Abstract
Studies van integrale membraaneiwitten in vitro worden vaak gecompliceerd door de aanwezigheid van een hydrofoob transmembraandomein. Verdere complicerende deze studies, heropname van wasmiddel-opgeloste membraaneiwitten in liposomen is een stochastisch proces waarbij eiwitten topologie is onmogelijk om af te dwingen. Dit document biedt een alternatieve methode om deze moeilijke techniek die een liposoom gebaseerde scaffold gebruikt. Eiwit oplosbaarheid verbeterd door deletie van het transmembraandomein, en deze aminozuren zijn vervangen door een tethering groep, zoals een His-tag. Deze tuier interageert met een verankerende groep (Ni2 + gecoördineerd door nitrilotriazijnzuur (NTA (Ni2 +)) voor His-gelabelde eiwitten), waarbij een uniforme eiwit topologie dwingt aan het oppervlak van het liposoom. Een voorbeeld wordt gepresenteerd, waarin de interactie tussen-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) met een integraal membraaneiwit, Mitochondriale Fission Factor (MFK), was investigated met behulp van deze steiger liposoom methode. In dit werk hebben we het vermogen van MFK oplosbare Drp1 efficiënt rekruteren op het oppervlak van liposomen, waarvan de GTPase activiteit gestimuleerd aangetoond. Bovendien Drp1 was in staat om het MFK-versierde lipide-template in de aanwezigheid van specifieke lipiden buisvormig maken. Dit voorbeeld toont de effectiviteit van scaffold liposomen middels structurele en functionele assays en wordt de rol in het reguleren van MFF Drp1 activiteit.
Introduction
Bestuderen membraanproximale eiwit-eiwit interacties is een uitdagende poging door problemen als gevolg indient de natuurlijke omgeving van het integrale membraaneiwitten betrokken 1. Dit komt door de noodzaak detergens oplosbaar en inconsistente oriëntatie van eiwitten in proteoliposomen. Om deze problemen te voorkomen, hebben we een strategie waarbij oplosbare domeinen van integrale membraaneiwitten zijn uitgedrukt His-tag fusie-eiwitten toegepast, en deze oplosbare fragmenten zijn verankerd aan scaffold liposomen via interacties met NTA (Ni2 +) kopgroepen van het lipide oppervlak. Met deze steigers, kunnen lipide-proximale eiwitinteracties worden onderzocht over een traject van lipiden en eiwitten samenstellingen.
Wij hebben effectief pasten deze methode het kritische eiwit-eiwit interacties die assemblage van de mitochondriale complex splitsing regelt onderzoeken en onderzoeken lipide interacties die deze pr modulerenocess 2. Tijdens mitochondriale splitsing, een geconserveerd membraan remodeling eiwit, genaamd-Dynamin gerelateerd eiwit 1 (Drp1) 3 wordt aangetrokken naar het oppervlak van de buitenste mitochondriale membraan (OMM) in reactie op cellulaire signalen die energie homeostase, apoptotische signalering, en verscheidene andere reguleren integraal mitochondriale processen. Deze grote cytosolische GTPase wordt aangetrokken naar het oppervlak van mitochondria door interactie met geïntegreerde OMM eiwitten 4-8. De rol van een dergelijk eiwit, Mitochondriale Splitsing Factor (MFF), moeilijk op te helderen als gevolg van een schijnbare zwakke interactie met Drp1 in vitro. Desondanks hebben genetische studies duidelijk aangetoond dat MFK essentieel voor een succesvolle mitochondriale kernsplijting 7,8. De methode in dit manuscript beschreven was in staat om eerdere tekortkomingen te verhelpen door de invoering van gelijktijdige lipide interacties die Drp1-MFF interacties te promoten. Over het algemeen, deze roman assay REVEAgeleid fundamentele interacties begeleiden van assemblage van het mitochondriale kernsplijting complex en voorzien van een nieuwe fase voor de lopende structurele en functionele studies van deze essentiële moleculaire machine.
Tot op heden zijn onderzocht interacties tussen Drp1 en MFF bemoeilijkt door de inherente flexibiliteit van MFF 9, de heterogeniteit van Drp1 polymeren 2,10, en de moeilijkheid bij het zuiveren en reconstitutie full-length MFF met intact transmembraandomein 11. We gericht deze uitdagingen met behulp van NTA (Ni 2+) steiger liposomen His-tag MFF reconstrueren ontbreekt haar transmembraandomein (MffΔTM-His 6). Deze strategie is voordelig omdat MffΔTM was zeer oplosbaar toen over-uitgedrukt in E. coli, en deze geïsoleerde eiwit was gemakkelijk gereconstitueerd op steiger liposomen. Wanneer deze gebonden lipiden sjablonen, MFF verondersteld een identieke, naar buiten gerichte oriëntatie op het oppervlak van het membraan.Naast deze voordelen, mitochondrial lipiden, zoals cardiolipine, werden toegevoegd aan MFF vouwen en associatie stabiliseren het membraan 11. Cardiolipine ook interactie met het variabele domein van Drp1 2,12 waarvan de ongeordende gebied kan stabiliseren en assemblage van de splitsing machine te vergemakkelijken.
