Introduction
Dendritiske celler (DC'er) er de vigtigste specialiserede antigenpræsenterende celler i vores immunsystem. Umodne DCs (IDCS) bor i huden eller i slimhindevæv og er derfor blandt de første immunceller til at interagere med invaderende patogener. DC'er repræsenterer bro mellem det medfødte og det adaptive immunsystem 1, da de kan aktivere T- og B-celle-responser efter påvisning af patogener. Endvidere bidrager de til pro-inflammatoriske immunresponser på grund af udskillelse af store mængder af cytokiner, såsom IL-1β, IL-6 og IL-12. Udviklingslandene aktiverer også NK-celler og tiltrække andre immunceller til stedet for infektion med kemotaksi.
DC'er kan opdeles i umodne dendritiske celler (IDC'erne) og modne dendritiske celler (MDC'er) 2 baseret på deres morfologi og funktion. Efter anerkendelse af fremmede antigener af en af de mange mønstergenkendelse receptorer (f.eks toll-lignende receptorer, C-typelectiner, eller komplement receptorer) rigeligt udtrykt på celleoverfladen, IDC'erne undergå store forandringer og begynder at modnes. Under denne modningsproces, er receptorer for antigen capture nedreguleres, hvorimod molekyler er essentielle for antigenpræsentation er opreguleret 3. Modne DC'er opregulere major histocompatibility-komplekser I og II (MHC I og II), co-stimulerende molekyler såsom CD80 og CD86, som er essentielle for antigenpræsentation og aktivering af T-lymfocytter. Derudover er ekspressionen af kemokinreceptoren CCR7 på celleoverfladen induceres, som muliggør migration af DC'er fra perifert væv til lymfeknuderne. Migrationen lettes af "rullende" af DC'er langs en kemokinligand 19 (CCL19 / MIP-3b) og kemokinligand 21 (CCL21 / SLC) gradient til lymfeknuderne 4-6.
Efter migration, MDC'er præsentere den bearbejdede antigen til naive CD4 + og CD8 + T-celler, således initiating en adaptiv immunrespons mod de invaderende patogen 7. Denne interaktion med T-celler i lymfeknuder er også forbundet med spredning af virusset 8. Andre in vitro undersøgelser viste, at udviklingslandene effektivt fange og overføre HIV til T-celler, og at denne transmission resulterer i en kraftig infektion 9-12. Disse eksperimenter fremhæve, at in vivo HIV udnytter udviklingslandene som pendulfart fra periferien til lymfeknuderne. Under antigenpræsentation, DC'er udskiller centrale interleukiner der former differentieringen af effektor T-hjælperceller, og derfor er resultatet af hele immunrespons mod mikroben bestemt ved denne meget interaktion. Bortset fra type 1 (Th1) og type 2 (Th2) effektor T-celler, andre delmængder af CD4 + T-hjælper celler (f.eks, type 17 (Th17) og type 22 (Th22) T-celler) er blevet beskrevet, og deres induktion og funktion er blevet undersøgt grundigt. DC'er er endvidere involveret igenereringen af regulatoriske T-celler (tregs) 13,14. Disse celler er immunosuppressive og kan stoppe eller nedregulere induktion eller proliferation af effektor T-celler og er således af afgørende betydning for udvikling af immunitet og tolerance.
Humane konventionelle DCs (CDCS) omfatter flere delmængder af celler med en myeloid oprindelse (dvs. Langerhanske celler (LCS) og dermal og interstitielle DC'er) eller en lymfoid oprindelse (dvs. plasmacytoide DCs (pdCs)). For in vitro forsøg eller DC vaccinationsstrategier, er monocytafledte DCs rutinemæssigt anvendes som model for dermale udviklingslandene. Disse celler viser ligheder i fysiologi, morfologi, og funktion til konventionelle myeloide dendritiske celler. De genereres ved tilsætning af interleukin 4 (IL-4) og granulocyt-makrofag koloni-stimulerende faktor (GM-CSF) til monocytter isoleret fra raske donorer 12,15-18. Dendritiske celler kan også isoleres direkte fra dermale eller mukosale biopsier, eller kan endda be udviklet sig fra CD34 + hæmatopoietiske stamceller isoleret fra navlestrengen blodprøver opnået ex utero. Her viser vi, hvordan monocytter isoleres og stimuleres fra anti-koaguleret humant blod efter mononukleære perifere blodceller (PBMC) berigelse ved densitetsgradientcentrifugering. Efter inkubation i 5 dage, humane monocytter under særlige betingelser er differentieret i IDCS og er klar til forsøg procedurer i en ikke-kliniske omgivelser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Skriftlig informeret samtykke blev opnået fra alle deltagende bloddonorer fra det centrale institut for Blood Transfusion & Immunologisk Afdeling, Innsbruck, Østrig. Brugen af anonyme sidesten prøver til videnskabelige formål blev godkendt af den etiske komité i det medicinske universitet i Innsbruck.
