Introduction
As células dendríticas (CDs) são as células especializadas apresentadoras de antigénios mais importantes do nosso sistema imunitário. DCs imaturos (iDCs) residem na pele ou nos tecidos das mucosas e são, por conseguinte, entre as primeiras células imunes para interagir com os agentes patogénicos invasores. DCs representam a ponte entre o inato eo sistema imunitário adaptativo 1, uma vez que podem activar respostas T e de células B após a detecção de patógenos. Além disso, contribuem para as respostas imunitárias pró-inflamatórios devido à secreção de grandes quantidades de citocinas, tais como IL-1β, IL-6, e IL-12. DCs também activar as células NK e outras atrair células do sistema imunológico para o local da infecção por quimiotaxia.
DCs pode ser dividido em células dendríticas imaturas (iDCs) e células dendriticas maduras (MDCs) 2 com base na sua morfologia e função. Após o reconhecimento de antigénios estranhos por um dos muitos receptores de reconhecimento de padrões (por exemplo, receptores de tipo Toll, C-tipolectinas, receptores ou complementar a) abundantemente expresso na superfície da célula, iDCs sofrer grandes alterações e começar a amadurecer. Durante este processo de maturação, receptores para captura de antigénios são regulados negativamente, enquanto que as moléculas essenciais para a apresentação de antígenos são up-regulada 3. DCs maduras sobre-regular os complexo principal de histocompatibilidade I e II (MHC I e II), moléculas co-estimuladoras tais como CD80 e CD86, que são essenciais para a apresentação de antigénios e a activação dos linfócitos T. Além disso, a expressão de receptor de quimioquina CCR7 na superfície da célula é induzida, o que permite a migração de DC a partir de tecidos periféricos para os nodos linfáticos. A migração é facilitada pela "rolamento" de DC ao longo de um ligando de quimiocina 19 (CCL19 / MIP-3b) e o gradiente de ligando de quimiocina 21 (CCL21 / SLC) para os nódulos linfáticos 4-6.
Após migração, mDCs apresentar o antigénio processado a ingénuo células T CD4 + e CD8 +, assim initiating uma resposta imune adaptativa contra o agente patogénico invasor 7. Esta interacção com as células T em nódulos linfáticos, também está associada com a propagação do vírus 8. Outros estudos in vitro revelaram que DCs eficiente capturar e transferir HIV às células T e que esta resultados de transmissão de uma infecção vigorosa 9-12. Este estudo destacou que in vivo explora DCs HIV como shuttles da periferia para os gânglios linfáticos. Durante a apresentação de antigénio, as DCs segregam interleucinas chave que definem a diferenciação de células T auxiliares efectoras, e, portanto, o resultado de toda a resposta imunitária contra o micróbio é determinada nesta interacção muito. Além de tipo 1 (Th1) e tipo 2 (Th2) T efetoras, outros subconjuntos de células CD4 + T helper (por exemplo, tipo 17 (Th17) e Tipo 22 (células Th22) T) têm sido descritas, e sua indução e função foram investigadas exaustivamente. DCs são, além disso, envolvido ema geração de células T reguladoras (Tregs) 13,14. Estas células são imunossupressor e pode parar ou para baixo-regular indução ou proliferação de células T efetoras e são, portanto, crucial para o desenvolvimento de imunidade e tolerância.
DCs convencionais Humanos (CDCs) compreendem vários subconjuntos de células com uma origem mielóide (isto é, células de Langerhans (LCS) e dérmica e DCs intersticiais) ou uma origem linfóide (isto é, as DCs plasmocitoides (PDCs)). Para as experiências in vitro ou estratégias de vacinação DC, DC derivadas de monócitos são rotineiramente utilizado como um modelo para as DCs dérmicos. Estas células apresentam semelhanças na fisiologia, morfologia e função às células dendríticas mielóides convencionais. Eles são gerados por meio da adição de interleucina 4 (IL-4) e de granulócitos-macrófagos fator estimulador de colónias (GM-CSF) para monócitos isolados a partir de dadores saudáveis, 12,15-18. As células dendríticas também podem ser directamente isolados a partir da derme ou da mucosa biópsias, ou pode até mesmo be desenvolvido a partir de células progenitoras hematopoiéticas isoladas a partir de amostras de sangue do cordão umbilical obtidos ex utero CD34 +. Aqui, demonstramos como monócitos são isolados e estimulados a partir de sangue humano anti-coagulado, depois de células mononucleares de sangue periférico (PBMC) de enriquecimento por centrifugação em gradiente de densidade. Após incubação durante 5 dias, monócitos humanos sob condições específicas são diferenciados em iDCs e estão prontos para os procedimentos experimentais em um ambiente não-clínico.