Deze robuuste methode is breed toepasbaar voor toekomstige studies die streven naar het membraan-proximale eiwit interacties te evalueren. Door het gebruik van aanvullende tethering / affiniteit interacties, kan de complexiteit van deze membraan reconstitutie studies worden verbeterd om verder compliceren vinden op het oppervlak van membranen in cellen nabootsen. Tegelijkertijd kunnen lipidesamenstellingen worden gemodificeerd om nauwkeuriger na te bootsen de natuurlijke omgeving van deze macromoleculaire complexen. Kortom, deze werkwijze verschaft een middel om de relatieve bijdragen van eiwitten en lipiden in vormgeving membraan morfologie om tijdens kritieke cellulaire proc onderzochtsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Steiger liposoompreparaat
OPMERKING: Idealiter eerste experimenten een relatief eenvoudige en eentonige steiger (bestaande uit DOPC (1,2-dioleoyl- sn-glycero-3-fosfocholine of PC) en DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl gebruiken - sn-glycero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxypentyl) iminodiazijnzuur) succinyl]. (nikkelzout)) Het is gebaseerd op deze proeven lipide lading, flexibiliteit en kromming kan worden ingebracht als individuele factoren met de mogelijkheid om membraan-proximale interacties veranderen. Deze veranderingen kunnen verwezenlijkt worden met gedefinieerde hoeveelheden van specifieke lipide componenten, zoals fosfatidylserine of cardiolipine (CL), fosfatidylethanolamine (DOPE of PE) of galactosyl (β) ceramide.
- Combineer lipiden opgelost in chloroform in een schone glazen reageerbuis. Damp het oplosmiddel met droog stikstofgas tijdens draaiing van de buis een dunne lipide film te vormen. Resten oplosmiddel met een Centrifugalel verdamper gedurende 1 uur bij 37 ° C.
OPMERKING: Diverse liposoomformuleringen gebruikt in de protocollen hieronder beschreven steiger liposomen (3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +) / 96,7 mol% DOPC), scaffold liposomen met cardiolipine (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipine / 86,7 mol% DOPC), flexibele steiger liposomen met cardiolipine (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2 +) / 10 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), en verrijkte steiger liposomen (10 mol% DGS-NTA (Ni 2 +) / 15 mol% cardiolipine / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC). - Voeg Buffer A (25 mM HEPES (4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazineethaansulfonzuur), 150 mM KCl, pH ingesteld op 7,5 met KOH) voorverwarmd tot 37 ° C zodanig dat de uiteindelijke lipide concentratie 1-2 mM. Incubeer 30 min bij 37 ° C met af en toe wervelen volledig resuspendeer de lipidemengsel (figuur 1a).
- Transfer naar een plastic reageerbuis, plaats de buis in vloeibare stikstof tot het volledig bevroren (rougHLY 30 s), en plaats in een 37 ° C waterbad tot ze volledig ontdooid (ongeveer 1-2 min). Herhalen voor een totaal van 4 vries-dooi cycli (Figuur 1b).
- Bereid een lipide extruder door het weken 4 filterhouders en een polycarbonaat filter in buffer en monteren van de extruder volgens de instructies van de fabrikant. Extrusie van de lipide-oplossing door het filter 21 keer. Gebruik zachte, constante druk om te zorgen voor een homogene grootteverdeling (figuur 1c).
LET OP: Voor alle experimenten beschreven in dit protocol, werd een 1,0 urn polycarbonaat filter gebruikt voor de extrusie. Drp1 wisselwerking met anionogene lipiden kunnen worden waargenomen met verschillende liposoom diameter van 50 nm tot 400 nm 12 of 13 groter. Vandaar dat de filter grootte van 1 urn gekozen ideaal voor zowel GTPase activiteit voor elektronenmicroscopie worden. Als er andere liposoom diameters gewenst zijn, de voorbereiding van reusachtige unilamellaire blaasjes 14,15 (GUVs) of kleine unilamellar 16 blaasjes (SUV's) kunnen worden gebruikt. Dynamische lichtverstrooiing kan worden gebruikt om liposoomgrootte heterogeniteit 13 beoordelen. - Bewaar geëxtrudeerde liposomen bij 4 ° C en gooi deze na 3-5 d.