1. Berigelse af perifert blod mononukleære celler (PBMC'er)
- Koncentration af PBMC'er ved centrifugering.
- Åbne blod pakken og split blod i sterile 50 ml centrifugerør efter mængden af blod modtages.
- Hvis det er nødvendigt, justere lydstyrken til 50 ml for hvert rør med steril Dulbeccos phosphatbufret saltvand (D-PBS).
- Anbring glassene i en centrifuge og spin dem ved 400 xg i 15 minutter ved stuetemperatur (RT) uden bremse.
- Tegn off det øverste lag, som indeholder plasma og blodplader ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette, forlader boundary lag uforstyrret.
BEMÆRK: Hvis autologt plasma i stedet for FCS anvendes til at supplere dyrkningsmediet må plasmaet opsamles og varmeinaktiveret i dette trin. - Saml mononukleære celler (grænselag) fra to 50 ml centrifugerør og overføre dem til en steril 50 ml rør ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette.
- Juster lydstyrken til 50 ml for hvert rør ved hjælp af steril D-PBS.
- Anbring glassene i en centrifuge og spin dem ved 400 xg i 15 minutter ved stuetemperatur uden bremse.
- Tegn off det øvre lag indeholdende plasma og blodplader under anvendelse af en steril 10 ml serologisk pipette og efterlod grænselaget uforstyrret.
- Indsamle mononukleære celler (grænselag) fra 50 ml centrifugerør og overføre dem i to sterile 50 ml opsamlingsrør ved hjælp af en steril 10 ml serologisk pipette.
- Juster lydstyrken til 50 ml for hvert rør med steril D-PBS.
- Adskillelseaf PBMC'er ved densitetsgradientcentrifugering (figur 1).
- Forbered fire 50 ml rør og pipette 15 ml densitetsgradient-medium i hvert rør.
- Tage 25 ml poolet celler / blod fra opsamlingsrøret (trin 1.1.10) og omhyggeligt overlay densitetsgradienten medium.
- Anbring glassene i en centrifuge og spin dem ved 700 xg i 30 minutter ved stuetemperatur uden bremse.
- Indsamling og oprensning af PBMC'er.
- Tegn off det øvre lag indeholdende plasma og blodplader under anvendelse af en steril 10 ml serologisk pipette og efterlod PBMC laget uforstyrret.
- Saml PBMC interfasen fra alle rør og samle cellerne i to sterile 50 ml rør ved anvendelse af en steril 25 ml serologisk pipette.
- Juster lydstyrken til 50 ml for hvert rør med steril D-PBS. Anbring glassene i en centrifuge og spin dem ved 400 xg i 15 minutter ved 4 ° C med bremsen.
- Aspirere supernatanten og re-suspendereceller i sterilt D-PBS. Pool cellerne fra begge rør og justere lydstyrken til 50 ml med steril D-PBS.
- Anbring glassene i centrifugen og spin dem ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med bremse.
- Aspirere supernatanten og re-suspendere cellerne i steril D-PBS. Juster lydstyrken til 50 ml med steril D-PBS og pipette 50 pi til et 1,5 ml rør indeholdende 450 pi D-PBS.
- Vortex 1,5 ml rør kraftigt og tælle cellerne i et Neubauer kammer eller et andet celletælling instrument.
- Placer 50 ml rør i centrifugen og spin dem ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med bremse.
2. Isolering af monocytter af Anti-humane CD14 magnetiske partikler
- Mærkning af PBMC'er med magnetiske partikler.
- Juster PBMC fusions 8 x 10 7 celler / ml ved anvendelse isolation puffer.
- Vortex de anti-human CD14 magnetiske partikler thoroughly og tilsættes 50 ul partikler for hver 1 x 10 7 PBMC'er.
- Bland suspensionen celle-partikel grundigt og inkuber det ved stuetemperatur i 30 min.
- Adskillelse af de positive og negative fraktioner.
- Juster lydstyrken op til 12 ml med isolation buffer.
- Forbered seks sterile rundbundede rør og pipette 2 ml af celle-partikel suspension i hvert rør.
- Anbring straks rørene på magneten. Inkubere dem i 10 minutter ved stuetemperatur.
- Hold rørene på magneten og omhyggeligt trække supernatanten. Supernatanten indeholder den negative fraktion.
- Fjern røret fra magneten, og der tilsættes 2 ml isolation buffer.
- Forsigtigt igen suspendere cellerne ved pipettering op og ned.