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Protocol
declaração de ética: consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes doadores de sangue por parte do Instituto Central de Transfusão de Sangue & Departamento de Imunologia, Innsbruck, Áustria. O uso de amostras de sobras anónimos para fins científicos foi aprovado pelo Comitê da Universidade de Medicina de Innsbruck Ética.
1. enriquecimento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC)
- Concentração de PBMC por centrifugação.
- Abra o pacote de sangue e dividida em tubos de centrífuga de 50 ml estéreis de acordo com a quantidade de sangue recebida.
- Se necessário, ajustar o volume a 50 ml por cada tubo com fosfato tamponado com solução salina estéril de Dulbecco (D-PBS).
- Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min à temperatura ambiente (TA) sem travão.
- Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando o boundary camada imperturbável.
NOTA: Se plasma autólogo, em vez de FCS é usado para suplementar o meio de cultura, o plasma deve ser recolhido e inactivado pelo calor neste passo. - Recolher as células mononucleares (camadas de fronteira) a partir de dois de 50 ml tubos de centrífuga e transferi-los para um estéril tubo de 50 ml usando um estéril 10 ml pipeta sorológica.
- Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo estéril usando D-PBS.
- Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min à TA sem travão.
- Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando a camada limite não perturbada.
- Recolher as células mononucleares (camadas de fronteira) a partir das 50 ml tubos de centrífuga e transferi-los em dois tubos de 50 ml de coleta estéreis, utilizando uma agulha estéril 10 ml pipeta sorológica.
- Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo com D-PBS estéril.
- Separaçãode PBMC por centrifugação em gradiente de densidade (Figura 1).
- Prepare quatro tubos de 50 ml e pipeta de 15 ml de meio de gradiente de densidade para cada tubo.
- -Se 25 ml de células agrupadas / sangue do tubo de coleta (passo 1.1.10) e sobrepor cuidadosamente o meio de gradiente de densidade.
- Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 700 xg durante 30 min à TA sem travão.
- Recolha e purificação de PBMCs.
- Decantar a camada superior contendo o plasma e plaquetas utilizando uma pipeta de 10 ml estéril sorológica, deixando a camada de PBMC não perturbada.
- Recolher o interfase PBMC de todos os tubos e reunir as células em duas estéreis tubos de 50 ml usando um estéril 25 ml pipeta sorológica.
- Ajustar o volume até 50 ml para cada tubo com D-PBS estéril. Colocar os tubos em uma centrifugadora e colocá-los a 400 xg durante 15 min a 4 ° C com o freio.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspender aem células estéril D-PBS. Reunir as células de ambos os tubos e ajustar o volume para 50 ml com PBS estéril D-.
- Colocar os tubos no centrifugador e colocá-los a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células em D-PBS estéril. Ajustar o volume para 50 ml com PBS estéril e D-pipeta 50 ul a um tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de D-PBS.
- Vortex do tubo de 1,5 ml vigorosamente e contar as células em uma câmara de Neubauer ou qualquer outro instrumento de contagem de células.
- Colocar os tubos de 50 ml no centrifugador e colocá-los a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
2. Isolamento de monócitos CD14 por partículas magnéticas anti-humano
- Etiquetagem de PBMCs com partículas magnéticas.
- Ajustar a concentração de PBMC de 8 x 10 7 células / ml usando tampão de isolamento.