2. Gebruik van Steiger liposomen voor eiwitbinding Analyse
- monstervoorbereiding
- Incubate His-tag MffΔTM (5 uM finale) met steiger liposomen (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 pm final) gedurende ten minste 15 min bij kamertemperatuur in Buffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-mercaptoethanol (BME), pH ingesteld op 7,5 met KOH). Voor een MFK gratis controle, incubeer liposomen met een his-gelabelde controle-eiwit (zoals GFP) te binden en schild blootgesteld NTA (Ni 2+).
OPMERKING: MffΔTM werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven in een eerdere studie 2. GFP werd gezuiverd op gelijkaardige wijze, maar de ionuitwisseling werd weggelaten. BME nodig was voor deze Experiments omdat Drp1 gevoelig is voor oxidatie, welke de activiteit en assemblage eigenschappen kunnen veranderen. - Voeg Drp1 (2 pM eind) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
OPMERKING: Drp1 werd tot expressie gebracht en gezuiverd zoals beschreven in een eerdere studie 2. Na incubatie met Drp1, kan het effect van nucleotide bindend membraan vervorming onderzocht door incubatie van een extra uur met 2 mM MgCl2 en ofwel 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP of Buffer A + BME.
- Incubate His-tag MffΔTM (5 uM finale) met steiger liposomen (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 pm final) gedurende ten minste 15 min bij kamertemperatuur in Buffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCI, 10 mM β-mercaptoethanol (BME), pH ingesteld op 7,5 met KOH). Voor een MFK gratis controle, incubeer liposomen met een his-gelabelde controle-eiwit (zoals GFP) te binden en schild blootgesteld NTA (Ni 2+).
- Negative Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Analyse
- Overdracht 5 pi van monster tot een vel laboratorium film, en leggen een koolstof beklede Cu / Rh raster op het monster. Incubeer het rooster 1 min op het monster, vlek weg overtollige vloeistof op filtreerpapier, en over te dragen aan een daling van 2% uranylacetaat. Incubeer 1 min, dep overtollige vlek op filterpapier, en over te dragen aan een raster doos. Opslag onder vacuüm O / N volledige uitdroging te waarborgen.
- Afbeelding monsters met behulp van een transmissie elektronen Microscope op 18.500 - 30,000X vergroting ultrastructurele veranderingen in eiwitten en liposoom morfologie 17 in acht nemen.
Opmerking: Ultrastructurele veranderingen kunnen worden gekwantificeerd met behulp van beeldanalyse software zoals ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). Eiwit decoratie kan worden gemeten in vergelijking met naakte lipide templates. Bovendien kunnen de diameters van buisvormige segmenten worden gemeten van het buitenste deel van de samenstellen 13. Een meer gedetailleerde analyse kan worden uitgevoerd met cryo-elektronenmicroscopie 17. Deze methode kan worden gebruikt voor het natieve eiwit-lipide samenstellingen in oplosmiddel zonder het gebruik van zware metalen vlekken die jas het monster. Zo gedetailleerde structurele kenmerken niet zichtbaar in negatieve vlek, met inbegrip van het onderliggende lipide morfologie, kunnen worden onderzocht en gekwantificeerd.
3. Gebruik van Steiger liposomen voor enzymatische test
Opmerking: Een colorimetrische GTPase-test 18 werd gebruikt om fosfaat bevrijding via GTP hydrolyse te meten. Alternatieve GTPase testen beschikbaar 19 en kan worden geïmplementeerd als nodig.
- Incubeer His-tag MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) of GFP (5 uM finale voor alle) schavot liposomen (150 pM uiteindelijke) gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in Buffer A + BME (volume = 30 ul). Voeg Drp1 (500 nM eind) en incubeer nog eens 15 minuten bij kamertemperatuur (volume = 80 ul).
OPMERKING: Fis1 werd gezuiverd op gelijkaardige wijze als MFF 2, maar de ionenuitwisselingschromatografie werd weggelaten. Het doel van de His-gelabeld GFP is om de NTA (Ni 2+) kopgroepen beschermen en te voorkomen dat niet-specifieke lading interacties met andere eiwitten. Als er geen effect wordt waargenomen in de afwezigheid van GFP, dan is dit besturingselement niet vereist. Alternatieve blokkerende eiwitten (of vergelijkbare grootte aan het eiwit van belang) kan eveneens worden gebruikt, maar GFP maakt directe visualisatie van de interacties met scafvoudige liposomen. - Overdrachtsbuizen een thermocycler ingesteld op 37 ° C, en initiëren reacties door toevoeging van GTP en MgCl2 (1 mM en 2 mM finale respectievelijk volume = 120 ul).
