Introduction
Dendritiska celler (DC) är de viktigaste specialiserade antigenpresenterande celler av vårt immunsystem. Omogna DC (IDC) bor i huden eller i slemhinnevävnader och är därför bland de första immunceller att interagera med invaderande patogener. DCs representerar bron mellan det medfödda och adaptiva immunsystemet 1, eftersom de kan aktivera T- och B-cellsvar efter detektion av patogener. Dessutom bidrar de till proinflammatoriska immunsvar på grund av utsöndring av höga mängder av cytokiner, såsom IL-1β, IL-6, och IL-12. DCs aktivera även NK-celler och locka andra immunceller till platsen för infektion av kemotaxi.
DCs kan delas in i omogna dendritiska celler (IDC) och mogna dendritceller (MDCS) 2 baserat på deras morfologi och funktion. Efter erkännandet av främmande antigener genom en av de många mönsterigenkänningsreceptorer (t.ex. vägtullliknande receptorer, C-typlektiner, eller komplettera receptorer) rikligt uttryckt på cellytan, IDC genomgår stora förändringar och börjar mogna. Under denna mognadsprocessen, receptorer för antigen capture är nedregleras, medan molekyler som är viktiga för antigenpresentation är uppreglerad 3. Mogna DCs dig reglera histokompatibilitetskomplex I och II (MHC I och II), samstimulerande molekyler som CD80 och CD86, som är väsentliga för antigenpresentation och aktivering av T-lymfocyter. Dessutom är uttrycket av kemokinreceptorn CCR7 på cellytan induceras, vilket möjliggör migration av DC: er från perifera vävnader till lymfkörtlarna. Migreringen underlättas av "rullande" av DC: er längs en kemokin ligand 19 (CCL19 / MIP-3b) och kemokin ligand 21 (CCL21 / SLC) gradient till lymfkörtlarna 4-6.
Följande övergångs, MDCS presentera den bearbetade antigenet till naiva CD4 + och CD8 + T-celler, vilket således initiating ett adaptivt immunsvar mot den invaderande patogenen 7. Denna interaktion med T-celler i lymfkörtlarna är också förknippat med spridningen av viruset 8. Andra in vitro-studier visade att DC fångar effektivt och överföra HIV till T-celler och att denna transmission resulterar i en kraftig infektion 9-12. Dessa experiment markera att in vivo HIV exploits DCs som skyttlar från periferin till lymfkörtlarna. Under antigenpresentation, DCs utsöndrar viktiga interleukiner som formar differentieringen av effektor-T-hjälparceller, och därför är resultatet av hela immunsvar mot mikroben bestäms vid denna mycket interaktion. Bortsett från typ 1 (Th1) och typ 2 (Th2) T-celler, andra undergrupper av CD4 + T-hjälparceller (t.ex. typ 17 (Th17) och typ 22 (Th22) T-celler) har beskrivits, och deras induktion och funktionen har undersökts grundligt. DCs är vidare involverade igenerering av regulatoriska T-celler (tregs) 13,14. Dessa celler är immunsuppressiva och kan stoppa eller nedreglera induktion eller proliferation av T-celler och är därför avgörande för att utveckla immunitet och tolerans.
Mänskliga konventionella DC (CDCs) omfattar flera undergrupper av celler med en myeloid ursprung (dvs Langerhans celler (LCS) och huden och mellan DCS) eller en lymfoidursprung (dvs plasmacytoid DCs (pDCs)). För in vitro-experiment eller DC vaccinationsstrategier, är monocythärledda DCs rutinmässigt används som en modell för dermala DC. Dessa celler visar likheter i fysiologi, morfologi och funktion till konventionella myeloida dendritiska celler. De genereras genom tillsats av interleukin 4 (IL-4) och granulocyt-makrofag-kolonistimulerande faktor (GM-CSF) till monocyter isolerade från friska givare 12,15-18. Dendritiska celler kan också direkt isoleras från dermala eller mukosala biopsier, eller kan även be utvecklats från CD34 + hematopoetiska progenitorceller isolerade från navelsträngsblodprover erhållna ex livmodern. Här visar vi hur monocyter isoleras och stimuleras av anti-koagulerat humant blod efter perifert blod mononukleära celler (PBMC) anrikning av densitetsgradientcentrifugering. Efter inkubation under 5 dagar, humana monocyter på vissa villkor är differentierade i IDCs och är redo för experimentella procedurer i en icke-klinisk miljö.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik uttalande: Skriftligt informerat samtycke erhölls från alla deltagande blodgivare från centrala institutet för blodtransfusion och immunologiska avdelningen, Innsbruck, Österrike. Användningen av anonymiserade överblivna exemplar för vetenskapliga ändamål godkändes av den etiska kommittén för medicinska universitetet i Innsbruck.