- Vortex as partículas CD14 anti-humano magnéticos absoY e adicionar 50 ul de partículas por cada 1 x 10 7 PBMC.
- Misture a suspensão de células-partículas bem e incubar-lo à TA durante 30 min.
- A separação das fracções positivas e negativas.
- Ajustar o volume até 12 ml usando tampão de isolamento.
- Prepare seis tubos estéreis de fundo redondo e de pipeta 2 mL da suspensão de células-partículas em cada tubo.
- Imediatamente coloque os tubos no ímã. Incubar-los durante 10 min à TA.
- Mantenha os tubos no ímã e desenhar cuidadosamente o sobrenadante. O sobrenadante contém a fracção negativa.
- Retire o tubo do ímã e adicionar 2 ml de tampão de isolamento.
- Gentilmente re-suspender as células por pipetagem cima e para baixo.
- Colocar os tubos de volta ao ímã. Incubar durante 5 min à TA.
- Mantenha os tubos no ímã e desenhar cuidadosamente o sobrenadante. O sobrenadante contém a fracção negativa.
- Retirar os tubos do ímã e adicionar 2 ml de tampão de isolamento a cada tubo. Gentilmente re-suspender as células por pipetagem cima e para baixo.
- Transferir a fracção positiva para um tubo estéril de 50 ml e ajustar o volume para 50 ml usando estéril D-PBS.
3. Estimulação de monócitos isolados com IL-4 e GM-CSF
- Colocar o tubo em a centrífuga e girá-lo a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em 50 ml de D-PBS.
- Pipetar 50 ul num tubo de 1,5 ml contendo 450 ul de D-PBS. Vortex do tubo de 1,5 ml vigorosamente e contar as células numa câmara de Neubauer ou um outro instrumento de contagem de células.
- Colocar o tubo de 50 mL para a centrífuga e girá-lo a 400 xg durante 10 min a 4 ° C com freio.
NOTA: Se a fração negativo, contendo linfócitos do sangue periférico (PBL), também é necessária, executar lavagem e contagem de passos semelhante ao tmangueira da fracção positiva (passos 3,1-3,5). - Ajustar a concentração de células de 1 x 10 6 / mL com meio de cultura pré-aquecido (meio RPMI 1640 suplementado com L-Glutamina solução de FBS inactivado por calor e 1% a 10%) e pipeta de 3 ml / poço em placas de 6 poços.
NOTA: Se estiver usando plasma autólogo inativado pelo calor, substitua o FCS 10%, com 1-5% de plasma autólogo, de acordo com o conjunto experimental. - Estimular os monócitos com recombinante humano IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF humano recombinante (1000 U / mL) por pipetagem as citocinas directamente para o meio de cultura. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Re-estimular as células com IL-4 (250 U / ml) e GM-CSF (1000 U / ml) após 48 h pipetando as citocinas directamente para o meio de cultura.
NOTA: Se não houver qualquer sinal de acidificação mostrado pelo indicador de pH no meio, substituir metade do meio com meio de cultura de pré-aquecido. - Colheita células dendríticas imaturas no dia 5 paraa jusante experiências pipetando as células cultivadas para fora da placa de 6 poços e para um tubo de centrífuga de 50 ml após pipetagem do meio de cultura para cima e para baixo algumas vezes.
- Contar as células e corar uma amostra de monócitos isolados com anticorpos anti-humanos contra CD11b, CD11c, e DC-SIGN / CD209, em conjunto com um corante de viabilidade celular. Para evitar a ligação inespecífica dos anticorpos durante a coloração da superfície, a utilização do receptor de Fc ou reagentes de bloqueio de albumina do soro de bovino (BSA) tampões é altamente recomendável.
- Analisar a amostra usando o corante de viabilidade celular, de acordo com o protocolo do fabricante, através da realização de citometria de fluxo para avaliar a pureza e viabilidade das iDCs gerados.