- Op gewenste tijdstippen (bijvoorbeeld T = 5, 10, 20, 40, 60 min) en breng 20 pl reactie op putjes van een microtiterplaat met 5 ul van 0,5 M EDTA chelaat Mg2 + en stop de reactie.
- Bereid een reeks van fosfaat normen door verdunning van KH 2 PO 4 in Buffer A + BME om resultaten te kalibreren. Een handige set van normen is 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 en 0 uM. Voeg 20 ul van elk putjes die 5 pl 0,5 M EDTA.
- Voeg 150 ul malachietgroen reagens (1 mM malachietgroen carbinol, 10 mM ammoniummolybdaat tetrahydraat en 1 N HCl) aan elk putje en lees OD 650 5 min na toevoeging.
OPMERKING: GTP zuur labiel en hydrolyseert in aanwezigheid van malachietgroen reagens. Zorg ervoor dat thij de tijd tussen het toevoegen van malachiet reagens en het lezen is constant om ervoor te zorgen reproduceerbare resultaten. - Genereer een standaard kromme door het uitzetten OD 650 van de standaarden als functie van de fosfaatconcentratie. Lineaire regressie om de relatie tussen OD 650 en fosfaatconcentratie in een monster te bepalen.
- Met de lineaire regressie, zet de OD 650 van de proteïne reactie monsters uM fosfaat. Bepaal de snelheid fosfaat genereren voor elk reactiemengsel getrokken waarbij fosfaatconcentratie als functie van de tijd, en zet aan kat k wordt door het percentage van de Drp1 concentratie (0,5 uM).
OPMERKING: alleen de aanvankelijke lineaire snelheid worden gebruikt om het percentage fosfaat productie bepalen, en ten minste 3 gegevenspunten worden gebruikt. Indien de reactiesnelheid voldoende snel dat de eerste drie gegevenspunten zijn lineair (dwz r 2 van de lineaire fit is dan 0,9) een tekenificantly kortere tijdsverloop met minimaal 3 tijdstippen moeten worden uitgevoerd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Terwijl de interactie tussen Drp1 en MFF is aangetoond belangrijk mitochondriale splitsing zijn, heeft deze interactie moeilijk te herhalen in vitro. Ons doel was om beter na te bootsen de cellulaire omgeving waarin Drp1 en MFF interactie. Daartoe liposomen die limietconcentraties van NTA (Ni2 +) kopgroepen werden bereid door hydrateren van een vetfilm zoals hierboven beschreven. De lipideoplossing bestaat aanvankelijk van unilamellaire vesicles en multilamellaire van heterogene diameters zoals blijkt uit de dekking van de oplossing (figuur 1a). Dit opaciteit verminderd vriesdrogen (figuur 1b), waarbij de prevalentie van multilamellaire vesicles vermindert. Liposoom diameters verder gehomogeniseerd door extrusie door een polycarbonaat filter, waardoor een heldere oplossing (figuur 1c).
2. Voortbouwend op deze bevindingen hebben we gebruik gemaakt van een nieuwe template bestaande uit PC, PE, Ni en CL (-verrijkte Steiger Liposomen of ESL) om bestelde samenstel van een polymeer Drp1 MFF-complex kan induceren membraan vervorming promoten. Specifiek verhoogde NTA (Ni2 +) en cardiolipine lipiden werden (respectievelijk 10 mol% en 15 mol%) gebruikt voor deze toepassing. Vervolgens GFP of MFF is vastgebonden aan ESL sjablonen in de aanwezigheid en afwezigheid van Drp1 (figuur 2), en het vermogen van Drp1 aan membranen verbouwen werd kwalitatief geëvalueerd. Aangezien Drp1 noch MFF of GFP geleid membraan vervorming (figuur 3a, b), en eveneens in het geval van GFP ingericht ESL slechts featureless liposomen waargenomen (Figuur 3c). Echter, wanneer Drp1 werd toegevoegd aan MFK versierde ESL templates, herinrichting van de liposomen was duidelijk (figuur 3d).
