Abstract
Estudos de proteínas de membrana integrais in vitro são frequentemente complicada pela presença de um domínio transmembranar hidrófobo. complicando ainda mais estes estudos, a reincorporação de proteínas de membrana de detergente-solubilizado em lipossomas é um processo estocástico, onde topologia proteína é impossível de aplicar. Este documento apresenta um método alternativo para estas técnicas difíceis que utiliza uma estrutura de suporte à base de lipossomas. a solubilidade da proteína é aumentada pela supressão do domínio transmembranar, e estes aminoácidos são substituídos com um radical amarrar, tal como uma cauda de His. Este tirante interage com um grupo de ancoragem (Ni2 + coordenado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni 2+)) para proteínas marcadas com His), que executa uma topologia uniforme de proteína na superfície do lipossoma. Um exemplo é apresentado, em que a interacção entre a proteína relacionada com um dinamina (Drp1) com uma proteína de membrana integral, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), foi investigated usando este método scaffold lipossoma. Neste trabalho, nós demonstramos a capacidade de recrutar Mff eficientemente Drp1 solúvel à superfície dos lipossomas, o que estimulou a sua actividade de GTPase. Além disso, foi capaz de Drp1 tubulate o modelo lípido Mff-decorado na presença de lípidos específicos. Este exemplo demonstra a eficácia de lipossomas de andaime usando ensaios estruturais e funcionais e destaca o papel do QFP, a regulação da actividade Drp1.
Introduction
Estudando interações proteína-proteína de membrana-proximal é uma tarefa desafiadora devido à dificuldade de recapitular o ambiente nativo das proteínas de membrana integrais envolvidas 1. Isto é devido à necessidade de solubilização detergente e a orientação inconsistente de proteínas em proteolipossomas. A fim de evitar estes problemas, que têm empregue uma estratégia em que os domínios solúveis de proteínas de membrana integrais são expressos como proteínas de fusão His-tag, e estes fragmentos solúveis estão ancoradas aos lipossomas através de interacções de andaime com NTA (Ni 2+) headgroups no lípido superfície. Usando estes andaimes, as interacções proteína-lipídicos proximal pode ser investigada através de uma gama de composições de lípidos e proteínas.
Temos eficazmente aplicado esse método para investigar as interacções proteína-proteína crítica que governam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e examinar interacções lípidos que modulam este processo 2. Durante fissão mitocondrial, uma proteína de remodelação da membrana conservada, chamada proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1) 3, é recrutado para a superfície do mitocondrial externa da membrana (OMM) em resposta a sinais celulares que regulam a homeostase de energia, sinalização apoptótica, e vários outros processos mitocondriais integral. Esta grande GTPase, citosólica é recrutada para a superfície das mitocôndrias através de interacções com proteínas integrais OMM 4 - 8. O papel de uma tal proteína, Cisão do Factor mitocondrial (QFP), tem sido difícil para elucidar devido a uma interacção fraca aparente com Drp1 in vitro. No entanto, estudos genéticos demonstraram claramente que Mff é essencial para o êxito da fissão 7,8 mitocondrial. O método descrito neste manuscrito foi capaz de superar as deficiências anteriores, introduzindo interações lipídicas simultâneas que promovem interações Drp1-QFP. No geral, este romance REVEA ensaiolevou interações fundamentais que orientam a montagem do complexo de fissão mitocondrial e forneceu uma nova etapa para estudos estruturais e funcionais em curso desta máquina molecular essencial.
Até à data, a análise de interacções entre Drp1 e Mff ter sido complicada pela flexibilidade inerente do Mff 9, a heterogeneidade dos polímeros Drp1 2,10, e a dificuldade de purificação e a reconstituição de comprimento completo Mff com um domínio transmembranar de 11 intacta. Nós abordado esses desafios usando lipossomas NTA (Ni 2+) de andaime para reconstituir marcada com His Mff faltando seu domínio transmembranar (MffΔTM-His 6). Esta estratégia foi vantajoso porque MffΔTM foi extremamente solúvel quando sobre-expresso em E. coli, e esta proteína foi isolado facilmente reconstituída em lipossomas de andaime. Quando preso a estes modelos de lípidos, Mff assumido um, voltados para o exterior orientação idêntica na superfície da membrana.Além destas vantagens, lípidos mitocondriais, tais como a cardiolipina, foram adicionados para estabilizar Mff dobragem e de associação com a membrana 11. A cardiolipina também interage com o domínio variável de 2,12 Drp1 que podem estabilizar esta região desordenada e facilitar a montagem da máquina de fissão.
