Summary
我们制定了两套在ROSA26 tdtomato（在所有细胞中广泛表达）/ Cre重组（特别是软骨细胞表达）小鼠跟踪组合：一个2.3Col1a1-GFP（具体以成骨细胞）和一个与免疫（具体以骨细胞）。该数据证明软骨细胞的直接转化成骨细胞。
Abstract
细胞谱系追踪系统已在发育生物学研究中主要使用。利用Cre重组酶的允许记者在特定细胞系和所有后代的活化。在这里，我们使用的细胞谱系追踪技术来证明软骨细胞长骨以及使用2种酶Cre，COL10A1 Cre重组和聚蛋白多糖-Cre重组ERT2（ 此Agg-Cre重组ERT2）的下颌骨髁发育过程中直接转变成成骨细胞和骨细胞，越过与ROSA26 tdTomato。无论Col10和蛋白聚糖被公认的标记物软骨细胞。
在此基础上，我们开发了一种新方法，细胞谱系通过分析细胞特异性标志物的表达在用荧光免疫-以限定细胞的命运一起跟踪。 RUNX2（对于早期骨细胞的标记）和牙本质基质蛋白1（DMP1;对于晚期骨细胞的标记）为用于鉴定软骨衍生骨细胞和它们的分化状态。这种组合不仅拓宽细胞谱系追踪中的应用，而且还简化了化合物的小鼠的产生。更重要的是，亲本细胞的后代的数量，位置和分化状态同时显示，提供比细胞谱系单独跟踪的详细信息。总之，细胞谱系追踪技术和免疫荧光共应用是用于体内研究细胞生物学的有力工具。
Introduction
在开发过程中，软骨内骨形成占骨架体积的80％以上。人们普遍认为，这首先肥大软骨细胞的凋亡。接着，从底层骨髓细胞侵入并启动血管生成，随后通过骨髓和骨膜衍生细胞-1,2-新骨沉积。肥大软骨细胞的细胞命运（HCS），然而，一直是人们争论的一个问题，几十年来3。最初，碳氢化合物被认为是软骨细胞分化途径的端部，和凋亡普遍认为是碳氢化合物的最终命运。现在，一些研究人员认为，至少有一些碳氢化合物能够生存，并有助于软骨内成骨。虽然他们提议生长板软骨不得不转分化成基于超微结构，免疫组织化学染色的成骨细胞的能力，以及在体外研究46中 ，这些方法瓦特埃雷在证明对成骨细胞谱系的贡献软骨明确。
该细胞谱系追踪技术提供了一种更严格的方式来研究细胞命运。简要地说，一个重组酶，这是只在特定类型的细胞中表达，刺激报道基因的表达。以这种方式，这种类型的细胞及其后代被永久标记7。该Cre的loxP系统在谱系追踪常用。酶Cre（重组酶酶）将切除两个loxP位点之间的停止序列和激活报告在特定的细胞系（ 图1A）。在一些情况下，研究者可以选择有利的时间点，通过使用一种药物，例如他莫昔芬激活酶Cre，引起酶Cre熔合到雌激素受体（酶Cre ERT2）8的改进形式。荧光记者已成为谱系追踪实验，因为他们大幅降低复杂性的标准和提高细胞命运跟踪8,9的准确性和效率。 tdTomato是变荧光报告之间的最佳选择，因为它具有最亮的荧光蛋白和最强的萤光，使它很容易地可视化7（ 图1A）。
通过使用ROSA26 tdTomato谱系追踪系统，我们组和其他研究者已经证明，碳氧化合物可以在开发过程中10-14改变其表型成骨细胞。要做到这一点，我们开发了两套与ROSA26 tdtomato（普遍存在的表达在所有的细胞）/ Cre的（特定于软骨细胞）的小鼠的跟踪组合：2.3Col1a1-GFP（特定于成骨细胞）和免疫荧光（特定于骨细胞）。该数据表明，这两种方法都是可行的方法，来研究细胞的命运体内 。
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Protocol
所有协议进行审查和机构动物护理和使用委员会（IACUC）在得克萨斯A＆牙科M大学学院批准。
1.动物育种
- 在这项研究中使用三种动物模型。为了研究胚胎软骨细胞的形成髁的命运，第一次使用COL10A1 Cre重组 15只和ROSA26 tdTomato越过他们（B6; 129S6- 亿吨（ROSA）26Sor TM9（CAG-tdTomato）HZE / J）小鼠获得Col10a1-综合招聘考试及ROSA26 tdTomato老鼠。接下来，跨越这些小鼠2.3Col1a1-GFP小鼠16。使用COL10A1 Cre重组; ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP的小鼠进行细胞谱系追踪试验（ 图1B）。
