。
- 保持磁铁管并仔细清除表面。上清液中含有的阴性部分。
- 从磁体取出管和加2ml隔离缓冲液到每个管中。通过上下吹打轻轻重新悬浮细胞。
- 转移阳性分数到无菌的50ml管中，并调整体积至使用无菌的D-PBS为50ml。
3.隔离单核细胞的刺激与IL-4和GM-CSF
- 放置管进入离心机并在400 xg离心在4℃下与制动旋转它10分钟。
- 吸出上清液并重新悬浮细胞在50毫升的D-PBS中。
- 吸管50微升到含有450微升的D-PBS的1.5ml试管。涡1.5 ml管大力和计数在纽鲍尔室或其他细胞计数仪细胞。
- 放置50毫升管进入离心机并在400 xg离心在4℃下与制动旋转它10分钟。
注：如果阴性部分，含有外周血淋巴细胞（PBL），也是必需的，进行洗涤及数量的步骤类似于t阳性部分的软管（步骤3.1-3.5）。 - 调节细胞浓度为1×10 6个 / ml的带预热的培养基（补充有10％热灭活FBS和1％L-谷氨酰胺溶液的RPMI 1640培养基）和移液器为3ml /孔到6孔平板上。
注意：如果使用热灭活的自体血浆，替换1-5％自体血浆的10％FCS，根据实验设置。 - 通过直接吹打细胞因子至培养基用重组人IL-4（250 U / ml）和重组人GM-CSF（1000单位/毫升）刺激单核细胞。在37℃和5％的CO 2。
- 通过直接吹打细胞因子至培养基中重新刺激与IL-4（250 U / ml）和GM-CSF（1000U / ml）的细胞后48小时。
注意：如果存在由在介质中的pH指示剂所示酸化的任何迹象，预热培养基替换一半培养基。 - 收获未成熟树突状细胞在第5天进行下游吹打培养细胞进行的6孔板和到50毫升离心管中向上吸取培养基后和向下几次实验。
- 计数细胞并染色用抗CD11b的，CD11c的抗人抗体中分离单核细胞的样品，和DC-SIGN / CD209，具有细胞活力染料一起。为了避免表面染色过程中的非特异性的抗体的结合，强烈建议封闭试剂或牛血清白蛋白（BSA）的缓冲区的使用Fc受体的。
- 分析使用细胞生存力染料样品，根据生产商的方案，通过进行流式细胞术来评估所产生的iDC的纯度和生存能力。
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Representative Results
的使用蔗糖缓冲抗凝血离心分离后，外周血单核细胞（PBMC）富集在密度梯度介质（ 图1）的顶部的相间。在PBMC中被抽出后，被执行以使用谱系标志物的PBMC中（ 例如，CD3对T淋巴细胞，CD14为单核细胞和CD19为B淋巴细胞）中表征不同细胞群体的FACS分析。 图2A示出了收集和密度梯度离心后染色的PBMCs的代表性FACS分析的结果。出选通人口（ 图2A，上图）的，我们检测到4.03％的B淋巴细胞，28.20％的单核细胞，和67.62％的其它细胞（ 图2A，中间图），其中43.62％为T淋巴细胞（ 图2A，下面的曲线）。
外周血单个核细胞，然后孵育W¯¯第i个CD14磁性颗粒和，承接上的磁体孵育，含有外周血淋巴细胞（PBL）的负级分是通过使用上述的谱系标记物的选择FACS分析。相比于外周血单个核细胞，我们测量B淋巴细胞（4.65％， 图2B，中图）类似的百分比，其他细胞的比例较高（88.61％， 图2B，中图），并极力减少单核细胞百分比（6.59％， 图2B ，中图）。阳性部分（ 图3）的特性表现出了高的分离效率，因为分离的细胞的纯度为97％以上（ 图3，左曲线），的其中99.56％（ 图3，右曲线）表达高水平CD14的于细胞表面上。
5天的单核细胞的IL4和GM-CSF的刺激导致分化成单核细胞来源的树突状细胞s，这是相当于真皮形态，行为和受体表达19的树突细胞。在第5天单核细胞衍生的树突状细胞的FACS分析显示了同源种群（ 图4，左边曲线）表达高水平的CD11b，CD11c的（未示出），和C型凝集素DC-SIGN的。的DC成熟标志物CD83不表达，检测（ 图4，右侧图），和细胞也失去了单核细胞标记物CD14（未示出）。
图1：通过密度梯度离心的血液成分的分离。的PBMC富集上通过密度梯度离心分离介质的顶部的相间。前（左）和后（右）的离心分离层被示出。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：外周血单个核细胞（A）和外周血淋巴细胞（B）的流式细胞仪分析。 （A）中的PBMC收获，染色谱系标记物（小鼠抗人CD3，CD14，和CD19抗体），并通过流式细胞术进行分析。有代表性的结果的散点图所示。 （B）含的PBL的负级分的特征在于谱系标记物（小鼠抗人CD3，CD14，和CD19抗体），并通过流式细胞术分析。有代表性的结果的散点图所示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 单核细胞衍生的树突状细胞的流式细胞仪分析。单核细胞被刺激5天与IL4和GM-CSF和染色特性的DC标记，像的CD11b，CD11c的（未示出），C型凝集素DC-SIGN和成熟标记物CD83。有代表性的结果的散点图所示。
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Discussion
这个协议描述通过使用磁性纳米微粒测定从抗凝固的血人单核细胞的分离单核细胞来源的树突细胞（MDDCs）的产生。在这个协议中，在离心步骤上游的细胞分离方法，这导致PBMC部分的富集进行。虽然细胞离心过程中丢失，叠加密度梯度介质上的全血包的内容将需要200-300密度梯度培养基中，因此不能被认为是成本有效的。此外，的PBMC通过在清洁的细胞群，在分离过程产生积极影响的抗人CD14磁性颗粒的附着离心结果富集。的单核细胞的结果在一个可行的单核细胞群，其可以进一步用于体外分化成各种DC亚群或巨噬细胞的磁性纳米粒子的隔离。
可替代地，树突状细胞可以直接从皮肤或粘膜活检分离，或者可从CD34 +从获得的前子宫脐带血样品中分离出的造血祖细胞来开发。
尽管如此，MDDCs是树突状细胞中最广泛使用的模型中，由于DC的从活检直接分离是更复杂的执行。它也可以导致效率低下的细胞数，往往会发生变化，由于在供体质量的差异。当区议会从脐带血中分离CD34 +干细胞生成，可能会发生类似的问题。
为未来的应用，可诱导的多能干细胞（iPS细胞）可被用来代替从血液单核细胞的CD14磁性珠分离。使用的iPSC的优点是不仅DC亚群，但所有感兴趣的造血细胞，可以从一个供体产生的（T细胞，B细胞和NKÇ厄尔）和患者特异性iPSCs的可用于表征在个性化的方式自体免疫细胞的相互作用。
单核细胞的分离过程中最关键的步骤是在密度梯度离心步骤中，由于当离心机的闸被关闭的红，白血细胞的精确分离，才能达到。这决定了下游分离效率的结果。
总之，这个协议是产生通过人体单核细胞，从抗凝固的血中分离的可行且均匀的单核细胞来源的树突细胞群的非常快速，高效，并且经济有效的方式。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
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