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Biochemistry

पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने Published: January 11, 2017 doi: 10.3791/54971
Automatic Translation
1, 1
1Department of Pharmacology, Center for Mitochondrial Diseases, The Cleveland Center for Membrane and Structural Biology, Case Western Reserve University School of Medicine

Abstract

इन विट्रो में अभिन्न झिल्ली प्रोटीन का अध्ययन अक्सर एक हाइड्रोफोबिक transmembrane डोमेन की मौजूदगी से जटिल कर रहे हैं। इसके अलावा इन अध्ययनों उलझी, liposomes में डिटर्जेंट solubilized झिल्ली प्रोटीन की reincorporation एक स्टोकेस्टिक प्रक्रिया जहां प्रोटीन टोपोलॉजी लागू करने के लिए असंभव है। इस पत्र इन चुनौतीपूर्ण तकनीक है कि एक liposome आधारित पाड़ का इस्तेमाल करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। प्रोटीन घुलनशीलता transmembrane डोमेन का विलोपन द्वारा बढ़ाया है, और इन अमीनो एसिड जैसे एक उनकी टैग के रूप में, एक tethering आधा भाग के साथ बदल रहे हैं। यह तार एक प्रस्तोता समूह (नी 2 + nitrilotriacetic एसिड (NTA (नी 2 +)) उनकी टैग प्रोटीन के लिए समन्वित द्वारा) है, जो liposome की सतह पर एक समान प्रोटीन टोपोलॉजी लागू करता है के साथ सूचना का आदान प्रदान। एक उदाहरण प्रस्तुत किया है जिसमें एक अभिन्न झिल्ली प्रोटीन, mitochondrial विखंडन फैक्टर (एमएफएफ) के साथ Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) के बीच बातचीत, inve थाइस पाड़ liposome विधि का उपयोग stigated। इस काम में, हम एमएफएफ की क्षमता को कुशलता से liposomes की सतह है, जो अपनी GTPase गतिविधि के लिए प्रेरित करने के लिए घुलनशील Drp1 भर्ती करने के लिए प्रदर्शन किया है। इसके अलावा, Drp1 विशिष्ट लिपिड की उपस्थिति में एमएफएफ सजाया लिपिड टेम्पलेट tubulate करने में सक्षम था। यह उदाहरण संरचनात्मक और कार्यात्मक assays का उपयोग पाड़ liposomes की प्रभावशीलता को दर्शाता है और Drp1 गतिविधि को विनियमित करने में एमएफएफ की भूमिका पर प्रकाश डाला गया।

Introduction

झिल्ली-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत का अध्ययन 1 शामिल अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के देशी पर्यावरण recapitulating में कठिनाई के कारण एक चुनौतीपूर्ण प्रयास है। इस डिटर्जेंट solubilization की आवश्यकता है और proteoliposomes में प्रोटीन की असंगत रुख के कारण है। आदेश में इन मुद्दों से बचने के लिए, हम एक रणनीति है जिसके तहत अभिन्न झिल्ली प्रोटीन के घुलनशील डोमेन उनकी टैग संलयन प्रोटीन के रूप में व्यक्त कर रहे हैं कार्यरत है, और इन घुलनशील टुकड़े लिपिड पर NTA (नी 2 +) headgroups के साथ बातचीत के माध्यम से पाड़ liposomes के लिए लंगर डाले जाते हैं सतह। इन scaffolds का प्रयोग, लिपिड समीपस्थ प्रोटीन बातचीत लिपिड और प्रोटीन रचनाओं की एक सीमा से अधिक जांच की जा सकती है।

हम प्रभावी रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत है कि mitochondrial विखंडन परिसर के विधानसभा शासन की जांच और लिपिड बातचीत है कि इस जनसंपर्क मिलाना जांच करने के लिए इस पद्धति लागू की गई हैocess 2। Mitochondrial विखंडन के दौरान, एक संरक्षित झिल्ली remodeling प्रोटीन, Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 (Drp1) 3 बुलाया, सेलुलर संकेत है कि ऊर्जा homeostasis, apoptotic संकेतन, और कई अन्य को विनियमित करने के जवाब में बाहरी mitochondrial झिल्ली (OMM) की सतह के लिए भर्ती किया गया है अभिन्न mitochondrial प्रक्रियाओं। 8 - इस बड़े, साइटोसोलिक GTPase अभिन्न OMM प्रोटीन 4 के साथ बातचीत के माध्यम से माइटोकॉन्ड्रिया की सतह के लिए भर्ती किया गया है। एक ऐसे प्रोटीन की भूमिका, mitochondrial विखंडन फैक्टर (एमएफएफ), इन विट्रो में Drp1 के साथ एक स्पष्ट कमजोर बातचीत के कारण स्पष्ट करने के लिए मुश्किल हो गया है। फिर भी, आनुवंशिक अध्ययन स्पष्ट रूप से दिखा दिया है कि एमएफएफ सफल mitochondrial विखंडन 7.8 के लिए आवश्यक है। विधि इस पांडुलिपि में वर्णित एक साथ लिपिड कि बातचीत Drp1-एमएफएफ बातचीत को बढ़ावा देने शुरू करने से पिछले कमियों को दूर करने में सक्षम था। कुल मिलाकर, इस उपन्यास परख reveaमौलिक बातचीत mitochondrial विखंडन परिसर के विधानसभा मार्गदर्शक का नेतृत्व किया और यह आवश्यक आणविक मशीन के चल रहे संरचनात्मक और कार्यात्मक अध्ययन के लिए एक नया मंच प्रदान की है।