Terwijl macromoleculaire complexvorming duidelijk aan een interactie tussen Drp1 en MFF deze kwalitatieve analyse alleen is niet in staat de bepaling van de functionele effecten van dergelijke interactie. Daarom hebben we gebruik gemaakt van een malachietgroen fosfaat generatie assay 18 wijzigingen in de katalytische activiteit van Drp1 bepalen als reactie op interactie met MFF. Zoals eerder beschreven 2, we in eerste instantie gebruik gemaakt van een eenvoudige scaffold liposoom (SL; 3,3 mol% DGS-NTA (Ni2 +), 96,7 mol% DOPC) om het effect van MFF onderzoeken alleen op Drp1 structuur en functie. Niet-specifieke interactie van Drp1 met NTA (Ni2 +) is eerder beschreven 20, zodat SL oorspronkelijk ontworpen om lage concentraties NTA (Ni2 +) bevatten om niet-specifieke activiteit stimuleren van Dr voorkomenp1. Met grotere hoeveelheden NTA (Ni2 +) in ESL, het gebruik van His-gelabeld GFP als controle bleek kritisch voor de Ni 2+ beschermen en voorkomen dat niet-specifieke interacties Drp1 zijn. Na inrichting van SL liposomen door MFF of GFP (zie figuur 2), kan de mate van zelf-assemblage kan worden vastgesteld door de GTPase activiteit van Drp1. Aangezien liposomen, Drp1 een relatief lage basale GTPase activiteit, die enigszins verhoogd door de toevoeging van SL. Decoratie van deze steiger liposomen met MFF verhoogde GTPase activiteit (figuur 4a, 1,8 maal). Omgekeerd, wanneer de blootgestelde NTA (Ni2 +) kopgroepen werden geblokkeerd met His gemerkt GFP werd deze verhoogd GTPase activiteit geablateerd. We testten ook de rol van Fis1 een OMM eiwit dat is gesuggereerd een rol mitochondriale splitsing 21,22 hebben, maar dit heeft in recente studies 7,23 betwist. Tethering van Fis1 ontbreekt haar transmembraandomeinSL ook niet tot een stimulering van Drp1's GTPase-activiteit (Figuur 4a) op te wekken.
Vervolgens hebben we gebruik gemaakt van een iets complexer lipide scaffold dat een kleine hoeveelheid cardiolipine (SL / CL: SL met 10 mol% cardiolipine vervangen DOPC) om de rol van deze mitochondriale lipide interactie van Drp1 en MFF bepalen. Deze matige concentratie van cardiolipine is speciaal gekozen om de stimulatie van Drp1 beperken door cardiolipine zoals eerder 10 beschreven. Soortgelijke SL, toevoeging van SL / CL Drp1 resulteerde in een lichte stimulatie van GTPase activiteit die werd omgekeerd aangebonden His-tag Fis1 of GFP aan de liposomen. Een synergie tussen MFK cardiolipine werd waargenomen als de GTPase activiteit van Drp1 gestimuleerd werd 2,6-voudig wanneer het werd geïncubeerd met MFK versierde SL / CL (Figuur 4b).
Membraanvloeibaarheid en het vermogen of Drp1 verbouwen lipidendubbellagen zijn voorgesteld om de GTPase activiteit te verhogen. Daarom zochten we het effect van de membramen / flexibel daarbij flexibel scaffold liposoom onderzoeken. Dit werd bereikt door, 35 mol% DOPC in SL / CL DOPE (SL / PE / CL), waarvan eerder is aangetoond om voor Drp1 gemedieerde membraan remodeling 10. Toevoeging van undecorated SL / PE / CL scaffold liposomen Drp1 enigszins verbetert Drp1 GTPase activiteit, en de decoratie van deze liposomen met GFP elimineert dit effect. Wanneer SL / PE / CL templates waren versierd met MFK werd Drp1 activiteit verhoogd (figuur 4c, 2.4-voudig). Zoals we al eerder aangetoond, werd het vermogen van Drp1 liposomen in lipide tubuli verbouwen verbeterd door toevoeging van PE naar het schavot liposomen. Interessant was deze verbeterde buis leidt tot de vorming van een schroeflijnvormige Drp1 polymeer niet tot een grotere stimulatie vergeleken met liposomen die Drp1 kon verbouwen Met behulp van deze aanpasbare sjablonen lipide, MFK Drp1 werden gevonden om samen te werken in een meer natuurlijke omgeving in vitro. Deze techniek heeft ons in staat om de relatieve overvloed aan Drp1, MFF (via NTA (Ni 2+) concentratie), en specifieke lipiden (cardiolipine en PE in het bijzonder), die verscheen aan de montage van deze macromoleculaire complex regelen beheersen. Zoals wij hebben aangetoond, kan deze methode worden gebruikt om het membraan remodeling van MFF-aangeworven Drp1 visualiseren van elektronenmicroscopie, en de effecten van Drp1 samenstel op zijn katalytische activiteit te bepalen gebruik GTPase activiteit test. 71fig4.jpg "/> 
Figuur 1: Schematische lipidepreparaat. (A) Bij resuspensie liposomen van verschillende groottes vormen en bestaan uit unilamellaire en multilamellar vesicles, waardoor een ondoorzichtige oplossing (inzet). (B) vriesdrogen van de oplossing resulteert in een populatie van unilamellaire liposomen, die nog heterogeen diameter. Freeze-ontdooien verduidelijkt de oplossing (inzet). (C) Extrusie van de lipideoplossing homogeniseert het liposoom diameter (1,0 urn in dit voorbeeld), en resulteert in een heldere oplossing (inzet). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 2: Methoden om Protein assemblage beoordelen. Een schematische afschilderen partner eiwit montage op steiger liposomen wordt gepresenteerd. His-getagde partner eiwitten of GFP worden geïncubeerd met steiger liposomen, en dan Drp1 geïncubeerd met versierde en onversierde lipo Somes. Deze Drp1-voorgemonteerde liposomen kunnen vervolgens worden geanalyseerd door structurele werkwijzen (elektronenmicroscopie) en functionele assays (GTPase-test). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. 
