Abstract
מחקרים של חלבונים בממברנה נפרדים במבחנה מסובך לעתים קרובות על ידי הנוכחות של תחום הטרנסממברני הידרופובי. שמסבך עוד יותר את המחקרים הללו, reincorporation של חלבונים בממברנה דטרגנט-solubilized לתוך ליפוזומים הוא תהליך סטוכסטיים שבו טופולוגיה חלבון אי אפשר לאכוף. מאמר זה מציע שיטה חלופית לטכניקות מאתגרות אלו אשר מנצלות פיגום מבוסס liposome. מסיסות חלבון מוגברת על ידי מחיקה של תחום הטרנסממברני, וחומצות אמינו אלה מוחלפים עם מחצית קשירה, כגון תג שלו. לקשור זה אינטראקציה עם קבוצת עיגון (Ni 2 + מתואם על ידי חומצה nitrilotriacetic (נ.ת.ע (Ni 2 +)) עבור חלבונים שלו מתוייגים), אשר כופה טופולוגיה חלבון אחידה על פני השטח של liposome. דוגמה מוצגת שבה האינטראקציה בין הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) עם חלבון ממברנלי אינטגרלי, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), היה investigated בשיטה ליפוזום פיגום זה. בעבודה זו, אנו הדגמנו את היכולת של MFF לגייס מסיסי Drp1 ביעילות אל פני השטח של ליפוזומים, אשר עורר פעילות GTPase שלה. יתר על כן, Drp1 הצליח tubulate תבנית השומנים המעוטר MFF בנוכחות שומנים ספציפיים. דוגמא זו ממחישה את האפקטיביות של ליפוזומים פיגום באמצעות מבחנים מבניים ותפקודיים ומדגישה את תפקיד MFF בהסדרת פעילות Drp1.
Introduction
לימוד אינטראקציות קרום הפרוקסימלי חלבונים הוא מאמץ מאתגר בשל קושי משחזר את הסביבה הטבעית של חלבונים בממברנה נפרדים המעורבים 1. זאת בשל הצורך של solubilization דטרגנט ואת הכיוון הלא סדירה של חלבונים proteoliposomes. על מנת למנוע בעיות אלה, יש לנו עובדים אסטרטגיה לפיה תחומים מסיסים של חלבונים בממברנה נפרדים מבוטאות חלבוני היתוך התג שלו, ושברי מסיסים אלה מעוגנים ליפוזומים פיגום באמצעות אינטראקציות עם נת"ע (Ni 2 +) headgroups על השומנים משטח. באמצעות פיגומים אלה, אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי שומנים יכולות להיחקר על פני טווח של קומפוזיציות שומנים וחלבונים.
יש לנו ליישם ביעילות בשיטה זו כדי לחקור את יחסי הגומלין בין חלבונים הקריטיים השולטים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה ולבחון אינטראקציות שומנים לווסת pr זהocess 2. במהלך ביקוע המיטוכונדריה, חלבון שיפוץ קרום משומר, שנקרא הקשורה Dynamin חלבון 1 (Drp1) 3, מגויסת אל פני השטח של הממברנה החיצונית מיטוכונדריאלי (OMM) בתגובה לאותות הסלולר המווסתים הומאוסטזיס אנרגיה, איתות אפופטוטיים, וכמה אחרים תהליכי המיטוכונדריה נפרדים. GTPase גדול, cytosolic זה גייס אל פני השטח של המיטוכונדריה דרך אינטראקציות עם חלבונים OMM אינטגרלי 4 - 8. תפקידו של חלבון אחד כזה, פקטור ביקוע מיטוכונדריאלי (MFF), כבר קשה להבהיר עקב אינטראקציה חלשה לכאורה עם Drp1 במבחנה. אף על פי כן, מחקרים גנטיים הראו בבירור כי MFF חיונית 7,8 ביקוע המיטוכונדריה מוצלח. השיטה המתוארת בכתב היד הזה הייתה מסוגלת להתגבר על חסרונות קודמים על ידי החדרת אינטראקציות שומנים סימולטני המקדמות אינטראקציות Drp1-MFF. בסך הכל, revea assay הרומן הזההובל כוחות יסוד המנחים הרכבה של מתחם ביקוע המיטוכונדריה וספק שלב חדש ללימודי מבניים ותפקודיים מתמשכים של מכונה מולקולרית חיונית זה.