तिथि करने के लिए, Drp1 और एमएफएफ के बीच बातचीत की परीक्षा एमएफएफ 9 के निहित लचीलापन से जटिल कर दिया है, Drp1 की विविधता 2,10 पॉलिमर, और सफ़ाई में और एक अक्षुण्ण transmembrane डोमेन 11 के साथ पूर्ण लंबाई एमएफएफ पुनर्गठन कठिनाई। हम NTA (नी 2 +) पाड़ liposomes का उपयोग कर अपनी transmembrane डोमेन (MffΔTM-अपने 6) की कमी उनकी टैग एमएफएफ पुनर्गठित करने से इन चुनौतियों को संबोधित किया। इस रणनीति लाभप्रद था क्योंकि MffΔTM अत्यंत घुलनशील था जब ई में अधिक व्यक्त। कोलाई, और इस पृथक प्रोटीन आसानी से पाड़ liposomes पर पुनर्गठन किया गया था। जब इन लिपिड टेम्पलेट्स के लिए सीमित, एमएफएफ झिल्ली की सतह पर एक समान, जावक का सामना करना पड़ उन्मुखीकरण ग्रहण किया।इन फायदों, इस तरह के रूप में cardiolipin mitochondrial लिपिड, के अलावा, झिल्ली 11 के साथ MFF तह और संघ को स्थिर करने के लिए जोड़ा गया था। Cardiolipin भी Drp1 2,12 के चर डोमेन जो इस अव्यवस्थित क्षेत्र को स्थिर करने और विखंडन मशीनरी के विधानसभा सुविधा हो सकती है के साथ सूचना का आदान प्रदान।

यह मजबूत विधि भविष्य के अध्ययनों कि झिल्ली समीपस्थ प्रोटीन बातचीत का मूल्यांकन करने के लिए की तलाश के लिए व्यापक रूप से लागू है। अतिरिक्त टेदरिंग / आत्मीयता के बातचीत के उपयोग के माध्यम से, इन झिल्ली पुनर्गठन के अध्ययन का परिष्कार कोशिकाओं के भीतर की झिल्ली की सतह पर पाया अतिरिक्त जटिलता नकल करने के लिए बढ़ाया जा सकता है। इसी समय, लिपिड रचनाओं अधिक सही इन macromolecular परिसर के देशी वातावरण नकल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है। सारांश में, इस विधि रिश्तेदार महत्वपूर्ण सेलुलर proc के दौरान झिल्ली morphologies को आकार देने में प्रोटीन का योगदान और लिपिड जांच करने के लिए एक साधन प्रदान करता हैesses।

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Protocol

1. पाड़ Liposome तैयारी

नोट: आदर्श रूप में, प्रारंभिक प्रयोगों एक अपेक्षाकृत सरल और कुरूप पाड़ (DOPC (1,2-dioleoyl- एस.एन. -glycero-3-phosphocholine या पीसी) और महानिदेशकों-NTA (नी 2 +) (1,2-dioleoyl के शामिल का उपयोग करना चाहिए - एस.एन. -glycero-3 - [(एन - (5 अमीनो-1-carboxypentyl) iminodiacetic एसिड) succinyl]। (निकल नमक)) बिल्डिंग इन प्रयोगों से दूर, लिपिड प्रभारी, लचीलापन, और वक्रता व्यक्तिगत कारकों के रूप में पेश किया जा सकता क्षमता के साथ झिल्ली समीपस्थ बातचीत को बदलने के लिए। इन परिवर्तनों phosphatidylserine या cardiolipin (सीएल), phosphatidylethanolamine (डोप या पीई), या galactosyl (β) Ceramide सहित विशिष्ट लिपिड घटक, की मात्रा में परिभाषित जोड़कर हासिल की जा सकती है।