Figuur 3: Structurele Evaluatie van Drp1 Recruitment. Negatieve kleuring transmissie microfoto van GFP of MFF ingericht liposomen alleen (A, B, respectievelijk) of geïncubeerd met Drp1 (C, D, respectievelijk). Schaal bar = 100 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Steiger liposoom enzymatische test. (A - C) Het produceren van fosfaat in de tijd werd gemeten (inzet) en de kcat bepaald. Deze methode werd gebruikt voor SL-gebonden eiwitten (A), SL / CL-gebonden eiwitten (B), of SL / PE / CL-gebonden eiwitten (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 zoals bepaald met ongepaarde t-toets student. Alle fout balken geven de standaarddeviatie van 3 onafhankelijke steekproeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor het onderzoeken van eiwit-eiwit interacties van integrale membraaneiwitten. Met behulp van een liposoom modulaire steiger, onderzoekers zijn geschikt om de activiteit van één of meer eiwitten in een lipide-proximale omgeving. 26 - Eerdere studies hebben een soortgelijke werkwijze voor receptor enzymen van de plasmamembraan 24 aangetoond. We hebben deze methode om lipide co-factoren op te nemen en interacties tussen eiwitten die deel uitmaken van de mechanoenzymatic kern van de mitochondriale kernsplijting machines verkennen uitgebreid.
Voor het modelsysteem hierboven gepresenteerde, vonden we dat MFK versierde SL verbeterde Drp1 zelf te monteren. Bovendien hebben we nu laten zien dat, MFK versierde ESL templates efficiënt werden gerenoveerd door wild-type Drp1 om uitgebreide buisvormige structuren te vormen. Wij hebben eveneens de rol van verschillende mitochondriale lipiden, waaronder de negatief geladen cardiolipine en de conische lipide PE.Cardiolipin synergie met MFK verder te verbeteren Drp1 zelfassemblage, terwijl het membraan flexibiliteit en vloeibaarheid bijgebracht door PE verhoogt membraan buis, maar niet verder vergroten MFK geïnduceerde stimulatie.
Om ultrastructurele veranderingen in het membraan morfologie te beoordelen, analyses EM nodig waren. Drp1 GTPase activiteit werd verhoogd door clusters en assemblage van filamenteuze polymeren die de liposomen heeft hervormen nog enigszins 2. Echter, membraangebonden vervorming waargenomen wanneer de meer mitochondriën-achtige SL / PE / CL template gebruikt. Interessant is dat de enzymactiviteit niet verbeterd. Daarom is de EM studies waren essentieel bij het identificeren van belangrijke verschillen die anders zouden worden gemist met de functionele assay.
Hoewel deze techniek is krachtig voor de werking en interactie van oplosbare eiwitten en oplosbare eiwitdomeinen verkennen, kunnen deze lipide scaffolds geen rekening met de rol van transmembraandomeins. Dit is een belangrijke overweging omdat het transmembraandomein eiwit dynamische processen zoals zelfassemblage 27 en laterale diffusie 28 kan bewerkstelligen - 30 in lipide bilagen. Als deze factoren zijn cruciaal voor het evalueren eiwit interacties op het membraanoppervlak, zou dan traditionele lipide reconstitutie experimenten met detergens voorkeur. Alternatieve aanbinden kan ook worden onderzocht om de werving en mobiliteit van het membraan verankerde eiwitten controleren.