נכון להיום, בחינת יחסי הגומלין בין Drp1 ו MFF כבר מסובך בגלל הגמישות המובנית של MFF 9, ההטרוגניות של Drp1 פולימרים 2,10, והקושי מטהרים reconstituting באורך מלא MFF עם תחום הטרנסממברני שלם 11. טיפלנו אתגרים אלה באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ליפוזומים פיגום כדי לשקם MFF מתויג שלו חסר תחום הטרנסממברני שלה (MffΔTM-שלו 6). אסטרטגיה זו הייתה יתרון משום MffΔTM היה מסיס מאוד כאשר ביטוי יתר ב E. coli, וחלבון מבודד זה היה מחדש בקלות על ליפוזומים הפיגום. כאשר קשור לתבניות השומנים האלה, MFF להניח אוריינטציה זהה, פונים כלפי חוץ על פני הממברנה.בנוסף יתרונות אלה, שומנים המיטוכונדריה, כגון cardiolipin, נוספו לייצב מתקפלים וההתאגדות MFF עם קרום 11. Cardiolipin גם אינטראקציה עם התחום המשתנה של Drp1 2,12 אשר עשוי לייצב באזור המופרע הזה ולהקל הרכבה של מכונות הביקוע.
שיטה חזקה זו ישימה נרחב למחקרים עתידיים המבקשים להעריך אינטראקציות חלבון-הפרוקסימלי הממברנה. באמצעות שימוש אינטראקציות קשירה / זיקה נוספות, התחכום של מחקרי כינון מחדש קרום אלה ניתן לשפר כדי לחקות מורכבות נוספת נמצאת על פני השטח של ממברנות בתוך תאים. במקביל, קומפוזיציות שומנים ניתן לשנות באופן מדויק יותר לחקות את סביבות יליד מתחמי macromolecular אלה. לסיכום, שיטה זו מספקת אמצעי לבחינת התרומה היחסית של חלבונים ושומנים בעיצוב מורפולוגיות הממברנה במהלך proc הסלולר הקריטיesses.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. הכנת Liposome פיגום
הערה: באופן אידיאלי, ניסויים ראשוניים צריכות להשתמש פיגום פשוט חסר ייחוד יחסית (מורכב dOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine או PC) DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) (1,2-dioleoyl - SN -glycero-3 - [(N - (5-אמינו-1-carboxypentyl) חומצת iminodiacetic) succinyl]. (מלח ניקל)) בניין הנחה של ניסויים אלה, פריצת שומנים, גמישות, ועקמומיות ניתן הציג כגורמים בודדים עם הפוטנציאל לשנות אינטראקציות קרום הפרוקסימלי. ניתן להשיג שינויים אלה על ידי הוספת כמויות מוגדרות של מרכיבי שומנים ספציפיים, כולל phosphatidylserine או cardiolipin (CL), phosphatidylethanolamine (סמים או PE), או galactosyl ceramide (β).
- מערבבי שומנים מומסים כלורופורם במבחנת זכוכית נקיה. להתאדות ממס עם גז חנקן יבש תוך כדי סיבוב הצינור כדי ליצור סרט שומנים דק. הסר ממס שיורים עם centrifugaמאייד l עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס.
הערה: ניסוחים liposome שונים משמשים הפרוטוקולים המתואר להלן: ליפוזומים פיגום (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 96.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipin / 86.7 mol% dOPC), ליפוזומים פיגום גמישה עם cardiolipin (3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 10 mol% cardiolipin / 35 DOPE mol% / 51.7 mol% dOPC), ו הפיגום מועשר ליפוזומים (10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +) / 15 mol% cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 mol% dOPC). - להוסיף הצפת (25 HEPES מ"מ (4- (2-hydroxyethyl) חומצה -1-piperazineethanesulfonic), 150 מ"מ KCl, pH מותאם 7.5 עם KOH) שחומם מראש ל 37 מעלות צלזיוס כך ריכוז השומנים הסופי הוא 1 - 2 מ"מ. דגירה 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס עם vortexing מזדמנים resuspend את תערובת שומנים לחלוטין (איור 1 א).