  1. एक साफ ग्लास टेस्ट ट्यूब में क्लोरोफॉर्म में भंग लिपिड का मिश्रण। सूखी नाइट्रोजन गैस के साथ विलायक लुप्त हो जाना ट्यूब घूर्णन जबकि एक पतली लिपिड फिल्म बनाने के लिए। एक centrifuga साथ अवशिष्ट विलायक हटाये37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए एल बाष्पीकरण।
    नोट: विभिन्न योगों liposome प्रोटोकॉल में इस्तेमाल कर रहे हैं नीचे वर्णित: पाड़ liposomes (3.3% मोल डीजीएस-NTA (नी 2 +) / 96.7% मोल DOPC), cardiolipin साथ पाड़ liposomes (3.3% मोल डीजीएस-NTA (नी 2 +) / 10 मोल% cardiolipin / 86.7% मोल DOPC), cardiolipin के साथ लचीला पाड़ liposomes (3.3% मोल डीजीएस-NTA (नी 2 +) / 10 मोल% cardiolipin / 35 मोल% डोप / 51.7% मोल DOPC), और समृद्ध पाड़ liposomes (10% मोल डीजीएस-NTA (नी 2 +) / 15 मोल% cardiolipin / 35 मोल% डोप / 40 मोल% DOPC)।
  2. बफर (25 मिमी HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड), 150 मिमी KCl, पीएच KOH के साथ 7.5 करने के लिए समायोजित) 37 डिग्री सेल्सियस के लिए छोड़ देते जोड़े ऐसी है कि अंतिम लिपिड एकाग्रता 1 - 2 मिमी। कभी-कभी vortexing के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट सेते पूरी तरह से लिपिड मिश्रण (चित्रा 1 ए) resuspend।
  3. जब तक पूरी तरह से जमे हुए (roug तरल नाइट्रोजन में एक प्लास्टिक टेस्ट ट्यूब पर स्थानांतरण, ट्यूब जगहhly 30 एस), और पूरी तरह से thawed (लगभग 1 जब तक एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में जगह - 2 मिनट)। 4 फ्रीज पिघलना चक्र (चित्रा 1 बी) के एक कुल के लिए दोहराएँ।
  4. 4 फिल्टर समर्थन करता है और बफर में एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर भिगोने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार बाहर निकालना कोडांतरण द्वारा एक लिपिड बाहर निकालना तैयार करें। फिल्टर के माध्यम से लिपिड समाधान बाहर निकालना 21 बार। एक समरूप आकार के वितरण (चित्रा -1 सी) सुनिश्चित करने के लिए कोमल, लगातार दबाव का प्रयोग करें।
    नोट: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों के लिए, एक 1.0 माइक्रोन फिल्टर पॉली कार्बोनेट बाहर निकालना के लिए इस्तेमाल किया गया था। ऋणात्मक लिपिड के साथ बातचीत Drp1 liposome 50 एनएम से 400 एनएम 12 या बड़ा 13 लेकर व्यास की एक किस्म के साथ मनाया जा सकता है। इसलिए, 1 माइक्रोन फिल्टर आकार दोनों GTPase गतिविधि के लिए और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए आदर्श होने के लिए चुना गया था। अन्य liposome व्यास वांछित हैं, विशाल unilamellar पुटिकाओं 14,15 (GUVs) या छोटे unilamell की तैयारीएआर vesicles 16 (एसयूवी) का इस्तेमाल किया जा सकता है। गतिशील प्रकाश बिखरने liposome आकार विविधता 13 का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर extruded liposomes स्टोर और बाद 3 त्यागने - 5 डी।

प्रोटीन बाध्यकारी विश्लेषण के लिए पाड़ liposomes की 2. का प्रयोग करें

  1. नमूना तैयार करना
    1. उनकी टैग सेते MffΔTM (5 माइक्रोन के अंतिम) पाड़ liposomes (40% मोल पीसी / 35 मोल% पीई / 15 मोल% सीएल / 10 मोल% डीजीएस-NTA (नी 2 +), 50 माइक्रोन के अंतिम) के साथ कम से कम 15 मिनट के लिए बफर ए + बीएमई में आरटी पर (25 मिमी HEPES, 150 मिमी KCl, 10 मिमी β-mercaptoethanol (बीएमई), पीएच 7.5 KOH के साथ समायोजित)। एक एमएफएफ से मुक्त नियंत्रण के लिए, एक उनकी टैग नियंत्रण प्रोटीन (जैसे GFP के रूप में) के लिए बाध्य करने के लिए और ढाल उजागर NTA (नी 2 +) के साथ liposomes सेते हैं।
      नोट: MffΔTM व्यक्त की और शुद्ध किया गया था पिछले एक अध्ययन 2 में वर्णित है। GFP एक समान तरीके से शुद्ध किया गया था, लेकिन आयन एक्सचेंज कदम छोड़ा गया था। बीएमई इन experimen के लिए आवश्यक थाटीएस क्योंकि Drp1 ऑक्सीकरण है, जो अपनी गतिविधि और विधानसभा गुणों को बदल सकते हैं के प्रति संवेदनशील है।
    2. Drp1 (2 माइक्रोन अंतिम) जोड़ें और आरटी पर 1 घंटे के लिए सेते हैं।
      नोट: Drp1 व्यक्त की और शुद्ध किया गया था पिछले एक अध्ययन 2 में वर्णित है। Drp1 साथ ऊष्मायन के बाद, न्यूक्लियोटाइड झिल्ली विरूपण पर बाध्यकारी का असर 2 के साथ एक अतिरिक्त घंटे incubating मिमी 2 MgCl और या तो 1 मिमी जीटीपी, 1 मिमी जीएमपी पीसीपी, या बफर ए + बीएमई द्वारा जांच की जा सकती है।
  2. नकारात्मक दाग संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (ईएम) विश्लेषण
    1. स्थानांतरण प्रयोगशाला फिल्म के एक पत्रक के लिए नमूने के 5 μL, और नमूना पर एक कार्बन-लेपित घन / आरएच ग्रिड लेट गई। , नमूना पर ग्रिड 1 मिनट सेते फिल्टर पेपर पर अतिरिक्त तरल दूर दाग, और 2% uranyl एसीटेट की एक बूंद के लिए स्थानांतरण। 1 मिनट सेते हैं, फिल्टर पेपर पर अतिरिक्त दाग धब्बा है, और एक ग्रिड बॉक्स के लिए स्थानांतरण। वैक्यूम हे / एन के तहत स्टोर पूर्ण सुखाना सुनिश्चित करने के लिए।
    2. छवि एक संचरण इलेक्ट्रॉन microsc का उपयोग कर नमूने18,500 पर ope - 30,000X बढ़ाई प्रोटीन और liposome morphologies 17 में ultrastructural परिवर्तन का पालन करने के लिए।
      नोट: Ultrastructural परिवर्तन जैसे ImageJ के रूप में 13, छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग मात्रा निर्धारित किया जा सकता है (http://imagej.nih.gov/ij/)। प्रोटीन सजावट जब नग्न लिपिड टेम्पलेट्स के साथ तुलना में मापा जा सकता है। इसके अतिरिक्त, ट्यूबलर खंडों के व्यास विधानसभाओं 13 की सबसे बाहरी हिस्से से मापा जा सकता है। एक अधिक विस्तृत विश्लेषण क्रायो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी 17 का उपयोग किया जा सकता है। इस विधि को भारी धातु दाग ​​है कि कोट नमूना के उपयोग के बिना विलायक में छवि मूल निवासी प्रोटीन लिपिड विधानसभाओं के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस रास्ते में, अंतर्निहित लिपिड आकृति विज्ञान में परिवर्तन सहित नकारात्मक दाग, में स्पष्ट नहीं विस्तृत ढांचागत सुविधाओं, की जांच की और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