Naast het gebruik van His-gemerkte eiwitten met NTA (Ni2 +) lipide ankers, andere tethers zoals biotine geconjugeerd 31 of reactieve groep geconjugeerd lipiden kunnen worden gebruikt. Deze covalente modificaties zouden stabieler val eiwitten op het lipide oppervlak, maar mobiliteit en uitwisseling van deze factoren waarschijnlijk verminderd. Als zodanig moet de ketting zorgvuldig worden overwogen in de context van het eiwit complexen onderzocht. wanneer ontring de toepassing van deze methode, de wijze van tethering eiwitten aan lipide templates hebben het potentieel om bepaalde assays beïnvloeden. Bijvoorbeeld kan de His-tag tethering NTA (Ni 2+) methode geschikter in situ testen plaats scheidingsexperimenten, vooral bij transiënte eiwit-eiwit interacties. Dit wordt duidelijk aangetoond in Figuur 3 door de discrepantie tussen de in situ negatieve kleuring elektronenmicroscopie en sedimentatie assay.
In de toekomst kan een combinatie van twee of meer van deze anker lipiden met verschillende kopgroepen doel worden toegepast om voor rekrutering van meerdere eiwitten aan een steiger sjabloon zonder concurrentie voor een enkele lipide tuier. Bovendien kan de relatieve hoeveelheid van elke component worden beheerd door het veranderen van de lipidesamenstelling. Extra lipide cofactoren, zoals fosfoinositiden, cardiolipine en fosfatidylserine, kan gemakkelijk worden ingebrachtin deze sjablonen aan de geïsoleerde effect van een aantal factoren te beoordelen.
Over het algemeen zijn deze lipide steigers staan voor een nieuw platform voor het onderzoeken van complexe eiwit interacties in de buurt van lipide membranen. Deze sjablonen gemakkelijk geproduceerd en eenvoudig aanpassen om aan een reeks van verschillende toepassingen, waaronder enzymatische assays, elektronenmicroscopie, of fluorescentiebeeldvorming. Bovendien kan de lipide samenstelling worden geformuleerd om een organel of membraan microdomein plaats lijken beter te recapituleren eiwitfunctie in deze specifieke gebieden. Met deze technieken kunnen biochemici de complexe interacties van membraangebonden en membraan-geassocieerde eiwitten probe met hun partners en hun omgeving.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Clinton, R. W., Francy, C. A., Ramachandran, R., Qi, X., Mears, J. A. Dynamin-related Protein 1 Oligomerization in Solution Impairs Functional Interactions with Membrane-anchored Mitochondrial Fission Factor. J Biol Chem. 291 (1), 478-492 (2016).
- Chan, D. C. Mitochondrial Fusion and Fission in Mammals. Annual Review of Cell and Dev Biol. 22 (1), 79-99 (2006).
- Bui, H. T., Shaw, J. M. Dynamin Assembly Strategies and Adaptor Proteins in Mitochondrial Fission. Curr Biol. 23 (19), R891-R899 (2013).
- Elgass, K., Pakay, J., Ryan, M. T., Palmer, C. S. Recent advances into the understanding of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta (BBA) - Mol Cell Res. 1833 (1), 150-161 (2013).
- Losón, O. C., Song, Z., Chen, H., Chan, D. C. Fis1, Mff, MiD49, and MiD51 mediate Drp1 recruitment in mitochondrial fission. Mol Biol Cell. 24 (5), 659-667 (2013).
- Otera, H., Wang, C., et al. Mff is an essential factor for mitochondrial recruitment of Drp1 during mitochondrial fission in mammalian cells. J Cell Biol. 191 (6), 1141-1158 (2010).
- Gandre-Babbe, S., van der Bliek, A. M. The Novel Tail-anchored Membrane Protein Mff Controls Mitochondrial and Peroxisomal Fission in Mammalian Cells. Mol Biol Cell. 19 (6), 2402-2412 (2008).
- Koirala, S., Guo, Q., et al. Interchangeable adaptors regulate mitochondrial dynamin assembly for membrane scission. Proc Natl Acad Sci. 110 (15), E1342-E1351 (2013).
- Macdonald, P. J., Stepanyants, N., et al. A dimeric equilibrium intermediate nucleates Drp1 reassembly on mitochondrial membranes for fission. Mol Biol Cell. 25 (12), 1905-1915 (2014).