- מעבירים צינור מבחן פלסטיק, במקום צינור בחנקן נוזלי עד קפוא לחלוטין (roughly 30 s), ומניחים באמבט מים C ° 37 עד מופשר לחלוטין (בערך 1 - 2 דקות). חזור עבור סכום כולל של 4 מחזורים להקפיא להפשיר (איור 1b).
- הכין מכבש שומנים על ידי השריית 4 תומך מסנן ומסנן פוליקרבונט במאגר והרכבת המכבש לפי הוראות יצרן. Extrude פתרון השומנים דרך המסנן 21 פעמים. עדין, לחץ מתמיד על מנת להבטיח חלוקת גודל הומוגנית (איור 1 ג ').
הערה: עבור כל הניסויים המתוארים בפרוטוקול זה, 1.0 מיקרומטר פוליקרבונט הסינון שימש שחול. האינטראקציה Drp1 עם שומנים anionic ניתן לצפות עם מגוון רחב של קטרים liposome הנעים בין 50 ננומטר עד 400 ננומטר 12 ומעלה 13. לפיכך, גודל המסנן של 1 מיקרומטר נבחר להיות אידיאלי הוא פעילות GTPase ועבור במיקרוסקופ אלקטרונים. אם קטרי liposome אחרים הם רצויים, הכנת שלפוחית unilamellar הענקית 14,15 (GUVs) או unilamell הקטןar שלפוחית 16 (רכבי שטח) ניתן להשתמש. ניתן להשתמש פיזור אור דינאמי להעריך ההטרוגניות גודל liposome 13. - אחסן ליפוזומים הנמתח על 4 מעלות צלזיוס וזורקים לאחר 3 - ד 5.
2. שימוש הפיגום ליפוזומים עבור ניתוח חלבון מחייב
- לדוגמא הכנה
- דגירה MffΔTM שלו מתויג (5 מיקרומטר הסופי) עם ליפוזומים פיגום (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +); 50 מיקרומטר הסופי) לפחות 15 דקות ב RT הצפת + BME (25 HEPES מ"מ, 150 מ"מ KCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol (BME), pH מותאם 7.5 עם KOH). עבור פקד MFF ללא, דגירה ליפוזומים עם חלבון לשליטתו מתויג (כגון GFP) להיקשר ומגן החשוף נ.ת.ע (Ni 2 +).
הערה: MffΔTM התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. GFP היה מטוהר באופן דומה, אך צעד חילוף יונים הושמט. BME נדרשה experimen אלהts כי Drp1 רגיש חמצון, אשר יכול לשנות תכונות הפעילות והרכבה שלו. - להוסיף Drp1 (2 מיקרומטר הסופי) ו דגירה של 1 ש 'ב RT.
הערה: Drp1 התבטא וטיהר כמתואר במחקר קודם 2. לאחר הדגרה עם Drp1, השפעת נוקלאוטיד מחייב על עיוות הממברנה יכול להיחקר על ידי דוגרים שעה נוספת אחת עם 2 מ"מ MgCl 2 ואו 1 מ"מ GTP, 1 מ"מ GMP-PCP, או הצפת + BME.
- דגירה MffΔTM שלו מתויג (5 מיקרומטר הסופי) עם ליפוזומים פיגום (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +); 50 מיקרומטר הסופי) לפחות 15 דקות ב RT הצפת + BME (25 HEPES מ"מ, 150 מ"מ KCl, 10 מ"מ β-mercaptoethanol (BME), pH מותאם 7.5 עם KOH). עבור פקד MFF ללא, דגירה ליפוזומים עם חלבון לשליטתו מתויג (כגון GFP) להיקשר ומגן החשוף נ.ת.ע (Ni 2 +).