1. Anrikning av perifera mononukleära blodceller (PBMC)
- Koncentrationen av PBMC genom centrifugering.
- Öppna blod-paketet och split blod i sterila 50 ml centrifugrör i enlighet med den mängd blod tas emot.
- Om det är nödvändigt, justera volymen till 50 ml för varje rör med steril Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (D-PBS).
- Placera rören i en centrifug och spinn dem vid 400 xg under 15 min vid rumstemperatur (RT) utan broms.
- Dra bort den övre skikt innehållande plasma och trombocyter med en steril 10 ml serologisk pipett, lämnar boundary skikt ostörda.
OBS: Om autolog plasma i stället för FCS används för att komplettera odlingsmediet, måste plasmat uppsamlas och värmeinaktiv i detta steg. - Samla mononukleära celler (gränsskikt) från två 50 ml centrifugrör och överföra dem till en steril 50 ml rör med en steril 10 ml serologisk pipett.
- Justera volymen till 50 ml för varje rör med steril D-PBS.
- Placera rören i en centrifug och spinn dem vid 400 xg under 15 min vid RT utan broms.
- Dra bort den övre skiktet innehållande plasma och trombocyter med en steril 10 ml serologisk pipett, lämnar gränsskiktet ostört.
- Samla mononukleära celler (gränsskikt) från 50 ml centrifugrör och överföra dem till två sterila 50 ml uppsamlingsrör med en steril 10 ml serologisk pipett.
- Justera volymen till 50 ml för varje rör med steril D-PBS.
- Separationav PBMC efter densitetsgradientcentrifugering (Figur 1).
- Förbereda fyra 50 ml rör och pipettera 15 ml densitetsgradient-medium till varje rör.
- Ta 25 ml poolade celler / blod från provröret (steg 1.1.10) och försiktigt överlagra densitetsgradienten mediet.
- Placera rören i en centrifug och spinn dem vid 700 xg under 30 min vid RT utan broms.
- Insamling och rening av PBMC.
- Sug upp det övre skiktet som innehåller plasma och blodplättar med en steril 10 ml serologisk pipett lämnar PBMC lagret ostört.
- Samla PBMC inter från alla rör och slå samman celler i två sterila 50 ml rör med en steril 25 ml serologisk pipett.
- Justera volymen till 50 ml för varje rör med steril D-PBS. Placera rören i en centrifug och spinn dem vid 400 xg under 15 min vid 4 ° C med bromsen.
- Aspirera supernatanten och återsuspenderaceller i steril D-PBS. Pool av cellerna från båda rören och justera volymen till 50 ml med steril D-PBS.
- Placera rören i centrifugen och snurra dem vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C med broms.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i steril D-PBS. Justera volymen till 50 ml med steril D-PBS och pipett 50 ul till en 1,5 ml rör innehållande 450 pl D-PBS.
- Vortexblanda 1,5 ml rör om kraftigt och räkna cellerna i en Neubauer kammare eller någon annan cell räkneinstrumentet.
- Placera 50 ml rör in i centrifugen och snurra dem vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C med broms.
2. Isolering av monocyter genom antihumana CD14 magnetiska partiklar
- Märkning av PBMC med magnetiska partiklar.
- Justera PBMC koncentrationen till 8 x 10 7 celler / ml med användning av isoleringsbuffert.
- Vortex anti-human CD14 magnetiska partiklar thoroughly och tillsätt 50 pl partiklar för varje 1 x 10 7 PBMC.
- Blanda den cell partikelsuspensionen noggrant och inkubera det vid RT i 30 min.
- Separation av de positiva och negativa fraktioner.
- Justera volymen upp till 12 ml med hjälp av isoleringsbuffert.
- Förbered sex sterila rundbottnade rör och pipettera 2 ml av den cell partikelsuspensionen in i varje rör.