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Representative Results
Após centrifugação do sangue anti-coagulado usando uma almofada de sacarose, as células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são enriquecidas numa interfase no topo do meio de gradiente de densidade (Figura 1). Após as PBMC são retirados, a análise FACS é realizada para caracterizar as diferentes populações de células dentro das CMSPs usando marcadores de linhagem (por exemplo, para os linfócitos T CD3, CD14 para monócitos, e CD19 para linfócitos B). A Figura 2A mostra os resultados de uma análise FACS representativos de PBMC recolhidas e coradas após centrifugação em gradiente de densidade. Fora da população fechado (Figura 2A, lote superior), detectou 4,03% de linfócitos B, 28,20% de monócitos e 67,62% de outras células (Figura 2A, da trama do meio), dos quais 43,62% eram linfócitos T (Figura 2A, lote inferior ).
As PBMC são então incubadas Wom partículas magnéticas CD14 e, após a incubação em um íman, a fracção negativa contendo os linfócitos do sangue periférico (PBLs) são analisadas por FACS utilizando a selecção de marcadores de linhagem acima referidos. Em comparação com PBMC, medimos percentagens semelhantes de linfócitos B (4,65%, a Figura 2B, enredo média), percentagens mais elevadas de outras células (88,61%, Figura 2B, o enredo do meio) e fortemente reduzidas percentagens de monócitos (6,59%, Figura 2B , lote meio). Caracterização da fracção positiva (Figura 3) demonstrou uma eficiência de separação elevada, uma vez que a pureza das células isoladas é mais de 97% (Figura 3, gráfico da esquerda), dos quais 99,56% (Figura 3, gráfico da direita) expressaram niveis elevados de CD14 na superfície da célula.
IL4 e GM-CSF estimulação dos monócitos durante 5 dias resulta na diferenciação em células dendríticas derivadas de monócitoss, que são comparáveis aos dérmica células dendríticas na morfologia, comportamento e expressão do receptor 19. A análise FACS das células dendríticas derivadas de monócitos no dia 5 mostra uma população homólogas (Figura 4, gráfico da esquerda) que expressam níveis elevados de CD11b, CD11c (não mostrado), e a lectina do tipo C de DC-SIGN. Nenhuma expressão de DC CD83 maturação marcador é detectado (Figura 4, gráfico da direita), e também as células perdem o CD14 marcador de monócitos (não representada).
Figura 1: Separação de componentes do sangue por centrifugação com gradiente de densidade. As PBMCs são enriquecidas numa interfase no topo do meio de separação por centrifugação com gradiente de densidade. Camadas antes (esquerda) e depois (direita) centrifugação são mostrados. Por favorclique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A análise por citometria de fluxo de PBMC (A) e PBL (B). PBMC (A) são colhidas, coradas para marcadores de linhagem (CD3, CD14, e CD19 de rato-anti-humano), e analisadas por citometria de fluxo. gráficos de pontos de um resultado representativo são mostrados. (B) A fracção negativa contendo PBLs é caracterizada por marcadores de linhagem (CD3 de rato-anti-humano, CD14, CD19 e anticorpos) e analisadas por citometria de fluxo. gráficos de pontos de um resultado representativo são mostrados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: análise de citometria de fluxo de células dendríticas derivadas de monócitos. Os monócitos são estimuladas durante 5 dias com IL4 e GM-CSF e corados para marcadores característicos DC, como CD11b, CD11c (não mostrado), a lectina do tipo C de DC-SIGN, CD83 e do marcador de maturação. gráficos de pontos de um resultado representativo são mostrados.
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Discussion
Este protocolo descreve a geração de células dendríticas derivadas de monócitos (MDDCs) através do isolamento de monócitos humanos a partir de sangue anti-coagulado usando um ensaio baseado em nanopartícula magnética. Neste protocolo, os passos de centrifugação são realizados a montante do processo de isolamento de células, o que leva a um enriquecimento da fracção de PBMC. Embora as células são perdidas durante a centrifugação, para sobrepor o conteúdo de um saco de sangue inteiro no meio de gradiente de densidade exigiria 200-300 ml do meio de gradiente de densidade e, portanto, não pode ser considerado custo eficiente. Além disso, o enriquecimento de PBMC por centrifugação em resultados de uma população de células de líquido de limpeza, o que influencia positivamente a fixação das partículas magnéticas CD14 anti-humano durante o processo de isolamento. Isolamento magnético-nanopartículas de monócitos resulta numa população de monócitos viável, que pode ser ainda utilizado para a diferenciação in vitro de vários subconjuntos de DC ou macrófagos.