- ניתוח הילוכים הכתמים שליליים מיקרוסקופי אלקטרונים (EM)
- העברת 5 μL של המדגם כדי סדין של סרט במעבדה, ויניח רשת Rh Cu / מצופה פחמן על המדגם. דגירת דקות רשת 1 על המדגם, למחוק משם נוזל עודף על נייר סינון, ולהעביר לירידה של אצטט uranyl 2%. דגירת 1 דקות, כתם כתם עודף על נייר סינון, ומעביר תיבת רשת. חנות תחת ואקום O / N כדי להבטיח התייבשות מלאה.
- דגימות תמונה באמצעות microsc אלקטרוני הילוכיםאופ ב 18,500 - 30,000X הגדלה לצפות לשינויי ultrastructural ב מורפולוגיה חלבון liposome 17.
הערה: שינויי ultrastructural ניתן לכמת באמצעות תוכנת ניתוח תמונה, כגון 13 ImageJ (http://imagej.nih.gov/ij/). קישוט החלבון ניתן למדוד בהשוואת תבניות שומנים עירום. בנוסף, בקטרים של מגזרים צינורי ניתן למדוד מהחלק החיצוני של המכלולים 13. ניתוח מפורט יותר ניתן לבצע באמצעות מיקרוסקופ אלקטרוני cryo- 17. שיטה זו יכולה לשמש כדי תמונה מקורית מכלולים חלבון-שומנים ממס ללא שימוש כתמים מתכת כבדה אשר מעיל המדגם. בדרך זו, תכונות מבניות מפורטות לא ניכרו כתם שלילי, לרבות שינויים במורפולוגיה השומנים הבסיסיות, ניתן לבדוק לכמת.
3. השימוש של הפיגום ליפוזומים עבור אנזימתי Assay
הערה: Coloriassay GTPase מטרי 18 שימש למדידת שחרור פוספט באמצעות הידרוליזה GTP. מבחני GTPase חלופיים זמינים 19 והוא יכול להיות מיושם על פי הצורך.
- דגירת MffΔTM המתויג שלו (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), או GFP (5 מיקרומטר סופי עבור כל) עם ליפוזומים פיגום (150 מיקרומטר סופיים) במשך 15 דקות ב RT הצפה + BME (נפח = 30 μL). להוסיף Drp1 (500 סופי ננומטר) דגירת דקות נוספות 15 ב RT (נפח = 80 μL).
הערה: Fis1 היה מטוהר באופן דומה MFF 2, אבל הצעד כרומטוגרפיה-חילוף יונים הושמט. מטרת GFP המתויג שלו היא להגן על נ.ת.ע (Ni 2 +) headgroups ולמנוע אינטראקציות תשלום ספציפיות עם חלבונים אחרים. אם אין כל השפעה נצפית בהעדר GFP, אז פקד זה לא ייתכן שיידרש. חלבוני חסימה אלטרנטיביים (גודל דומה לחלבון של עניין) יכולים לשמש גם, אבל GFP מאפשר הדמיה ישירה של אינטראקציות עם scafלקפל ליפוזומים. - העברת צינורות אל thermocycler מוגדר 37 ° C, ליזום תגובות על ידי תוספת של GTP ו MgCl 2 (1 מ"מ ו -2 הסופי מ"מ, בהתאמה; נפח = 120 μL).
- בנקודות הזמן הרצוי (כלומר T = 5, 10, 20, 40, 60 דק '), להעביר 20 μL של תגובה הבארות של צלחת microtiter המכיל 5 μL של 0.5 M EDTA כדי Chelate Mg 2+ ולעצור את התגובה.
- להכין סט של סטנדרטים פוספט על ידי דילול KH 2 PO 4 ב הצפה + BME לכייל תוצאות. קבוצה יעילה של סטנדרטים היא 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, ו -0 מיקרומטר. הוסף 20 μL של כל בארות המכילות 5 μL של 0.5 M EDTA.
- הוספת 150 μL של מלכיט מגיב ירוק (1 מ"מ קרבינול ירוק מלכיט, 10 מ"מ אמוניום molybdate tetrahydrate ו -1 N HCl) זה טוב, ולקרוא OD 650 5 דקות לאחר תוספת.