- Placera omedelbart rören på magneten. Inkubera dem under 10 minuter vid RT.
- Håll rören på magneten och försiktigt dra bort supernatanten. Supernatanten innehåller den negativa fraktionen.
- Ta bort röret från magneten och tillsätt 2 ml isoleringsbuffert.
- Försiktigt återsuspendera cellerna genom pipettering upp och ned.
- Placera rören tillbaka på magneten. Inkubera under 5 min vid RT.
- Håll rören på magneten och försiktigt dra bort supernatanten. Supernatanten innehåller den negativa fraktionen.
- Avlägsna rören från magneten och tillsätt 2 ml av isoleringsbuffert till varje rör. Försiktigt återsuspendera cellerna genom pipettering upp och ned.
- Överföra den positiva fraktionen till ett sterilt 50 ml-rör och justera volymen till 50 ml med användning av steril D-PBS.
3. Stimulering av isolerat Monocyter med IL-4 och GM-CSF
- Placera röret i centrifugen och snurra det vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C med broms.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera cellerna i 50 ml D-PBS.
- Pipette 50 ul i ett 1,5 ml rör innehållande 450 | il av D-PBS. Vortexblanda 1,5 ml rör om kraftigt och räkna cellerna i en Neubauer kammare eller annan cell räkneinstrumentet.
- Placera 50 ml rör in i centrifugen och snurra det vid 400 xg under 10 min vid 4 ° C med broms.
OBS: Om den negativa fraktionen, innehållande perifert blod-lymfocyter (PBL), också krävs, utföra tvättning och räkning steg liknar tslang av den positiva fraktionen (steg från 3,1 till 3,5). - Justera cellkoncentrationen till 1 x 10 6 / ml med förvärmda odlingsmedium (RPMI 1640-medium kompletterat med 10% värmeinaktiverat FBS och 1% L-glutamin-lösning) och pipettera 3 ml / brunn i 6-brunnars plattor.
OBS: Om du använder värmeinaktiverat autologt plasma, ersätta 10% FCS med 1-5% autolog plasma, i enlighet med den experimentella uppställningen. - Stimulera monocyter med rekombinant humant IL-4 (250 U / ml) och rekombinant humant GM-CSF (1000 U / ml) genom att pipettera cytokinerna direkt i odlingsmediet. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO2.
- Åter stimulera cellerna med IL-4 (250 U / ml) och GM-CSF (1000 U / ml) efter 48 h genom att pipettera cytokinerna direkt i odlingsmediet.
OBS: Om det inte finns några tecken på försurning visas av pH-indikatorn i mediet, ersätta hälften av mediet med förvärmda odlingsmedium. - Harvest omogna dendritiska celler på dag 5 förnedströms experiment av att pipettera de odlade cellerna ut ur 6-brunnar och in i en 50 ml centrifugrör efter pipettering odlingsmediet upp och ned några gånger.
- Räkna celler och färga ett prov av isolerade monocyter med anti-humana antikroppar mot CD11b, CD11c, och DC-SIGN / CD209, tillsammans med en cellviabilitet färgämne. För att undvika ospecifik bindning av antikropparna under ytfärgning, är användningen av Fc-receptorblockeringsreagens eller bovint serumalbumin (BSA) buffertar rekommenderas.
- Analysera provet med användning av cellviabiliteten färgämne, enligt tillverkarens protokoll, genom att utföra flödescytometri för att bedöma renheten och viabiliteten av de genererade IDC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter centrifugering av antikoagulerat blod med användning av en sackaros-kudde, är perifera mononukleära blodceller (PBMC) anrikad på en interfas ovanpå densitetsgradient-medium (Figur 1). Efter PBMC dras av, FACS-analys utfördes för att karakterisera de olika cellpopulationer i PBMC med hjälp av härstamning markörer (t.ex. CD3 för T-lymfocyter, CD14 för monocyter och CD19 för B-lymfocyter). Figur 2A visar resultaten av en representativa FACS-analys av PBMC uppsamlade och färgade efter densitetsgradientcentrifugering. Av de gated befolkningen (Figur 2A, övre tomt), upptäckte vi 4,03% B-lymfocyter, 28,20% monocyter och 67,62% andra celler (figur 2A, mitt tomt), varav 43,62% var T-lymfocyter (Figur 2A, lägre tomt ).