Alternativamente, as células dendríticas podem ser directamente isoladas a partir de biópsias da mucosa ou dérmica ou podem ser desenvolvidas a partir de células progenitoras hematopoiéticas isoladas a partir de amostras de sangue de cordão umbilical humano à saída útero CD34 +.
No entanto, MDDCs são o modelo mais largamente utilizado para as células dendríticas, uma vez que o isolamento directo a partir de biópsias de DCs é mais complexa de realizar. Ele também pode levar a um número de células ineficientes que variam frequentemente, devido a diferenças na qualidade de dador. Problemas semelhantes podem ocorrer quando as DCs são geradas a partir de células CD34 + isoladas estaminais do sangue do cordão.
Para futuras aplicações, células estaminais pluripotentes induzível (IPSCs) poderia ser usado ao invés de CD14-magnético isolamento talão de monócitos de sangue. As vantagens da utilização de iPSCs são que não apenas subconjuntos de DC, mas todas as células hematopoiéticas de interesse, podem ser gerados a partir de um dador (células T, células B, C e NKells) e que iPSCs específicos do paciente pode ser usado para caracterizar as interacções de células imunitárias autólogas de forma personalizada.
O passo mais importante durante o isolamento de monócitos é a fase de centrifugação em gradiente de densidade, uma vez que a separação precisa das células de sangue vermelhas e brancas só é alcançado quando o travão da centrífuga é desligada. Este determina o resultado da eficiência de isolamento a jusante.
Em conclusão, este protocolo é uma maneira muito rápida, eficiente e de baixo custo para gerar uma população de células dendríticas derivadas viável e homogénea através do isolamento de monócitos humanos a partir de sangue anti-coagulado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC Mouse Anti-Human CD19 Clone HIB19 | BD Biosciences | 555415 | |
| APC Mouse Anti-Human CD83 Clone HB15e | BD Biosciences | 551073 | |
| BD Imag Anti-Human CD14 Magnetic Particles | BD Biosciences | 557769 | |
| BD Imagnet | BD Biosciences | 552311 | |
| BSA (Albumin Fraction V) | Carl Roth | EG-Nr 2923225 | |
| Costar 6 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates | Costar | 3506 | |
| Density gradient media: Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare Bio-Sciences | 17-5442-03 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (D-PBS) | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Falcon 10 ml Serological Pipet | Corning | 357551 | |
| Falcon 25 ml Serological Pipet | Corning | 357525 | |
| Falcon 50 ml High Clarity PP Centrifuge Tube | Corning | 352070 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | 352054 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD3 Clone HIT3a | BD Biosciences | 555339 | |
| Ghost Dye Violet 510 (Cell Viability Reagent) | Tonbo biosciences | 13-0870 | |
| GM-CSF | MACS Miltenyi Biotec | 130-093-862 | |
| Heat Inactivated FBS (Fetal Bovine Serum), EU Approved Origin (South America) | Gibco | 10500-064 | |
| Hettich Rotanta 460R | Hettich | --- | |
| IL-4 CC | PromoKine | C-61401 | |
| Isolation buffer: BD IMag Buffer (10x) | BD Biosciences | 552362 | |
| L-Glutamine solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| Microcentrifuge tubes, 1.5 ml, SuperSpin | VWR | 211-0015 | |
| PE Mouse Anti-Human CD14 Clone M5E2 | BD Biosciences | 555398 | |
| PE Mouse Anti-Human CD209 Clone DCN46 | BD Biosciences | 551265 | |
| RPMI-1640 medium | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575020 |
References
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