הערה: GTP הוא חומצה יציבה, ויהיה hydrolyze בנוכחות מגיבה ירוק מלכיט. ודא tהוא הזמן בין הוספת מגיב מלכיט והקריאה הוא קבוע על מנת להבטיח תוצאות לשחזור. - צור עקומת סטנדרט ידי התוויית OD 650 של סטנדרטים כפונקציה של ריכוז פוספט. השתמש רגרסיה ליניארית כדי לקבוע את הקשר בין OD 650 ו ריכוז פוספט במדגם.
- באמצעות רגרסיה ליניארית, להמיר את OD 650 של דגימות תגובת חלבון פוספט מיקרומטר. לקבוע את שיעור דור פוספט עבור כל תערובת תגובה על ידי התוויית ריכוז פוספט כפונקציה של זמן, ולהמיר k חתול על ידי חלוקת הריבית על ידי ריכוז Drp1 (0.5 מיקרומטר).
הערה: רק השיעור ליניארי הראשוני אמורה לשמש כדי לקבוע את שיעור דור פוספט, ומינימום של 3 נקודות נתונים חייב לשמש. אם קצב התגובה הוא מהיר מספיק ששלושת נקודות הנתונים הראשונות הם לא ליניארי (כלומר r 2 של ההתאמה ליניארית הוא פחות מ 0.9) סימןificantly קצר כמובן זמן עם נקודות זמן לפחות 3 צריך להתבצע.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעוד האינטראקציה בין Drp1 ו MFF הודגמה להיות חשוב לביקוע המיטוכונדריה, אינטראקציה זו כבר קשה לשחזר במבחנה. מטרתנו הייתה לחקות את הסביבה התאית טוב יותר שבו Drp1 ו MFF אינטראקציה. לשם כך, ליפוזומים המכילים ריכוזים הגבלת נת"ע (Ni 2 +) headgroups הוכנו על ידי rehydrating סרט השומנים כמתואר לעיל. פתרון השומנים בתחילה מורכב שלפוחית unilamellar ו multilamellar בקטרים הטרוגנית כפי שמעיד האטים (איור 1 א) הפתרון. אטימות זו מופחתת באמצעות פשרת הקפאה (איור 1b), אשר מפחיתה את השכיחות של שלפוחית multilamellar. בקטרים ליפוזום הם הומוגני יותר על ידי שחול דרך פילטר פוליקרבונט, שתוצאתה פתרון ברור (איור 1 ג ').
"1"> במחקרים קודמים, מצאנו כי Drp1 הצליח להרכיב על ליפוזומים פיגום MFF-מעוטר, צִנוּר הקרום נצפה כאשר ממברנות גמישות הועסקו 2. בונה על ממצאים אלה, השתמשנו תבנית חדשה המורכבת PC, PE, Ni, ו CL (המכונה מועשר הפיגום ליפוזומים או ESL) כדי לקדם את הרכבת הורה של מסוגל מורכבת-MFF Drp1 פולימריים של גרימת עיוות הממברנה. באופן ספציפי, גדל נ.ת.ע (Ni 2 +) ושומנים cardiolipin נוצלו (10% מול 15 mol% בהתאמה) עבור יישום זה. לאחר מכן, GFP או MFF היה קשור אל תבניות ESL בנוכחות והיעדר Drp1 (איור 2), ואת היכולת של Drp1 לשפץ ממברנות הוערכה איכותית. בהעדר Drp1, לא MFF ולא GFP הביא דפורמציה קרום (איור 3 א, ב), ובאופן דומה במקרה של ESL GFP-מעוצבים, ליפוזומים ייחוד רק נצפו (איור 3c). עם זאת, כאשר DRP1 התווסף תבניות ESL מעוטר MFF, שיפוץ של ליפוזומים ניכר (איור 3D).