Este método robusto é amplamente aplicável para futuros estudos que visam avaliar as interações proteína de membrana-proximal. Através do uso de interacções amarrar / afinidade adicionais, a sofisticação destes estudos de reconstituição da membrana pode ser aumentada para imitar complexidade adicional encontrado na superfície das membranas dentro das células. Ao mesmo tempo, as composições de lípidos podem ser modificados para mimetizar mais precisamente os ambientes nativas destes complexos macromoleculares. Em resumo, este método proporciona um meio para examinar as contribuições relativas de proteínas e lípidos em moldar a morfologias de membrana durante Proc celulares críticascessos.
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Protocol
1. Andaime lipossomas Preparação
NOTA: Idealmente, as experiências iniciais deve usar um andaime relativamente simples e sem traços característicos (composto de DOPC (1,2-dioleoyl--sn-glicero-3-fosfocolina ou PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoil - sn-glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) ácido iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) edifício fora destas experiências, a carga de lípidos, a flexibilidade, e a curvatura pode ser introduzido como factores individuais com o potencial para alterar as interacções da membrana proximal. Estas alterações podem ser conseguida por adição de quantidades definidas de componentes lípidos específicos, incluindo fosfatidilserina ou cardiolipina (CL), f osf atidiletanolamina (DOPE ou PE), ou galactosil (β) ceramida.
- Combinar lipidos dissolvidos em clorofórmio em um tubo de ensaio de vidro limpo. Evapora-se o solvente com azoto gasoso seco durante a rotação do tubo de modo a formar uma película fina de lípidos. Remover o solvente residual com uma centrifugal evaporador durante 1 h a 37 ° C.
NOTA: As várias formulações lipossomais são usadas nos protocolos descritos abaixo: lipossomas de andaime (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% molar de cardiolipina / 86,7% molar de DOPC), lipossomas de andaime flexíveis com cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / DOPC 51,7 mol%), e de andaime enriquecido lipossomas (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15% molar de cardiolipina / 35% molar de DOPE / 40% molar de DOPC). - Adicionar tampão A (25 mM de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado para 7,5 com KOH) pré-aquecido a 37 ° C, de modo que a concentração final de lípido é de 1 - 2 mm. Incubar 30 min a 37 ° C com agitação em vórtice para ressuspender completamente ocasional da mistura de lípidos (Figura 1a).
- Transferir para um tubo de ensaio de plástico, colocar o tubo em nitrogênio líquido até que esteja completamente congelado (rougHly 30 s), e coloque em uma temperatura de 37 ° C banho de água até estar totalmente descongelado (cerca de 1-2 min). Repetir para um total de 4 ciclos de congelação-descongelação (Figura 1B).
- Prepara-se uma extrusora de lípido por imersão 4 suportes de filtro e um filtro de policarbonato e em tampão de montagem da extrusora de acordo com as instruções do fabricante. Extrudir a solução de lípidos através do filtro 21 vezes. Use pressão suave e constante para assegurar uma distribuição de tamanho homogêneo (Figura 1c).
NOTA: Para todas as experiências descritas neste protocolo, um filtro de 1,0 um policarbonato foi usada para a extrusão. Drp1 interacção com lípidos aniónicos pode ser observada com uma variedade de diâmetros de lipossomas variando desde 50 nm a 400 nm, 12 ou maior 13. Por isso, o tamanho do filtro de 1 ^ M foi escolhida para ser ideal, tanto para a actividade de GTPase e por microscopia electrónica. Se outros diâmetros de lipossomas são desejados, preparação de gigantes vesículas unilamelares 14,15 (GUVs) ou pequena unilamellAR vesículas 16 (SUVs) pode ser usado. Dispersão dinâmica de luz pode ser utilizado para avaliar o tamanho do lipossoma heterogeneidade 13. - Armazenar lipossomas extrudidos a 4 ° C e depois descartá 3-5 d.