3. एंजाइमी परख के लिए पाड़ Liposomes का प्रयोग

नोट: एक Coloriमीट्रिक GTPase परख 18 जीटीपी हाइड्रोलिसिस के माध्यम से फॉस्फेट मुक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था। वैकल्पिक GTPase assays उपलब्ध 19 कर रहे हैं और जरूरत के रूप में लागू किया जा सकता है।

  1. उनकी टैग MffΔTM (एमएफएफ), Fis1ΔTM (Fis1), या GFP बफर ए + बीएमई (मात्रा = 30 μL) में आरटी पर 15 मिनट के लिए पाड़ liposomes (150 माइक्रोन के अंतिम) के साथ (5 माइक्रोन के सभी के लिए अंतिम) सेते हैं। Drp1 (500 एनएम अंतिम) जोड़ें और आरटी (मात्रा = 80 μL) पर एक अतिरिक्त 15 मिनट सेते हैं।
    नोट: Fis1 एमएफएफ 2 के लिए एक समान तरीके से शुद्ध किया गया था, लेकिन आयन एक्सचेंज क्रोमैटोग्राफी कदम छोड़ा गया था। उनकी टैग GFP के उद्देश्य NTA (नी 2 +) headgroups ढाल और अन्य प्रोटीन के साथ अविशिष्ट प्रभारी बातचीत रोकने के लिए है। कोई प्रभाव नहीं GFP के अभाव में मनाया जाता है, तो इस पर नियंत्रण के लिए आवश्यक नहीं किया जा सकता है। वैकल्पिक अवरुद्ध प्रोटीन (ब्याज की प्रोटीन के लिए तुलनीय आकार के) के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन GFP scaf के साथ बातचीत के प्रत्यक्ष दृश्य के लिए अनुमति देता हैliposomes गुना।
  2. एक thermocycler के लिए स्थानांतरण नलियों 37 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट, और जीटीपी और 2 MgCl के अलावा द्वारा प्रतिक्रियाओं आरंभ (1 मिमी और 2 मिमी अंतिम क्रमश:; मात्रा = 120 μL)।
  3. वांछित समय अंक (यानी टी = 5, 10, 20, 40, 60 मिनट) पर, 2 + मिलीग्राम chelate और प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 0.5 एम EDTA के 5 μL युक्त एक microtiter प्लेट के कुओं के लिए प्रतिक्रिया के 20 μL हस्तांतरण।
  4. बफर ए + बीएमई में के.एच. 2 4 पीओ गिराए परिणाम जांचना के द्वारा फॉस्फेट मानकों का एक सेट तैयार करें। मानकों का एक उपयोगी सेट 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, और 0 माइक्रोन है। प्रत्येक के 20 μL 0.5 एम EDTA के 5 μL युक्त कुओं में जोड़े।
  5. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 150 मैलाकाइट का μL हरी अभिकर्मक (1 मिमी मैलाकाइट हरी Carbinol, 10 मिमी अमोनियम molybdate tetrahydrate, और 1 एन एचसीएल) जोड़ें, और आयुध डिपो को पढ़ने के अलावा के बाद 650 5 मिनट।
    नोट: जीटीपी एसिड अस्थिर है, और मैलाकाइट हरी अभिकर्मक की उपस्थिति में hydrolyze होगा। कि टी सुनिश्चितवह मैलाकाइट अभिकर्मक जोड़ने और पढ़ने के बीच समय प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम सुनिश्चित करने के लिए स्थिर है।
  6. फॉस्फेट एकाग्रता के एक समारोह के रूप में मानकों के आयुध डिपो के 650 साजिश रचने के द्वारा एक मानक वक्र उत्पन्न करता है। एक नमूने में आयुध डिपो 650 और फॉस्फेट एकाग्रता के बीच संबंधों को निर्धारित करने के लिए रेखीय प्रतिगमन का प्रयोग करें।
  7. रेखीय प्रतिगमन का प्रयोग, सुक्ष्ममापी फॉस्फेट के लिए प्रोटीन प्रतिक्रिया नमूने के आयुध डिपो के 650 में परिवर्तित। समय के एक समारोह के रूप में फॉस्फेट एकाग्रता साजिश रचने के द्वारा प्रत्येक प्रतिक्रिया मिश्रण के लिए फॉस्फेट पीढ़ी की दर निर्धारित है, और Drp1 एकाग्रता (0.5 माइक्रोन) के द्वारा दर विभाजित करके बिल्ली कश्मीर के लिए परिवर्तित।
    नोट: केवल प्रारंभिक रेखीय दर फॉस्फेट पीढ़ी की दर निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, और 3 डेटा बिंदुओं की एक न्यूनतम इस्तेमाल किया जाना चाहिए। तो प्रतिक्रिया की दर पहले तीन डेटा बिंदुओं रेखीय नहीं हैं कि पर्याप्त रूप से तेजी से होता है एक संकेत है (यानी आर 2 रेखीय फिट के कम से कम 0.9 है)कम से कम 3 बार के अंक के साथ ificantly कम समय पाठ्यक्रम प्रदर्शन किया जाना चाहिए।