בעוד היווצרות מורכבת מולקולארית בבירור אינטראקציה בין Drp1 ו MFF, ניתוח איכותני זה לבד אינו מסוגל לקבוע את ההשפעות התפקודיות של אינטראקציה כזו. לכן, השתמשנו assay דור פוספט ירוקה מלכיט 18 להעריך שינויי הפעילות הקטליטית של Drp1 בתגובת אינטראקציה עם MFF. כפי שתואר קודם לכן 2, בתחילה השתמשנו ליפוזום פיגום פשוטה (SL; 3.3 mol% DGS-נ.ת.ע (Ni 2 +), 96.7 mol% dOPC) כדי לחקור את ההשפעה של MFF לבד על מבנה Drp1 ותפקוד. אינטראקציה ספציפית של Drp1 עם נת"ע (Ni 2 +) תואר בעבר 20, כך SL תוכנן בתחילה להכיל ריכוזים נמוכים של נ.ת.ע (Ni 2 +) כדי למנוע גירוי פעילות ספציפי של ד"רp1. עם כמויות גדולות יותר של נ.ת.ע (Ni 2 +) ב ESL, השימוש GFP-tagged שלו כביקורת נמצאה קריטי להגן על Ni 2 + ולמנוע אינטראקציות Drp1 הלא ספציפית. לאחר הקישוט של ליפוזומים SL ידי MFF או GFP (כפי שמודגם באיור 2), במידה של הרכבה עצמית ניתן להעריך על ידי מדידת פעילות GTPase של Drp1. בהעדר ליפוזומים, Drp1 יש פעילות GTPase בסיס נמוכה יחסית, אשר משופרת מעט על ידי תוספת של SL. קישוט של ליפוזומים פיגום אלה עם MFF משופרת פעילות GTPase (איור 4 א, 1.8 לקפל). לעומת זאת, כאשר נחשף נ.ת.ע (Ni 2 +) headgroups נחסמו עם GFP-tagged שלו, פעילות GTPase augmented זה היה ablated. בדקנו גם את התפקיד של Fis1, חלבון OMM כי הוצע להם תפקיד ביקוע המיטוכונדריה 21,22, אם כי זה כבר לערער במחקרים האחרונים 7,23. קשירה של Fis1 חסר תחום הטרנסממברני שלהגם SL לא הצליח להביא גירוי של פעילות GTPase של Drp1 (איור 4 א).
אז ניצלנו פיגום השומנים מורכבים מעט יותר המכיל כמות קטנה של cardiolipin (SL / CL: SL עם 10 mol cardiolipin% החלפת dOPC) כדי לקבוע את התפקיד של השומנים המיטוכונדריה זה באינטראקציה של Drp1 ו MFF. ריכוז מתון זו של cardiolipin נבחר במיוחד כדי להגביל את הגירוי של Drp1 ידי cardiolipin כפי שתואר לעיל 10. בדומה SL, תוספת של SL / CL כדי Drp1 הביאה גירוי קל של פעילות GTPase כי התהפך על ידי הקשירה שלו מתויג Fis1 או GFP אל ליפוזומים. סינרגיה בין MFF ו cardiolipin נצפתה כמו פעילות GTPase של Drp1 היה מגורה 2.6 לקפל כשזה הודגר עם MFF מעוטרים SL / CL (איור 4 ב).
נזילות ממברנה והיכולת of Drp1 לשפץ bilayers שומנים הוצע לתגבור פעילות GTPase שלה. לכן, בקשנו לבחון את השפעת נזילות הממברנה / גמישות באמצעות ליפוזום פיגום גמיש. זו הושגה על ידי החלפת 35 mol% של dOPC ב SL / CL בסמים (SL / PE / CL), אשר הוכח בעבר כדי לאפשר קרום בתיווך Drp1 שיפוץ 10. תוספת של ליפוזומים פיגום undecorated SL / PE / CL כדי Drp1 מעט משפר פעילות GTPase Drp1, ודקורציה של ליפוזומים אלו עם GFP מבטל את האפקט הזה. כאשר SL / PE / תבניות CL עוטרו MFF, פעילות Drp1 היה משופר (איור 4C, 2.4 לקפל). כפי שהראינו קודם לכן, היכולת של Drp1 לשפץ ליפוזומים לתוך tubules השומנים היה משופר על ידי תוספת של PE אל ליפוזומים הפיגום. מעניין, צִנוּר משופרת זו המוביל להיווצרות של פולימר Drp1 הסליל לא לגרום גירוי כלשהו יותר כשמשווים ליפוזומים כי Drp1 לא הצליח לשפץ שימוש בתבניות שומנים וישימים אלה, MFF ו Drp1 נמצאו אינטראקציה בסביבת יליד יותר במבחנה. טכניקה זו אפשרה לנו לשלוט על השפע היחסי של Drp1, MFF (באמצעות נ.