2. Uso de andaime lipossomas para Análise de ligação às proteínas
- Preparação de amostra
- Incubar marcada com His MffΔTM (5 uM final), com lipossomas de andaime (40 mol% de PC / 35% molar de PE / mole 15% CL / 10% molar de SGD-NTA (Ni 2+), 50 uM final) durante pelo menos 15 min à TA em Tampão a + BME (25 mM de HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado para 7,5 com KOH). Para um controle Mff-livre, incubar lipossomas com uma marcada com His proteína de controlo (tal como GFP) para ligar e escudo exposta NTA (Ni 2+).
NOTA: MffΔTM foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio 2. GFP foi purificado de uma maneira similar, mas o passo de permuta iónica foi omitido. BME foi necessária para estes experimenTS porque Drp1 é sensível à oxidação, o qual pode alterar as suas propriedades de actividade e de montagem. - Adicionar Drp1 (2 uM final) e incubar durante 1 h a RT.
NOTA: Drp1 foi expressa e purificada como descrito em um estudo prévio 2. Após incubação com Drp1, o efeito de deformação de ligação de membrana de nucleótidos pode ser investigada através da incubação de uma hora adicional com 2 mM de MgCl2 e 1 mM de GTP, quer, 1 mM de GMP-PCP, ou tampão A + BME.
- Incubar marcada com His MffΔTM (5 uM final), com lipossomas de andaime (40 mol% de PC / 35% molar de PE / mole 15% CL / 10% molar de SGD-NTA (Ni 2+), 50 uM final) durante pelo menos 15 min à TA em Tampão a + BME (25 mM de HEPES, 150 mM de KCl, 10 mM de β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado para 7,5 com KOH). Para um controle Mff-livre, incubar lipossomas com uma marcada com His proteína de controlo (tal como GFP) para ligar e escudo exposta NTA (Ni 2+).
- Negativo Stain Transmission Electron Microscopy (EM) Análise
- Transferência de 5 uL de amostra a uma folha de película de laboratório, e estabelecer uma rede de Cu / Rh revestido-carbono sobre a amostra. Incubar a grade 1 min sobre a amostra, limpar o excesso de líquido em papel de filtro, e transferir para uma queda de 2% de acetato de uranilo. Incubar 1 min, blot excesso de corante em papel de filtro, e transferir para um caixa de grade. Loja sob vácuo O / N para assegurar a dessecação completa.
- amostras de imagem usando um microsc eletrônica de transmissãoope em 18.500 - 30,000X ampliação para observar as alterações ultra-estruturais em proteínas e lipossomas morfologias 17.
Nota: As alterações ultra-estruturais podem ser quantificados usando software de análise de imagem, tais como ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decoração proteína pode ser medido quando comparada com modelos nus lipídicas. Além disso, os diâmetros dos segmentos tubulares pode ser medido a partir da porção mais externa dos conjuntos 13. Uma análise mais detalhada pode ser realizada através de microscopia crio-eletrônico de 17. Este método pode ser utilizado para os conjuntos de proteínas em lípidos nativas imagem em solvente, sem a utilização de manchas de metais pesados que o revestimento da amostra. Desta forma, as características estruturais detalhados não aparentes na coloração negativa, incluindo mudanças na morfologia lipídico subjacente pode ser examinados e quantificados.
3. Uso de andaime lipossomas para Ensaio Enzimático
Nota: A coloriensaio GTPase métrica 18 foi utilizado para medir a libertação de fosfato por hidrólise GTP. GTPase ensaios alternativos estão disponíveis 19 e pode ser implementado conforme necessário.