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Representative Results

Drp1 और एमएफएफ के बीच बातचीत mitochondrial विखंडन के लिए महत्वपूर्ण होने के लिए प्रदर्शन किया गया है, वहीं इस बातचीत मुश्किल हो गया है इन विट्रो में पुनरावृत्ति करना। हमारा लक्ष्य बेहतर सेलुलर पर्यावरण जिसमें Drp1 और एमएफएफ बातचीत का अनुकरण करने के लिए किया गया था। यह अंत करने के लिए, liposomes NTA (नी 2 +) headgroups के सीमित सांद्रता वाले के रूप में ऊपर वर्णित एक लिपिड फिल्म rehydrating द्वारा तैयार किए गए थे। के रूप में समाधान (चित्रा 1 ए) की अस्पष्टता इसका सबूत लिपिड समाधान शुरू में विषम व्यास की unilamellar और multilamellar पुटिकाओं के होते हैं। इस अस्पष्टता फ्रीज विगलन (चित्रा 1 बी), जो multilamellar पुटिकाओं के प्रसार को कम कर देता से कम है। Liposome व्यास आगे एक पॉली कार्बोनेट फिल्टर है, जो एक स्पष्ट समाधान (चित्रा -1 सी) में परिणामों के माध्यम से बाहर निकालना द्वारा homogenized रहे हैं।

2 कार्यरत थे झिल्ली tubulation मनाया गया। इन निष्कर्षों पर बिल्डिंग, हम एक polymeric Drp1-एमएफएफ का आदेश दिया विधानसभा झिल्ली विरूपण उत्प्रेरण के जटिल सक्षम बढ़ावा देने के लिए पीसी, पीई, नी, और सीएल (बुलाया समृद्ध पाड़ Liposomes या ईएसएल) से बना एक नया टेम्पलेट का उपयोग किया। विशेष रूप से, NTA (नी 2 +) में वृद्धि हुई और cardiolipin लिपिड (क्रमश: 10 मोल% और 15 मोल%) उपयोग किया गया इस आवेदन के लिए। फिर, GFP या एमएफएफ उपस्थिति और Drp1 (चित्रा 2) के अभाव में ईएसएल टेम्पलेट्स के लिए सीमित किया गया था, और झिल्ली फिर से तैयार करने की क्षमता Drp1 गुणात्मक मूल्यांकन किया गया था। Drp1 के अभाव में, न है और न ही एमएफएफ GFP झिल्ली विरूपण के परिणामस्वरूप (चित्रा 3 ए, बी), और इसी तरह GFP-सजाया ईएसएल के मामले में, केवल कुरूप liposomes मनाया गया (चित्रा 3 सी)। हालांकि, जब डीRP1 एमएफएफ सजाया ईएसएल टेम्पलेट्स के लिए जोड़ा गया है, liposomes के पुनर्गठन स्पष्ट (चित्रा 3 डी) था।

जबकि macromolecular जटिल गठन स्पष्ट रूप से Drp1 और एमएफएफ के बीच एक संवाद को दर्शाता है, यह गुणात्मक विश्लेषण अकेले इस तरह के एक बातचीत के कार्यात्मक प्रभाव का निर्धारण करने के काबिल नहीं है। इसलिए, हम एक मैलाकाइट हरी फॉस्फेट पीढ़ी परख 18 एमएफएफ के साथ बातचीत करने के लिए जवाब में Drp1 का उत्प्रेरक गतिविधि में परिवर्तन का आकलन करने के लिए उपयोग किया। जैसा कि पहले 2 में वर्णित है, हम शुरू में एक सरल पाड़ liposome (एसएल; 3.3% मोल डीजीएस-NTA (नी 2 +), 96.7% मोल DOPC) का उपयोग किया Drp1 संरचना और समारोह पर अकेले एमएफएफ के प्रभाव की जांच करने के लिए। साथ Drp1 की अविशिष्ट बातचीत NTA (नी 2 +) पहले से वर्णित किया गया है 20, इसलिए SL शुरू में NTA (नी 2 +) की कम मात्रा को नियंत्रित करने के डॉ अविशिष्ट गतिविधि उत्तेजना से बचने के लिए डिजाइन किया गया थाP1। ईएसएल में NTA (नी 2 +) की बड़ी मात्रा के साथ, एक नियंत्रण के रूप में उनकी टैग GFP के उपयोग नी 2 + ढाल और गैर विशिष्ट Drp1 बातचीत को रोकने के लिए महत्वपूर्ण हो पाया था। एमएफएफ या GFP (चित्रा 2 में सचित्र) द्वारा SL liposomes की सजावट के बाद, आत्म विधानसभा की हद Drp1 की GTPase गतिविधि को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। liposomes के अभाव में, Drp1 एक अपेक्षाकृत कम बेसल GTPase गतिविधि है, जो थोड़ा SL के अलावा द्वारा बढ़ाया जाता है। एमएफएफ के साथ इन पाड़ liposomes की सजावट GTPase गतिविधि बढ़ाया (चित्रा -4 ए, 1.8 गुना)। इसके विपरीत, जब उजागर NTA (नी 2 +) headgroups उनकी टैग GFP के साथ अवरुद्ध किया गया, इस संवर्धित GTPase गतिविधि ablated गया था। हम यह भी है, हालांकि इस हाल के अध्ययनों से 7,23 में चुनौती दी गई है Fis1, एक OMM प्रोटीन है कि mitochondrial विखंडन 21,22 में एक भूमिका है सुझाव दिया गया है की भूमिका का परीक्षण किया। Fis1 की Tethering अपनी transmembrane डोमेन कमीSL करने के लिए भी Drp1 के GTPase गतिविधि (चित्रा 4 ए) के एक उत्तेजना प्रकाश में लाना करने में विफल रहा।