ת.ע (Ni 2 +) ריכוז), ושומנים ספציפיים (cardiolipin ו- PE במיוחד) שהופיעו להסדיר את הרכבה של מורכבות מולקולארית זה. כפי שהראנו, שיטה זו יכולה להיות מנוצלת כדי להמחיש את שיפוץ הממברנה של Drp1 MFF-גויס על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים, וכדי לקבוע את ההשפעות של הרכבת Drp1 על הפעילות הקטליטית שלו באמצעות assay פעילות GTPase. 71fig4.jpg "/> 
איור 1: ליפידים הכנה סכמטי. (א) לפי resuspension, ליפוזומים בגדלים מגוונים להיווצר מורכב unilamellar ו multilamelשלפוחית lar, שתוצאתה פתרון אטום (הבלעה). (ב) להקפיא-מפשיר את תוצאות הפתרון באוכלוסיית unilamellar יותר של ליפוזומים, אשר עדיין הטרוגנית בקוטר. Freeze-הפשרה מבהיר הפתרון (הבלעה). שחול (ג) של הפתרון השומנים והומוגניזציה בקוטר liposome (1.0 מיקרומטר בדוגמה זו), וכתוצאה מכך פתרון ברור (הבלעה). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 2: שיטות להערכת הרכבת חלבון. עצרת חלבון סכמטי המתאר פרטנר ליפוזומים פיגום מוצגת. חלבונים או GFP שותפיו מתויג מודגרת עם ליפוזומים פיגום, ולאחר מכן Drp1 הוא מודגרות עם שאיבה מעוצבת או מקושטת Somes. ליפוזומים Drp1-preassembled אלה לאחר מכן ניתן לנתח בשיטות מבניות (במיקרוסקופ אלקטרונים) מבחנים תפקודיים (assay GTPase). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 3: הערכה מבנית של Drp1 גיוס. Micrographs שידור כתם שלילי של GFP או MFF מעוצבים ליפוזומים בלבד (A, B, בהתאמה) או מודגרות עם Drp1 (C, D, בהתאמה). סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: Assay אנזימתי Liposome הפיגום. (A - C) הדור של פוספט לאורך הזמן נמדד (הבלעה), וחתול k נקבע. שיטה זו יושמה לחלבונים-קשור SL (א), SL / חלבונים קשורים CL (B), או SL / PE / חלבונים קשורים CL (C). #: P <0.05, *: p <0.0001, **: p <0.000001 כפי שנקבע על ידי מבחן t מזווג. כל ברי השגיאה מייצגים סטיית התקן מ 3 דגימות עצמאיות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול זה מציע שיטה לחקירת אינטראקציות בין חלבונים מעורבים חלבונים בממברנה נפרד. על ידי ניצול פיגום ליפוזום מודולרי, חוקרים מסוגלים להעריך את הפעילות של חלבונים אחד או יותר בסביבת שומנים הפרוקסימלי. מחקרים קודמים הוכיחו בשיטה דומה עבור אנזימי קולטן של קרום הפלזמה 24 - 26. הרחבנו בשיטה זו כדי לשלב קו-פקטורי שומנים ולחקור אינטראקציות בין חלבונים שמרכיבים את ליבת mechanoenzymatic של מכונות ביקוע המיטוכונדריה.
עבור מערכת המודל המוצג לעיל, מצאנו כי MFF מעוטרים SL משופרת Drp1 הרכבה עצמית. יתר על כן, אנו מציגים כעת כי, תבניות ESL מעוטר MFF היו שופצו בצורה יעילה על ידי Drp1 wild-type כדי ליצור מבנים צינוריים מורחבים. גם חוקרים העריכו את התפקידים של שומנים המיטוכונדריה שונים, לרבות cardiolipin הטעון השלילי ואת PE השומנים חרוטי.Cardiolipin synergizes עם MFF כדי לשפר הרכבה עצמית Drp1 נוספת, בעוד גמישות קרום ובזרימה הנחילה ידי PE משפר צִנוּר הממברנה אך אינו נוספת להגדיל גירוי MFF-induced.