- Incubar marcada com His MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), ou GFP (5 uM final para todos) com lipossomas de andaime (150 uM final) durante 15 min à temperatura ambiente em Tampão A + BME (volume = 30 mL). Adicionar Drp1 (500 nM final) e incuba-se um adicional de 15 min à temperatura ambiente (= 80 mL de volume).
NOTA: Fis1 foi purificado de uma maneira similar à Mff 2, mas o passo de cromatografia de permuta iónica foi omitido. O propósito de Sua marcado com GFP é para proteger o NTA (Ni 2+) headgroups e evitar interacções de carga não específicas com outras proteínas. Se nenhum efeito é observado na ausência de GFP, então pode não ser necessária este controlo. proteínas alternativos de bloqueio (de tamanho comparável à da proteína de interesse) pode ser utilizado, bem como, mas GFP permite a visualização directa das interacções com SCAFdobre lipossomas. - Tubos de transferência para um termociclador definido como 37 ° C, e iniciar as reacções por adição de GTP e MgCl2 (1 mM e final de 2 mM, respectivamente; volume = 120 mL).
- Em pontos de tempo desejado (isto é, T = 5, 10, 20, 40, 60 min), a transferência de 20 uL da reacção aos poços de uma placa de microtitulação contendo 5 uL de EDTA 0,5 M para quelar Mg 2+ e parar a reacção.
- Preparar um conjunto de padrões através da diluição de fosfato de KH 2 PO 4 em tampão A + BME para calibrar os resultados. Um conjunto útil de padrões é de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 uM. Adicionar 20 ul de cada uma a poços contendo 5 uL de 0,5 M de EDTA.
- Adicionar 150 uL de reagente de malaquite verde (1 mM de malaquite verde carbinol, 10 mM de molibdato de amónio tetrahidratado, e HCl 1 N) a cada alvéolo, e leu OD650 5 min após a adição.
NOTA: GTP é ácido lábil, e irão hidrolisar na presença de reagente de verde de malaquite. Certifique-se que tele o tempo entre a adição do reagente malaquita e leitura é constante para garantir a reprodutibilidade dos resultados. - Gerar uma curva padrão através da representação gráfica OD 650 dos padrões como uma função da concentração de fosfato. Use de regressão linear para determinar a relação entre a OD 650 e a concentração de fosfato numa amostra.
- Usando a regressão linear, converter a OD 650 das amostras de reacção de fosfato de proteína para uM. Determinar a taxa de geração de fosfato para cada mistura de reacção através da representação gráfica concentração de fosfato como uma função do tempo, e converter a k cat dividindo a taxa pela concentração Drp1 (0,5 uM).
NOTA: Apenas a taxa linear inicial deve ser utilizado para determinar a taxa de geração de fosfato, e um mínimo de 3 pontos de dados devem ser usados. Se a velocidade de reacção é suficientemente rápida que os três primeiros pontos de dados não é linear (isto é, o R2 do ajuste linear é inferior a 0,9) um sinalcurso de tempo mais curto ificantly com, pelo menos, 3 pontos de tempo deve ser realizada.
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Representative Results
Embora a interacção entre Drp1 Mff e foi demonstrada ser importante para a fissão mitocondrial, esta interacção tem sido difícil de recapitular in vitro. Nosso objetivo era melhor emular o ambiente celular no qual Drp1 e do QFP interagir. Para este fim, os lipossomas contendo concentrações limitativos de NTA (Ni 2+) headgroups foram preparados através da hidratação de uma película de lípido, tal como descrito acima. A solução de lípido consiste inicialmente em vesículas unilamelares e multilamelares com diâmetros heterogéneos como evidenciado pela opacidade da solução (Figura 1a). Esta opacidade é reduzida por congelação-descongelação (Figura 1B), o que reduz a prevalência de vesículas multilamelares. Os diâmetros de lipossomas são adicionalmente homogeneizada por extrusão através de um filtro de policarbonato, o que resulta numa solução límpida (Figura 1C).