PBMC inkuberas därefter w: te CD14 magnetiska partiklar och, efter inkubation på en magnet, är den negativa fraktionen innehållande de perifera blodlymfocyter (PBLs) analyserades genom FACS med användning av valet av ovannämnda härstamningsmarkörer. Jämfört med PBMC, mätte vi liknande procenttal av B-lymfocyter (4,65%, figur 2B, mitt tomt), högre halter av andra celler (88,61%, figur 2B, mitt tomt), och starkt reducerade procentsatser av monocyter (6,59%, Figur 2B , mitt tomt). Karakterisering av den positiva fraktionen (figur 3) visade en hög separationseffektivitet, eftersom renheten hos de isolerade cellerna är över 97% (Figur 3, vänster kurva), varav 99,56% (figur 3, höger plot) uttryckte höga nivåer av CD14 på cellytan.
IL4 och GM-CSF-stimulering av monocyter i 5 dagar resulterar i differentiering till monocyt-härledda dendritiska cellers, vilket är jämförbart med dermal dendritiska celler i morfologi, beteende, och receptoruttryck 19. FACS-analys av monocythärledda dendritiska celler på dag 5 visar en homolog population (fig 4, vänster kurva) som uttrycker höga nivåer av CD 11 b, CD11c (ej visad), och den C-typ lektin DC-SIGN. Inget uttryck av DC mognadsmarkören CD83 detekteras (fig 4, högra tomt), och celler som förlorar också monocyt markören CD14 (ej visad).
Figur 1: Separation av blodkomponenter genom densitetsgradientcentrifugering. PBMCs är anrikade i en interfas ovanpå separationsmediet genom densitetsgradientcentrifugering. Skikt före (vänster) och efter (höger) centrifugering visas. Snälla duklicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Flödescytometrisk analyser av PBMC (A) och PBL (B). (A) PBMC skördas, färgas för härstamning markörer (mus-anti-humana CD3, CD14 och CD19 antikroppar), och analyserades med flödescytometri. Punktdiagram av ett representativt resultat visas. (B) Den negativa fraktionen innehållande PBLs kännetecknas av härstamningsmarkörer (mus-anti-human CD3, CD14, och CD19-antikroppar) och analyserades med flödescytometri. Punktdiagram av ett representativt resultat visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Flödescytometrisk analyser av monocythärledda dendritiska celler. Monocyter stimuleras under 5 dagar med IL4 och GM-CSF och färgas för karakteristiska DC markörer, som CD11b, CD11c (ej visad), C-typ lektin DC-tecken, och mognaden markören CD83. Punktdiagram av ett representativt resultat visas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll beskriver generering av monocythärledda dendritiska celler (MDDCs) genom isolering av humana monocyter från anti-koagulerat blod med hjälp av en magnetisk nanopartikel-baserad analys. I detta protokoll är de centrifugeringsstegen utförs uppströms cellen isoleringsförfarandet, vilket leder till en anrikning av PBMC-fraktionen. Även om celler går förlorade under centrifugeringen, för att överlagra innehållet i ett helblod pack på densitetsgradient mediet skulle kräva 200-300 ml av densitetsgradient-medium och kan därför inte anses vara kostnadseffektiva. Dessutom, berikning av PBMC genom centrifugering resulterar i en renare cellpopulation, vilket positivt påverkar fastsättningen av de anti-humana CD14 magnetiska partiklar under isoleringsprocessen. Magnetisk nanopartiklar isolering av monocyter resulterar i en livskraftig monocyt befolkning, som kan användas vidare för in vitro-differentiering till olika DC delmängder eller makrofager.
Alternativt kan dendritiska celler direkt isoleras från huden eller slemhinnor biopsier eller kan utvecklas från CD34 + hematopoetiska progenitorceller isolerade från navelsträngsblodprover erhållna ex livmodern.
Ändå MDDCs är mest använda modellen för dendritiska celler, eftersom den direkta isoleringen av DC från biopsier är mer komplicerat att utföra. Det kan också leda till ineffektiva cellantal som ofta varierar på grund av skillnader i givar kvalitet. Liknande problem kan uppstå när DCs genereras från CD34 + stamceller isolerade från navelsträngsblod.