Drp1 और एमएफएफ की बातचीत में इस mitochondrial लिपिड की भूमिका निर्धारित करने के लिए: हम तो एक से थोड़ा अधिक जटिल लिपिड cardiolipin की एक छोटी राशि (10% मोल cardiolipin DOPC की जगह के साथ SL SL / सीएल) युक्त पाड़ का उपयोग किया। Cardiolipin के इस मध्यम एकाग्रता विशेष रूप में पहले 10 में वर्णित cardiolipin द्वारा Drp1 की उत्तेजना की सीमा के लिए चुना गया था। SL करने के लिए भी इसी तरह, SL / सीएल Drp1 के अलावा GTPase गतिविधि की एक छोटी सी उत्तेजना है कि liposomes को उनकी टैग Fis1 या GFP tethering से उलट था में हुई। एमएफएफ और cardiolipin के बीच एक तालमेल के रूप में मनाया गया Drp1 की GTPase गतिविधि 2.6 गुना प्रेरित किया गया था जब यह एमएफएफ सजाया SL / सीएल (चित्रा 4 बी) के साथ incubated था।

झिल्ली तरलता और क्षमता ओएफ Drp1 फिर से तैयार करने के लिए लिपिड bilayers अपनी GTPase गतिविधि बढ़ाने के लिए प्रस्तावित किया गया है। इसलिए, हम एक लचीला पाड़ liposome का उपयोग कर झिल्ली तरलता / लचीलेपन के प्रभाव की जांच करने की मांग की। इस DOPC का 35% मोल SL में डोप साथ / सीएल जगह द्वारा प्राप्त किया गया था (एसएल / पीई / सीएल) है, जो पहले Drp1 की मध्यस्थता झिल्ली remodeling 10 के लिए अनुमति देने के लिए दिखाया गया है। Drp1 को असज्जित SL / पीई / सीएल पाड़ liposomes के अलावा थोड़ा Drp1 GTPase गतिविधि को बढ़ाता है, और GFP के साथ इन liposomes की सजावट इस आशय समाप्त। SL / पीई / सीएल टेम्पलेट्स एमएफएफ के साथ सजाया गया है, Drp1 गतिविधि बढ़ाया गया था (चित्रा 4C, 2.4 गुना)। हम पहले से पता चला है के रूप में, लिपिड नलिकाओं में liposomes फिर से तैयार करने की क्षमता Drp1 पाड़ liposomes के लिए पीई के अलावा द्वारा बढ़ाया गया था। दिलचस्प है, यह सुधार tubulation एक चक्करदार Drp1 बहुलक के गठन के लिए अग्रणी जब liposomes कि Drp1 फिर से तैयार करने में असमर्थ था की तुलना में किसी भी अधिक से अधिक उत्तेजना में परिणाम नहीं था