- Anbring glassene tilbage på magneten. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Hold rørene på magneten og omhyggeligt trække supernatanten. Supernatanten indeholder den negative fraktion.
- Fjern rørene fra magneten, og der tilsættes 2 ml isolation buffer til hvert rør. Forsigtigt igen suspendere cellerne ved pipettering op og ned.
- Overfør den positive fraktion til et sterilt 50 ml rør og justere volumen til 50 ml ved anvendelse steril D-PBS.
3. Stimulering af Isoleret Monocytter med IL-4 og GM-CSF
- Reagensglasset anbringes i centrifugen og spinde det ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med bremse.
- Aspirer supernatanten og resuspender cellerne i 50 ml D-PBS.
- Pipetter 50 pi i et 1,5 ml rør indeholdende 450 pi D-PBS. Vortex 1,5 ml rør kraftigt og tælle cellerne i et Neubauer kammer eller en anden celletælling instrument.
- Placer 50 ml rør i centrifugen og spinde det ved 400 xg i 10 min ved 4 ° C med bremse.
BEMÆRK: Hvis den negative fraktion, som indeholder perifere blodlymfocytter (PBL'er), er også påkrævet, udføre vask og optælling trin svarer til tslange af den positive fraktion (trin 3,1-3,5). - Juster cellekoncentrationen til 1 x 10 6 / ml med foropvarmet dyrkningsmedium (RPMI 1640 medium suppleret med 10% varmeinaktiveret FBS og 1% L-glutamin opløsning) og pipette 3 ml / brønd i 6-brønds plader.
BEMÆRK: Hvis anvendelse af varme-inaktiveret autologt plasma, udskifte 10% FCS med 1-5% autologt plasma, ifølge den eksperimentelle opstilling. - Stimulere monocytterne med rekombinant humant IL-4 (250 U / ml) og rekombinant human GM-CSF (1.000 U / ml) ved pipettering cytokinerne direkte ind i dyrkningsmediet. Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO2.
- Re-stimulere cellerne med IL-4 (250 U / ml) og GM-CSF (1.000 U / ml) efter 48 timer ved pipettering cytokinerne direkte ind i dyrkningsmediet.
BEMÆRK: Hvis der er tegn på forsuring vises af pH-indikator i mediet, erstatte halvdelen af mediet med foropvarmet dyrkningsmedium. - Harvest umodne dendritiske celler på dag 5 fornedstrøms eksperimenter ved pipettering af de dyrkede celler ud af 6-brønds plade og ind i en 50 ml centrifugerør efter pipettering dyrkningsmediet op og ned et par gange.
- Tæl cellerne og plette en prøve af isolerede monocytter med anti-humane antistoffer mod CD11, CD11 c, og DC-SIGN / CD209, sammen med en cellernes levedygtighed farvestof. At undgå uspecifik binding af antistofferne under overfladefarvning er anvendelsen af Fc-receptor blokerende reagenser eller bovint serum albumin (BSA) puffere stærkt anbefales.
- Analysere prøverne ved hjælp af cellelevedygtigheden farvestof, ifølge fabrikantens protokol, ved at udføre flowcytometri for at vurdere renhed og levedygtigheden af de genererede IDC'erne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter centrifugering af anti-koaguleret blod ved anvendelse af en sucrose pude, der mononukleære celler fra perifert blod (PBMC'er) beriget med en interfase på toppen af densitetsgradient-medium (figur 1). Efter PBMC'erne ledes bort, udføres FACS-analyse for at karakterisere de forskellige cellepopulationer inden PBMC'erne ved hjælp afstamning markører (fx CD3 for T-lymfocytter, CD14 for monocytter, og CD19 for B-lymfocytter). Figur 2A viser resultaterne af et repræsentativt FACS-analyse af PBMC'er opsamlet og farvet efter densitetsgradientcentrifugering. Ud af den kanaliserede befolkning (figur 2A, øvre plot), vi har registreret 4.03% B-lymfocytter, 28.20% monocytter og 67,62% andre celler (figur 2A, midterste plot), hvoraf 43,62% var T-lymfocytter (figur 2A, lavere plot ).
PBMC'er inkuberes derefter wi'te CD14 magnetiske partikler og, efter inkubering på en magnet, er den negative fraktion, der indeholder lymfocytter fra perifert blod (PBL'er) analyseret ved FACS under anvendelse udvælgelse af ovennævnte afstamning markører. Sammenlignet med PBMC'er, vi målte tilsvarende procentdele af B-lymfocytter (4,65%, figur 2B, midterste plot), højere procentdele af andre celler (88,61%, figur 2B, midterste plot), og stærkt reducerede procentdele af monocytter (6,59%, figur 2B , midterste plot). Karakterisering af den positive fraktion (figur 3) viste en høj separationseffektivitet, idet renheden af de isolerede celler er over 97% (figur 3, venstre plot), hvoraf 99,56% (figur 3, højre plot) udtrykte høje niveauer af CD14 på celleoverfladen.