- 为了研究产后软骨细胞的命运，遵循相同的程序与步骤1.1，但使用蛋白多糖，CRE ERT2（ 总比分Cre重组ERT2）17,18线，并保持此Agg Cre重组ERT2; ROSA26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP的小鼠进行细胞谱系追踪试验（ 图1C）。注入14日龄他莫昔芬。
- 要结合细胞谱系追踪与免疫荧光技术，跨AGG的Cre重组ERT2小鼠和ROSA26 tdTomato老鼠。使用该实验中携带两个基因小鼠和3日龄（ 图1D）注入他莫昔芬。
2.材料准备
- 溶解在10％的乙醇和90％的玉米油的他莫昔芬粉末以10mg / ml的浓度。用于注射的剂量为75毫克/公斤。
- 溶解在PBS中的多聚甲醛（PFA）粉末，以4％的浓度，用2M的氢氧化钠以调节pH值至7.4。使用4％PFA解决方案，以修复牺牲后，组织（下颌骨髁状突和后腿这里使用）。由于其毒性，在手套和口罩罩处理PFA。
- 溶解在蒸馏水中的EDTA粉末的浓度为10％，用2M的氢氧化钠以调节pH值至7.4。使用10％的EDTA脱钙髁突及后腿。
- 溶解在15％和30％的浓度在PBS中蔗糖的粉末。使用蔗糖溶液脱钙后脱水的组织。
- 溶解在PBS中的透明质酸粉末以2毫克/毫升，pH 5.0的浓度。这个解决方案是免疫抗原修复。
- 用1.5毫升管以制备含有3％牛血清白蛋白（BSA）和20％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的封闭溶液。
- 用1.5毫升管以制备包含2％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的初级抗体溶液。第一抗体的浓度为1：400为Runx2的和1：100 DMP1。
- 用1.5毫升管以制备兔IgG溶液作为对照用于免疫荧光染色，以避免假阳性结果。该溶液含有在PBS中2％山羊血清。的兔IgG为Runx2的控制的浓度为1：400;为DMP1，1：100。同时进行实验组和对照染色。
- 使用1.5ml的管以制备包含2％山羊血清的PBS Runx2的或DMP1免疫荧光染色的二级抗体溶液。使用的第二抗体以1稀释：500。
3.将准备共聚焦显微镜（细胞系只有跟踪，用免疫无组合）
- 在有利的时间点注入在此Agg-CRE ERT2小鼠他莫昔芬。
- 首先，从笼子里取出一只老鼠。然后，用左手拇指和食指抓住鼠标的背部皮肤，翻过来，露出腹部。用右手按住注射器。最佳入口点注射是在LEFT或下腹部的右侧，避免了肝脏和膀胱。
- 保持平行注射器鼠标的后腿和腹膜内注射。用于注射的剂量为75毫克/公斤。分别为18克， - 小鼠在2周，3周，4周龄的年龄的加权数是约7 - 8克，11 - 13克，和16。
- 麻醉与赛拉嗪/ Ketaset组合的老鼠。
- 为了制备工作溶液，先用蒸馏水稀释甲苯噻嗪和Ketaset至1毫克/毫升和5毫克/ ml的浓度，分别。 2比：接着，在1混合甲苯噻嗪和Ketaset。用于注射的剂量为30微升/ g以下。
- 注入如在步骤3.1。按捏鼠的脚踝确认麻醉。鼠标是无意识的，如果它没有反应。
- 麻醉后灌注用4％PFA的小鼠。
- 鼠标失去知觉后，固定在板上鼠标的四条腿entirelŸ露出腹部。
- 饱和，用70％的乙醇的腹部并进行切除从下腹部到沿中间线颈部。捏和同时皮肤拉向侧面以显示腹膜。用剪刀清扫，使纵向切除。
- 切断并去掉前面的肋骨暴露心脏。从一个22克的注射器左心室穿刺心脏，持注射器，同时切槽的右心耳。
- 慢慢注入4％PFA，其沿着心血管系统灌注而潮红出从右侧耳廓的切割。在PFA的灌注体积为1毫升/克。执行在I级生物安全柜是难以输送到大楼的排气系统这一步。
- 剥离鼠标的皮肤，并把整个身体成含有40毫升的4％的PFA在4℃固定过夜的50ml聚丙烯离心管中。