इन अनुकूलनीय लिपिड टेम्पलेट्स का उपयोग करना, एमएफएफ और Drp1 इन विट्रो में एक अधिक देशी वातावरण में बातचीत करने के लिए पाए गए। इस तकनीक Drp1, एमएफएफ (NTA के माध्यम से (नी 2 +) एकाग्रता), और विशिष्ट लिपिड (cardiolipin और पीई विशेष रूप से) यह है कि इस macromolecular परिसर के विधानसभा को विनियमित करने के लिए दिखाई के रिश्तेदार बहुतायत को नियंत्रित करने के लिए हमें सक्षम है। हम दिखा दिया है के रूप में, इस विधि इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी द्वारा एमएफएफ-भर्ती Drp1 की झिल्ली remodeling कल्पना करने के लिए, और GTPase गतिविधि परख का उपयोग कर अपने उत्प्रेरक गतिविधि पर Drp1 विधानसभा के प्रभाव का निर्धारण करने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: लिपिड तैयारी योजनाबद्ध। (क) मेजबान पर, विविध आकार के liposomes फार्म और unilamellar और multilamel से मिलकर बनता हैLAR पुटिकाओं, जो एक अपारदर्शी समाधान (इनसेट) में यह परिणाम है। (ख) फ्रीज विगलन liposomes, जो अभी भी व्यास में विषम हैं की एक अधिक unilamellar आबादी में समाधान का परिणाम है। फ्रीज विगलन समाधान (इनसेट) स्पष्ट किया। (ग) लिपिड समाधान के बाहर निकालना liposome व्यास (इस उदाहरण में 1.0 माइक्रोन) homogenizes, और एक स्पष्ट समाधान (इनसेट) में परिणाम है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: तरीके प्रोटीन विधानसभा का आकलन करें। पाड़ liposomes पर एक योजनाबद्ध चित्रण साथी प्रोटीन विधानसभा में प्रस्तुत किया है। उनकी टैग साथी प्रोटीन GFP पाड़ liposomes साथ incubated हैं, और फिर Drp1 सजाया या असज्जित लाइपो साथ incubated है somes। ये Drp1-preassembled liposomes तो संरचनात्मक तरीकों (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) और कार्यात्मक assays (GTPase परख) द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: Drp1 भर्ती के स्ट्रक्चरल आकलन। GFP या एमएफएफ की नकारात्मक दाग संचरण micrographs (ए, बी क्रमशः) अकेले liposomes सजाया या Drp1 साथ incubated (सी, डी, क्रमशः)। स्केल बार = 100 एनएम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 4: पाड़ Liposome एंजाइमी परख। (ए - सी) समय के साथ फॉस्फेट की पीढ़ी मापा गया था (इनसेट), और कश्मीर बिल्ली निर्धारित किया गया था। इस विधि SL सीमित प्रोटीन (ए), SL / सीएल सीमित प्रोटीन (बी), या SL / पीई / सीएल सीमित प्रोटीन (सी) के लिए आवेदन किया था। #: पी <0.05, *: पी <0.0001, **: p <0.000001 के रूप में unpaired छात्र की टी परीक्षण द्वारा निर्धारित की। सभी त्रुटि सलाखों 3 स्वतंत्र नमूनों से मानक विचलन प्रतिनिधित्व करते हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल प्रोटीन, प्रोटीन अभिन्न झिल्ली प्रोटीन को शामिल बातचीत की जांच के लिए एक तरीका प्रदान करता है। एक मॉड्यूलर liposome पाड़ उपयोग करके, जांचकर्ताओं को एक लिपिड समीपस्थ वातावरण में एक या एक से अधिक प्रोटीन की गतिविधि का आकलन करने में सक्षम हैं। 26 - पिछले अध्ययनों प्लाज्मा झिल्ली 24 के रिसेप्टर एंजाइमों के लिए एक समान विधि का प्रदर्शन किया है। हम इस पद्धति लिपिड सहकारकों को शामिल करने और प्रोटीन है कि mitochondrial विखंडन मशीनरी के mechanoenzymatic कोर को बनाने के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए विस्तार किया है।

ऊपर प्रस्तुत मॉडल प्रणाली के लिए, हमने पाया है कि एमएफएफ सजाया SL बढ़ाया Drp1 आत्म विधानसभा। इसके अलावा, अब हम बताते हैं कि, एमएफएफ सजाया ईएसएल टेम्पलेट्स कुशलता से जंगली प्रकार Drp1 द्वारा remodeled थे बढ़ाया ट्यूबलर संरचना के रूप में। हम यह भी नकारात्मक आरोप लगाया cardiolipin और शंक्वाकार लिपिड पीई सहित विभिन्न mitochondrial लिपिड की भूमिका, आकलन किया।Cardiolipin, एमएफएफ साथ synergizes आगे Drp1 विधानसभा स्वयं को बढ़ाने के लिए है, जबकि झिल्ली लचीलापन और तरलता पीई द्वारा दिया झिल्ली tubulation को बढ़ाता है लेकिन आगे एमएफएफ प्रेरित उत्तेजना बढ़ाने नहीं है।

झिल्ली morphologies में ultrastructural परिवर्तन का आकलन करने के लिए, ईएम आवश्यक थे विश्लेषण करती है। Drp1 GTPase गतिविधि क्लस्टरिंग और filamentous पॉलिमर कि किसी भी काफी हद से 2 liposomes नयी आकृति प्रदान नहीं किया था की विधानसभा के माध्यम से उठाया गया था। हालांकि, झिल्ली विरूपण मनाया गया जब अधिक माइटोकॉन्ड्रिया की तरह SL / पीई / सीएल टेम्पलेट का उपयोग किया गया था। दिलचस्प बात यह एंजाइम गतिविधि नहीं बढ़ाया गया था। इसलिए, ईएम पढ़ाई के मुख्य अंतर यह है कि अन्यथा कार्यात्मक परख का उपयोग कर याद किया जाएगा की पहचान करने में आवश्यक थे।

इस तकनीक समारोह और घुलनशील प्रोटीन और घुलनशील प्रोटीन डोमेन की बातचीत की खोज के लिए शक्तिशाली है, वहीं इन लिपिड scaffolds transmembrane डोमेन की भूमिका के लिए खाते में नहीं कर सकतेएस। 30 लिपिड bilayers में - यह एक महत्वपूर्ण विचार है क्योंकि transmembrane डोमेन ऐसे विधानसभा स्वयं 27 और पार्श्व प्रसार 28 के रूप में गतिशील प्रोटीन प्रक्रियाओं लागू कर सकते है। इन कारकों झिल्ली सतह पर प्रोटीन बातचीत के मूल्यांकन के लिए महत्वपूर्ण हैं, तो साबुन के साथ तो पारंपरिक लिपिड पुनर्गठन प्रयोगों इष्ट किया जाएगा। वैकल्पिक tethers भी भर्ती और झिल्ली लंगर प्रोटीन की गतिशीलता को नियंत्रित करने का पता लगाया जा सकता है।