כדי להעריך את שינויי ultrastructural ב מורפולוגיה קרום, EM ניתוחי נדרש. פעילות GTPase Drp1 היה מורם באמצעות אשכולות והרכבה של פולימרים filamentous שלא לעצב מחדש את ליפוזומים במידה כלשהי 2 גדול. עם זאת, עיוות הממברנה נצפתה כאשר שימש יותר המיטוכונדריה דמוי SL / PE / תבנית CL. מעניין לציין, כי פעילות האנזים לא הייתה משופרת. לכן, מחקרי EM היו חיוניים בזיהוי הבדלים עיקריים שאחרת לפספס באמצעות assay התפקודית.
בעוד טכניקה זו היא חזקה המעוניינים לבדוק את התפקוד ואת האינטראקציה של חלבונים מסיסים תחומי חלבון מסיסים, פיגומי השומנים האלה לא יכולים להסביר את תפקידה של תחום הטרנסממברניים. זהו שיקול חשוב כי תחום הטרנסממברני יכול לחולל תהליכי חלבון דינמיים כגון הרכבה עצמית 27 ו דיפוזיה לרוחב 28 - 30 bilayers שומנים. אם הגורמים הללו הם קריטיים להערכת אינטראקציות חלבון על פני שטח הקרום, אז ניסויי כינון מחדש שומנים מסורתיים עם חומר ניקוי היו להיות מועדפים. רצועות חלופיות יכולות גם להיחקר לשלוט הגיוס וניידות של החלבונים מעוגני הממברנה.
בנוסף לשימוש חלבונים שלו מתויגים עם נת"ע (Ni 2 +) עוגני שומנים, רצועות אחרות כגון שומני קבוצת מצומדות ביוטין מצומדות 31 או תגובתי יכולות להיות מנוצלות. שינויים קוולנטיים אלה היו חלבונים מלכודת יותר ביציבות על פני שטח השומנים, אבל ניידות וחילוף הגורמים הללו יצומצמו סבירים. ככזה, את הרצועה יש לשקול בזהירות בהקשר של קומפלקסי החלבונים נלמדים. כאשר consideלצלצל שימוש בשיטה זו, במצב של קשירת חלבונים לתבניות שומנים יש הפוטנציאל להשפיע מבחנים מסוימים. למשל, קשירת התג-שלו נ.ת.ע (Ni 2 +) שיטה עשויה להיות יותר מתאימה מבחנים בהאתר ולא ניסויי הפרדה, במיוחד במקרה של אינטראקציות חלבון-חלבון חולפים. זו באה לידי ביטוי בבירור באיור 3 על ידי ההתאמה בין באתרו במיקרוסקופ האלקטרונים הכתמים השלילי ואת assay השקיעה.
בעתיד, שילוב של שניים או יותר של שומנים העוגנים אלה עם headgroups היעד ברור יכול להיות מיושם על מנת לאפשר גיוס של חלבונים מרובים לתבנית פיגום ללא תחרות על גבול שומנים יחיד. יתר על כן, את השפע היחסי של כל רכיב יכול להיות מנוהל על ידי שינוי הרכב השומנים. קו-פקטורי שומנים נוספים, כגון phosphoinositides, cardiolipin, ו phosphatidylserine, יכול להיות הציגו בקלותבתבניות אלה להעריך את ההשפעה המבודדת של מגוון גורמים.
בסך הכל, פיגומי השומנים הללו מייצגים פלטפורמה חדשנית לחקירת אינטראקציות חלבון מורכבות ליד ממברנות שומנים בדם. תבניות אלה נוצרות בקלות והם פשוט כדי להתאים למגוון של יישומים שונים, כולל מבחני האנזימטית, מיקרוסקופית אלקטרונים, או דימות פלואורסצנטי. בנוסף, הרכב השומנים אפשר לנסח להידמות microdomain אברון או קרום עניין לשחזר תפקוד החלבון טוב יותר באזורים ספציפיים אלה. שימוש בשיטות אלה, ביוכימאים יכולים לחקור את יחסי הגומלין המורכבים של קרום כבול חלבונים הקשורים הממברנה עם בני זוגן לבין סביבתם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