IL4 og GM-CSF-stimulering af monocytter i 5 dage resulterer i differentiering til monocyt-afledte dendritiske celles, hvilket kan sammenlignes med dermal dendritiske celler i morfologi, adfærd, og receptorekspression 19. FACS-analyse af monocytafledte dendritiske celler på dag 5 viser en homolog population (Figur 4, venstre plot) udtrykker høje niveauer af CD11, CD11c (ikke vist), og C-type lectin DC-SIGN. Ingen ekspression af DC modning markør CD83 detekteres (figur 4, højre plot), og celler mister også monocyt markør CD14 (ikke vist).
Figur 1: Adskillelse af blodkomponenter ved densitetsgradientcentrifugering. PBMC'er er beriget i en interfase oven på separationsmediet ved densitetsgradientcentrifugering. Lag før (til venstre) og efter (højre) centrifugering er vist. Vær venligklik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Flowcytometrisk analyse af PBMC'er (A) og PBL'er (B). (A) PBMC'er høstes, farvet for afstamning markører (muse-anti-humane CD3, CD14, og CD19 antistoffer), og analyseret ved flowcytometri. Dot plots af et repræsentativt resultat vises. (B) Den negative fraktion indeholdende PBL'er er kendetegnet ved afstamning markører (muse-anti-humant CD3, CD14, og CD19-antistoffer) og analyseret ved flowcytometri. Dot plots af et repræsentativt resultat vises. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Flowcytometrisk analyse af monocytafledte dendritiske celler. Monocytter stimuleres i 5 dage med IL4 og GM-CSF og farves for karakteristiske DC markører, ligesom CD11, CD11 c (ikke vist), C-typen lektin DC-SIGN, og modning markør CD83. Dot plots af et repræsentativt resultat vises.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol beskriver genereringen af monocytafledte dendritiske celler (MDDCs) gennem isolering af humane monocytter fra anti-koaguleret blod ved anvendelse af en magnetisk nanopartikel-baseret assay. I denne protokol, udføres de centrifugeringstrin opstrøms cellen isolation procedure, der fører til en berigelse af PBMC-fraktionen. Selvom celler tabes under centrifugering, for at overlejre indholdet af en fuldblod pack på densitetsgradient medium ville kræve 200-300 ml af densitetsgradient-medium og kan derfor ikke betragtes omkostningseffektiv. Derudover berigelse af PBMC'er ved centrifugering resulterer i en renere cellepopulation, som har positiv indflydelse på binding af det anti-humane CD14-magnetiske partikler under isolationsprocessen. Magnetisk-nanopartikel isolation af monocytter resulterer i en levedygtig monocyt population, som yderligere kan anvendes til in vitro differentiering til forskellige delmængder af DC'er eller makrofager.
Alternativt kan dendritiske celler direkte isoleret fra dermal eller slimhinder biopsier eller kan udvikles fra CD34 + hæmatopoietiske stamceller isoleret fra navlestrengen blodprøver opnået ex utero.
Alligevel MDDCs er de mest udbredte model for dendritiske celler, idet den direkte isolering af DC'er fra biopsier er mere kompliceret at udføre. Det kan også føre til ineffektive celleantal, der ofte variere på grund af forskelle i donoren kvalitet. Lignende problemer kan opstå, når DC'er er genereret ud fra CD34 + stamceller isoleret fra navlestrengsblod.
For fremtidige applikationer, kunne inducerbare pluripotente stamceller (iPSCs) anvendes i stedet for CD14-magnetisk perle isolering af monocytter fra blod. Fordelene ved at anvende iPSCs er, at ikke kun DC delmængder, men alle hæmatopoietiske celler af interesse, kan genereres fra en donor (T-celler, B-celler, og NK calen), og at patientspecifikke iPSCs kan anvendes til at karakterisere de interaktioner af autologe immunceller i vedkommendes personlige forhold.
Det mest kritiske trin under isolering af monocytter er densitetsgradientcentrifugering trin, eftersom nøjagtig adskillelse af de røde og hvide blodlegemer kun opnås, når bremsen af centrifugen er slukket. Dette bestemmer resultatet af down-stream isolation effektivitet.
Afslutningsvis denne protokol er en meget hurtig, effektiv og omkostningseffektiv måde at generere en levedygtig og homogen monocyt-afledt dendritisk cellepopulation ved isolering af humane monocytter fra anti-koaguleret blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