NTA (नी 2 +) लिपिड लंगर, ऐसे बायोटिन संयुग्मित 31 या प्रतिक्रियाशील समूह संयुग्मित लिपिड के रूप में अन्य tethers उपयोग किया जा सकता के साथ उनकी टैग प्रोटीन का उपयोग करने के अलावा। इन संशोधनों के सहसंयोजक अधिक स्थिरतापूर्वक लिपिड सतह पर जाल प्रोटीन, लेकिन गतिशीलता और इन कारकों के आदान-प्रदान की संभावना कम हो जाएगा। जैसे, तार ध्यान से प्रोटीन परिसरों के संदर्भ में विचार किया जाना चाहिए का अध्ययन किया जा रहा है। जब विचार केइस विधि के प्रयोग की अंगूठी, लिपिड टेम्पलेट्स के लिए प्रोटीन tethering की विधा संभावित कुछ assays प्रभावित करने के लिए किया है। उदाहरण के लिए, NTA (नी 2 +) विधि करने के लिए उनकी टैग tethering, जुदाई प्रयोगों सीटू assays के बजाय लिए अधिक उपयुक्त हो सकता है, खासकर क्षणिक प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत के मामले में। यह स्पष्ट रूप से बगल में नकारात्मक दाग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और अवसादन परख के बीच विसंगति से चित्रा 3 में प्रदर्शन किया है।

भविष्य में, दो या अलग लक्ष्य headgroups के साथ इन लंगर लिपिड की अधिक का एक संयोजन के लिए एक एकल लिपिड पगहा के लिए प्रतियोगिता के बिना एक पाड़ टेम्पलेट के लिए कई प्रोटीन की भर्ती के लिए अनुमति देने के लिए लागू किया जा सकता है। इसके अलावा, प्रत्येक घटक के रिश्तेदार बहुतायत लिपिड संरचना बदलकर प्रबंधित किया जा सकता है। ऐसे phosphoinositides, cardiolipin, और phosphatidylserine के रूप में अतिरिक्त लिपिड सहकारकों, आसानी से पेश किया जा सकताइन खाकों में कारकों की एक किस्म के अलग प्रभाव का आकलन करने के लिए।

कुल मिलाकर, इन लिपिड scaffolds लिपिड झिल्ली के पास जटिल प्रोटीन बातचीत की जांच के लिए एक उपन्यास मंच प्रतिनिधित्व करते हैं। इन टेम्पलेट्स आसानी से उत्पन्न कर रहे हैं और एंजाइमी assays, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, या प्रतिदीप्ति इमेजिंग सहित विभिन्न अनुप्रयोगों की एक श्रृंखला के लिए दर्जी को सरल कर रहे हैं। इसके अलावा, लिपिड रचना ब्याज की एक organelle या झिल्ली microdomain सदृश बेहतर इन विशिष्ट क्षेत्रों में प्रोटीन समारोह पुनरावृत्ति करने के लिए तैयार किया जा सकता है। इन तकनीकों का प्रयोग, जीव रसायन अपने साथियों और अपने वातावरण के साथ झिल्ली बाध्य और झिल्ली जुड़े प्रोटीन के जटिल संबंधों की जांच कर सकते हैं।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Phosphatidylcholine (DOPC) Avanti Polar Lipids 850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE) Avanti Polar Lipids 850725
DGS-NTA(Ni2+) Avanti Polar Lipids 790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL) Avanti Polar Lipids 840012
Chloroform Acros Organics 268320010
Liposome Extruder Avanti Polar Lipids 610023
Cu/Rh Negative Stain Grids Ted Pella 79712
Microfuge Tube Beckman 357448
GTP Jena Biosciences NU-1012
GMP-PCP Sigma Aldrich M3509
Microtiter Plate strips Thermo Scientific 469949
EDTA Acros Organics 40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye Expedeon ISB1L
HEPES Fisher Scientific BP310
BME Sigma Aldrich M6250
KCl Fisher Scientific P330
KOH Fisher Scientific P250
Magnesium Chloride Acros Organics 223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel Bio Rad 456-1096
4x Laemmli Loading Dye Bio Rad 161-0747
HCL Fisher Scientific A144S
Malachite Green Carbinol Sigma Aldrich 229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate Sigma Aldrich A7302
Laboratory Film Parafilm PM-996
Uranyl Acetate Polysciences 21447
Tecnai T12 100 keV Microscope FEI
Optima MAX Beckman
TLA-55 Rotor Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler Eppendorf
VersaMax Microplate reader Molecular Devices

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References

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जैव रसायन अंक 119 प्रोटीन प्रोटीन बातचीत Dynamin से संबंधित प्रोटीन 1 liposome प्रोटीन लिपिड इंटरेक्शन संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी GTPase
पाड़ Liposomes का उपयोग लिपिड-समीपस्थ प्रोटीन, प्रोटीन बातचीत पुनर्गठित करने<em&gt; इन विट्रो</em
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Clinton, R. W., Mears, J. A. Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro. J. Vis. Exp. (119), e54971, doi:10.3791/54971 (2017).

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