2. Com base nestas conclusões, utilizamos um novo modelo composto por PC, PE, Ni e CL (chamado Enriquecido andaime lipossomas ou ESL) para promover conjunto ordenado de um polímero Drp1-Mff complexo capaz de induzir a deformação da membrana. Especificamente, o aumento da NTA (Ni 2+) e lípidos cardiolipina foram utilizados (10% mol e 15 mol%, respectivamente) para esta aplicação. Então, GFP ou Mff foi preso a modelos de ESL na presença e ausência de Drp1 (Figura 2), ea capacidade de Drp1 para remodelar membranas foi avaliada qualitativamente. Na ausência de Drp1, nem Mff nem GFP resultou na deformação da membrana (figura 3a, b), e da mesma forma, no caso de AEP decorado-GFP, apenas se observaram os lipossomas sem forma (Figura 3c). No entanto, quando Drp1 foi adicionado aos modelos ESL Mff decorados, remodelação dos lipossomas foi evidente (Figura 3d).
Embora a formação do complexo macromolecular demonstra claramente uma interacção entre Drp1 e Mff, esta análise qualitativa por si só é incapaz de determinar os efeitos funcionais de uma tal interacção. Portanto, utilizou-se um ensaio de geração de fosfato de verde de malaquite 18 para avaliar alterações na actividade catalítica de Drp1 em resposta à interacção com Mff. Como descrito anteriormente 2, foi inicialmente utilizado um simples lipossoma andaime (SL; 3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+), 96,7% molar de DOPC) para investigar o efeito de Mff sozinho sobre a estrutura e função Drp1. Interacção não específica de Drp1 com NTA (Ni 2+) foi anteriormente descrito 20, então SL foi inicialmente concebido para conter baixas concentrações de NTA (Ni 2+) para evitar a estimulação actividade inespecífica do Dr.p1. Com as quantidades maiores de NTA (Ni 2+) em AEP, o uso de GFP marcada com His como um controlo verificou-se ser crítico para proteger o Ni 2+ e evitar interacções não específicas Drp1. Após a decoração de SL lipossomas por Mff ou GFP (tal como ilustrado na Figura 2), a extensão da auto-montagem pode ser avaliada medindo a actividade de GTPase de Drp1. Na ausência de lipossomas, Drp1 tem uma actividade de GTPase da base relativamente baixo, o que é ligeiramente aumentada por adição de SL. Decoração destes lipossomas de andaime com Mff melhorada actividade de GTPase (Figura 4a, 1,8 vezes). Por outro lado, quando o exposto NTA (Ni 2+) headgroups foram bloqueadas com GFP marcada com His, esta actividade de GTPase aumentada foi cauterizado. Também testámos o papel de Fis1, uma proteína OMM que tem sido sugerido para desempenhar um papel na fissão mitocondrial 21,22, embora este tenha sido questionada em estudos recentes 7,23. Tethering de Fis1 faltando seu domínio transmembranarpara SL também não conseguiram induzir uma estimulação da actividade de GTPase da Drp1 (Figura 4a).
Em seguida, utilizou-se um andaime de lípidos ligeiramente mais complexo contendo uma pequena quantidade de cardiolipina (SL / CL: SL com 10% molar de cardiolipina substituindo DOPC) para determinar o papel deste lípido mitocondrial na interacção de Drp1 e Mff. Esta concentração moderada de cardiolipina foi escolhido especificamente para limitar a estimulação de Drp1 pela cardiolipina como descrito anteriormente 10. Semelhante a SL, a adição de SL / CL para Drp1 resultou numa ligeira estimulação da actividade de GTPase que foi revertida por amarrar marcada com His Fis1 ou GFP para os lipossomas. Observou-se uma sinergia entre Mff e cardiolipina como a actividade de GTPase de Drp1 foi estimulada 2,6 vezes quando foi incubada com Mff-decorado SL / CL (Figura 4b).