- Macdonald, P. J., Francy, C. A., et al. Distinct Splice Variants of Dynamin-related Protein 1 Differentially Utilize Mitochondrial Fission Factor as an Effector of Cooperative GTPase Activity. J Biol Chem. 291 (1), 493-507 (2016).
- Bustillo-Zabalbeitia, I., Montessuit, S., Raemy, E., Basañez, G., Terrones, O., Martinou, J. -C. Specific Interaction with Cardiolipin Triggers Functional Activation of Dynamin-Related Protein 1. PLoS ONE. 9 (7), (2014).
- Francy, C. A., Alvarez, F. J. D., Zhou, L., Ramachandran, R., Mears, J. A. The Mechanoenzymatic Core of Dynamin-Related Protein 1 Comprises the Minimal Machinery Required for Membrane Constriction. J Biol Chem. 290 (18), 11692-11703 (2015).
- Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. Giant Vesicles: Preparations and Applications. ChemBioChem. 11 (7), 848-865 (2010).
- Moscho, A., Orwar, O., Chiu, D. T., Modi, B. P., Zare, R. N. Rapid preparation of giant unilamellar vesicles. Proc Natl Acad Sci. 93 (21), 11443-11447 (1996).
- Klingler, J., Vargas, C., Fiedler, S., Keller, S. Preparation of ready-to-use small unilamellar phospholipid vesicles by ultrasonication with a beaker resonator. Anal Biochem. 477, 10-12 (2015).
- Mears, J. A., Hinshaw, J. E.
- Leonard, M., Doo Song, B., Ramachandran, R., Schmid, S. L. Robust Colorimetric Assays for Dynamin's Basal and Stimulated GTPase Activities. Methods Enzymol. 404, 490-503 (2005).
- Ingerman, E., Perkins, E. M., et al. Dnm1 forms spirals that are structurally tailored to fit mitochondria. J Cell Biol. 170 (7), 1021-1027 (2005).
- Fröhlich, C., Grabiger, S., et al. Structural insights into oligomerization and mitochondrial remodelling of dynamin 1-like protein. EMBO J. 32 (9), 1280-1292 (2013).
- James, D. I., Parone, P. A., Mattenberger, Y., Martinou, J. -C. hFis1, a Novel Component of the Mammalian Mitochondrial Fission Machinery. J Biol Chem. 278 (38), 36373-36379 (2003).
- Yoon, Y., Krueger, E. W., Oswald, B. J., McNiven, M. A. The Mitochondrial Protein hFis1 Regulates Mitochondrial Fission in Mammalian Cells through an Interaction with the Dynamin-Like Protein DLP1. Mol Cell Biol. 23 (15), 5409-5420 (2003).
- Osellame, L. D., Singh, A. P., et al. Cooperative and independent roles of Drp1 adaptors Mff and MiD49/51 in mitochondrial fission. J Cell Sci. 129 (11), 2170-2181 (2016).
- Esposito, E. A., Shrout, A. L., Weis, R. M. Template-Directed Self-Assembly Enhances RTK Catalytic Domain Function. J Biomol Screen. 13 (8), 810-816 (2008).
- Shrout, A. L., Esposito, E. A., Weis, R. M. Template-directed Assembly of Signaling Proteins: A Novel Drug Screening and Research Tool. Chem Biol Drug Des. 71 (3), 278-281 (2008).
- Celia, H., Wilson-Kubalek, E., Milligan, R. A., Teyton, L. Structure and function of a membrane-bound murine MHC class I molecule. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 96 (10), 5634-5639 (1999).
- Li, E., Wimley, W. C., Hristova, K. Transmembrane helix dimerization: Beyond the search for sequence motifs. Biochim Biophys Acta (BBA) - Biomembranes. 1818 (2), 183-193 (2012).
- Zhang, F., Crise, B., Su, B., Hou, Y., Rose, J. K., Bothwell, A., Jacobson, K. Lateral diffusion of membrane-spanning and glycosylphosphatidylinositol- linked proteins: toward establishing rules governing the lateral mobility of membrane proteins. J Cell Biol. 115 (1), 75-84 (1991).
- Ramadurai, S., Holt, A., Krasnikov, V., van den Bogaart, G., Killian, J. A., Poolman, B.
- Gambin, Y., Reffay, M., et al. Variation of the lateral mobility of transmembrane peptides with hydrophobic mismatch. J Phys Chem. B. 114 (10), 3559-3566 (2010).
- Wilson-Kubalek, E. M., Brown, R. E., Celia, H., Milligan, R. A. Lipid nanotubes as substrates for helical crystallization of macromolecules. Proc Natl Acad Sci. 95 (14), 8040-8045 (1998).