För framtida tillämpningar kan inducerbara pluripotenta stamceller (iPSCs) användas i stället för CD14-magnetisk pärla isolering av monocyter från blod. Fördelarna med att använda iPSCs är att inte bara DC-underuppsättningar, men alla hematopoetiska celler av intresse, kan genereras från en donator (T-celler, B-celler, och NK calnar) och att patientspecifika iPSCs kan användas för att karakterisera interaktioner av autologa immunceller på ett personligt sätt.
Det mest kritiska steget under isoleringen av monocyter är den densitetsgradientcentrifugering steg, eftersom noggrann separering av de röda och vita blodkroppar uppnås endast när broms centrifugens är avstängd. Detta avgör resultatet av nedströms isolering effektivitet.
Sammanfattningsvis är detta protokoll ett mycket snabbt, effektivt och kostnadseffektivt sätt att generera en livskraftig och homogen monocyt-härledda dendritiska celler befolkningen genom isoleringen av humana monocyter från anti-koagulerat blod.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Steinman, R. M., Hemmi, H. Dendritic cells: translating innate to adaptive immunity. Curr Top Microbiol Immunol. 311, 17-58 (2006).
- Steinman, R. M., Inaba, K., Turley, S., Pierre, P., Mellman, I. Antigen capture, processing, and presentation by dendritic cells: recent cell biological studies. Hum Immunol. 60, 562-567 (1999).
- Schwarz, J., Sixt, M. Quantitative Analysis of Dendritic Cell Haptotaxis. Methods Enzymol. 570, 567-581 (2016).
- Weber, M., Sixt, M. Live cell imaging of chemotactic dendritic cell migration in explanted mouse ear preparations. Methods Mol Biol. 1013, 215-226 (2013).
- Sixt, M., Lammermann, T. In vitro analysis of chemotactic leukocyte migration in 3D environments. Methods Mol Biol. 769, 149-165 (2011).
- Randolph, G. J., Angeli, V., Swartz, M. A. Dendritic-cell trafficking to lymph nodes through lymphatic vessels. Nat Rev Immunol. 5, 617-628 (2005).
- Wilflingseder, D., Banki, Z., Dierich, M. P., Stoiber, H. Mechanisms promoting dendritic cell-mediated transmission of HIV. Mol Immunol. 42, 229-237 (2005).
- Pope, M., Gezelter, S., Gallo, N., Hoffman, L., Steinman, R. M. Low levels of HIV-1 infection in cutaneous dendritic cells promote extensive viral replication upon binding to memory CD4+ T cells. J Exp Med. 182, 2045-2056 (1995).
- McDonald, D., et al. Recruitment of HIV and its receptors to dendritic cell-T cell junctions. Science. 300, 1295-1297 (2003).
- Pruenster, M., et al. C-type lectin-independent interaction of complement opsonized HIV with monocyte-derived dendritic cells. Eur J Immunol. 35, 2691-2698 (2005).
- Wilflingseder, D., et al. IgG opsonization of HIV impedes provirus formation in and infection of dendritic cells and subsequent long-term transfer to T cells. J Immunol. 178, 7840-7848 (2007).
- Kapsenberg, M. L. Dendritic-cell control of pathogen-driven T-cell polarization. Nat Rev Immunol. 3, 984-993 (2003).
- Mills, K. H. TLR-dependent T cell activation in autoimmunity. Nat Rev Immunol. 11, 807-822 (2011).
- Banki, Z., et al. Complement as an endogenous adjuvant for dendritic cell-mediated induction of retrovirus-specific CTLs. PLoS Pathog. 6, e1000891 (2010).
- Posch, W., et al. Antibodies attenuate the capacity of dendritic cells to stimulate HIV-specific cytotoxic T lymphocytes. J Allergy Clin Immunol. 130, e1362 1368-1374 (2012).
- Posch, W., et al. Complement-Opsonized HIV-1 Overcomes Restriction in Dendritic Cells. PLoS Pathog. 11, e1005005 (2015).
- Wilflingseder, D., et al. Immediate T-Helper 17 Polarization Upon Triggering CD11b/c on HIV-Exposed Dendritic Cells. J Infect Dis. 212, 44-56 (2015).
- Grassi, F., et al. Monocyte-derived dendritic cells have a phenotype comparable to that of dermal dendritic cells and display ultrastructural granules distinct from Birbeck granules. J Leukoc Biol. 64, 484-493 (1998).