a fluidez da membrana e a capacidade óf Drp1 para remodelar bicamadas lipídicas têm sido propostos para aumentar a sua actividade de GTPase. Por isso, procurou-se avaliar o efeito da membrana fluidez / flexibilidade utilizando um lipossoma andaime flexível. Isto foi conseguido através da substituição de 35% em moles de DOPC na SL / CL com DOPE (SL / PE / CL), que tem sido mostrado previamente para permitir mediada por Drp1 membrana 10 pode ser notada. A adição de undecorated SL / PE / CL lipossomas andaime para Drp1 aumenta ligeiramente a atividade GTPase Drp1 e decoração dos lipossomas com GFP elimina esse efeito. Quando templates / PE / CL SL foram decoradas com QFP atividade Drp1 foi reforçada (Figura 4c, 2,4 vezes). Como foi mostrado anteriormente, a capacidade de Drp1 para remodelar lipossomas nos túbulos lípido foi aumentada pela adição de PE para os lipossomas de andaime. Curiosamente, esta tubulation melhorado que conduz à formação de um polímero Drp1 helicoidal não deu origem a qualquer estimulação maior quando comparado com os lipossomas que Drp1 não consegui remodelar Usando esses modelos lipídicas adaptáveis, QFP, e Drp1 foram encontrados para interagir em um ambiente mais natural in vitro. Esta técnica permitiu-nos controlar a abundância relativa de Drp1, Mff (através de NTA (Ni 2+) concentração), e lipídios específicos (cardiolipina e PE especificamente) que apareceram para regular a montagem deste complexo macromolecular. Como já demonstrado, este método pode ser utilizado para visualizar a remodelação da membrana Drp1 Mff-recrutados por microscopia electrónica, e para determinar os efeitos de montagem Drp1 sobre a sua actividade catalítica utilizando um ensaio de actividade de GTPase. 71fig4.jpg "/> 
Figura 1: Lipid Preparação esquemático. (A) Após a ressuspensão, lipossomas de diversos tamanhos formar e consistem em unilamelar e multilamelvesículas Lar, o que resulta em uma solução opaca (inserção). (B) congelação-descongelação os resultados solução numa população mais unilamelar de lipossomas, os quais ainda são heterogéneas no diâmetro. Congelamento e descongelamento esclarece a solução (inserção). (C) extrusão da solução lipídica homogeneíza o diâmetro de lipossomas (1.0 uM neste exemplo), e resulta em uma solução límpida (inset). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 2: métodos para avaliar a montagem de proteínas. A montagem esquemática proteína parceira de descrição em lipossomas de andaime é apresentado. Marcada com His proteínas parceiras ou GFP são incubadas com lipossomas de andaime, e, em seguida Drp1 é incubado com lipo decoradas ou undecorated somes. Estes lipossomas pré-montada-Drp1 pode, então, ser analisados por métodos estruturais (microscopia electrónica) e os ensaios funcionais (ensaios de GTPase). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura. 
Figura 3: Avaliação Estrutural de Drp1 Recrutamento. Micrografias de transmissão de coloração negativa de GFP ou Mff decorado lipossomas sozinho (A, B, respectivamente) ou incubadas com Drp1 (C, D, respectivamente). Barra de escala = 100 nm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Andaime lipossomas Ensaio enzimático. (A - C) A geração de fosfato ao longo do tempo foi medida (de inserção), e o kcat foi determinada. Este método foi aplicado a proteínas SL-tethered (A), proteínas de SL / CL-tethered (B), ou SL / PE proteínas / CL-tethered (C). #: P <0,05, *: p <0,0001, **: p <0,000001 tal como determinado pelo teste t de Student não pareado. Todas as barras de erro representam o desvio padrão de 3 amostras independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este protocolo oferece um método para a investigação das interacções proteína-proteína envolvendo proteínas de membrana integrais. Através da utilização de um lipossoma andaime modular, os investigadores são capazes de avaliar a actividade de uma ou mais proteínas num ambiente de lípido-proximal. Estudos anteriores têm demonstrado um método semelhante por enzimas de receptor da membrana do plasma 24-26. Nós expandimos esse método para incorporar cofatores lipídicos e explorar interações entre proteínas que compõem o núcleo mechanoenzymatic das máquinas de fissão mitocondrial.
Para o sistema modelo apresentado acima, descobrimos que Mff decorados SL reforçada Drp1 auto-montagem. Além disso, temos agora mostram que, modelos ESL Mff decorados foram eficientemente remodelado por tipo selvagem Drp1 para formar estruturas tubulares alargados. Também foram avaliadas as funções de vários lipídios mitocondriais, incluindo a cardiolipina carregado negativamente eo PE lipídico cônica.Cardiolipin synergizes com QFP a fim de aumentar ainda mais Drp1 auto-montagem, enquanto a flexibilidade da membrana e fluidez transmitida pelo PE aumenta tubulation membrana, mas não aumentar ainda mais a estimulação Mff-induzido.
Para avaliar as alterações ultra-estruturais em morfologias de membrana, EM análises foram necessários. Atividade GTPase Drp1 foi elevada por meio de clustering e montagem de polímeros filamentosos que não reformular os lipossomas para qualquer grande extensão 2. No entanto, observou-se a deformação da membrana quando se utilizou o modelo mais SL / PE / CL mitocôndrias-like. Curiosamente, a actividade da enzima não foi melhorada. Portanto, os estudos de EM foram essenciais na identificação de diferenças fundamentais que seriam perdidas utilizando o ensaio funcional.
Embora esta técnica é poderosa para explorar a interacção e função de proteínas solúveis e os domínios de proteínas solúveis, estes suportes de lípidos não pode explicar o papel de domínio transmembranars. Esta é uma consideração importante porque o domínio transmembranar pode efectuar processos de proteína dinâmicos, tais como a auto-montagem 27 e difusão lateral 28-30 em bicamadas lipídicas. Se estes factores são cruciais para avaliar as interacções de proteína na superfície da membrana, em seguida experiências de reconstituição tradicionais lipídica com detergente seria favorecida. amarras alternativos podem também ser explorado para controlar o recrutamento e a mobilidade das proteínas de membrana ancoradas.
Além de utilizar as proteínas marcadas com His com âncoras de lípidos NTA (Ni 2+), outras amarras, tais como 31 ou lípidos reactivos grupo conjugado com biotina-conjugado pode ser utilizado. Estas modificações covalentes seria mais estável proteínas armadilha na superfície de lipídios, mas a mobilidade e intercâmbio destes fatores provavelmente seria diminuída. Como tal, o cordão deve ser cuidadosamente considerada no contexto dos complexos de proteína a ser estudada. quando considetocar a utilização deste método, o modo de amarrar proteínas para modelos de lípidos têm o potencial de influenciar certos ensaios. Por exemplo, o His-tag para amarrar método NTA (Ni 2+) pode ser mais apropriada para ensaios in situ em vez de experiências de separação, em especial no caso de interacções proteína-proteína transiente. Isto é claramente demonstrado na Figura 3 pela discrepância entre a microscopia eletrônica mancha in situ negativo e o ensaio de sedimentação.
No futuro, uma combinação de dois ou mais destes lípidos de ancoragem com headgroups alvo distintos pode ser implementado para permitir o recrutamento de várias proteínas com um modelo de andaime sem competição por um único tirante lípido. Além disso, a abundância relativa de cada componente pode ser controlado por alteração da composição lipídica. co-factores lipídicos adicionais, tais como fosfoinositídeos, cardiolipina, e fosfatidilserina, podem facilmente ser introduzidosnestes modelos para avaliar o impacto isolado de uma variedade de factores.
Em geral, estes andaimes lipídicas representam uma plataforma inovadora para investigar as interações complexas de proteínas próximos membranas lipídicas. Esses modelos são facilmente gerados e são simples de adaptar a uma gama de aplicações diversas, incluindo ensaios enzimáticos, microscopia eletrônica, ou imagens de fluorescência. Além disso, a composição lipídica pode ser formulada para se assemelhar a um organelo ou membrana microdomínio de interesse para melhor recapitular a função da proteína nestas regiões específicas. Utilizando estas técnicas, os bioquímicos podem sondar as interações complexas de ligada à membrana e proteínas de membrana associadas com os seus parceiros e seu ambiente.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCl | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4 - 20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
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