- 使用解剖剪刀和＃3，＃5镊子小心地清除体内的下颌骨和后腿，并除去表面的肌肉和肌腱。执行在I级生物安全柜是难以输送到大楼的排气系统这一步。
- 切下颌骨成两片在第三臼齿的远侧区域。同样，切股骨和胫骨中的中段，以暴露骨髓腔，以加速脱钙。把包括所述髁和髁突的一部分，并与后腿成40毫升10％的EDTA一起在4℃下进行2脱钙 - 4天50ml的聚丙烯离心管中。
- 用50毫升15％的蔗糖在50ml的聚丙烯离心管中，以脱水髁和后腿过夜，在4℃。
- 使用30％的蔗糖在50ml的聚丙烯离心管中，以脱水髁和后腿在4℃过夜。
- 沿矢状面，嵌入与样品华侨城在冷冻切片机切板。
- 水平放置髁或在安装模具的后腿。淹没组织OCT和它留在冷冻切片机，直到华侨城冻结。
- 安装在剪板机华侨城块。切割，以确保在OCT是完全冻结之前等待约15分钟。
- 切髁和后腿成10微米的部分。收集幻灯片和商店的部分在-20°C。
- 孵育在37℃室中的载片染色之前以除去水。
- 用蒸馏水洗涤载玻片两次5分钟。
- 擦去水绕每个部分。使用疏水屏障用笔圈出部分拖放DAPI或无荧光防褪色的安装解决方案进入这个圈子。小心放下盖玻片。
4.免疫组织化学染色为Runx2的和DMP1
注：IgG抗体CON控制是必要的免疫组化染色，避免假阳性信号。需要同时执行对实验组和对照组的染色。
- 孵育在37℃室中的载玻片染色之前以除去水。
- 用蒸馏水冲洗幻灯片的两倍。
- 使用疏水屏障笔来圈上滑动的所有部分。从该步骤中，添加所有制备的溶液的成圈以完全覆盖部分。
- 治疗与透明质酸酶的部分在潮湿室中在37℃下进行30分钟。的溶液（在步骤4.5 - 4.8）的体积取决于该部分的大小。用于髁50微升溶液和100微升的长骨。用PBST（PBS中含有0.1％吐温20）三次清洗。
- 制备和应用封闭溶液到每一个部分，并培育它们在潮湿室中在室温下1小时。
- 孵育主要章节在4℃过夜抗体溶液（兔抗小鼠Runx2的，或兔抗小鼠DMP1）。用PBS三次洗涤。
- 孵育二级抗体溶液（山羊抗兔，的Alexa Fluor 488），用于在室温下2小时的部分。用PBS三次洗涤。
- 擦掉水绕的部分拖放DAPI到了中圈，以支付幻灯片上的部分。小心放下盖玻片。
5.共聚焦显微镜
- 在波长范围从488微米（绿色），561微米（红色）捕获利用共聚焦显微镜的荧光细胞图像。在200Hz以多个堆叠图像19（1024×1024尺寸），使用10X，20X，63X和镜头。
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Representative Results
软骨细胞直接转变成在颌骨髁状突和长骨骨细胞（成骨细胞和骨细胞）。
聚集蛋白聚糖 ，对软骨的关键基因，主要表现为早期和成熟的软骨细胞18。其结果是，在2周的年龄在此Agg-Cre重组ERT2三苯氧胺的注射液; ROSA26 tdTomato激活小鼠红番茄记者在所有的软骨细胞和它们的子细胞。所述2.3Col1a1-GFP线引起了绿色荧光色胶原1表达骨细胞，特别是成骨细胞和前骨细胞。黄色（红色与绿色相结合）表明，所表达的胶原1基因软骨衍生骨细胞的存在。在图2A中，大部分的骨细胞的软骨下的髁突的是红色或yellow（即已经开始分泌绿色荧光COL1A1，从而出现黄色时，两个荧光基团叠加红细胞）。这些结果提供了有力的证据表明，这些骨细胞从软骨细胞的。类似的结果长骨发育，其中的大多数骨细胞从两种骨骺（ 图2B）和干骺端（ 图2C）的软骨细胞衍生的过程中也观察到。
为了进一步研究这些结果，我们穿过与ROSA26 tdTomato Col10al Cre重组酶的小鼠; 2.3Col1a1-GFP小鼠。 COL10A1是碳氢化合物一个高度特异性标记，表示只有在碳氧化合物和他们的后代。此外，COL10A1 Cre重组是不可诱导，这反映了从COL10A1表达（在E14.5）的最开始细胞的分化。在3周龄小鼠中，红色和s软骨 - 骨界面（上级）附近的小梁青梅黄色荧光细胞为主，而绿色荧光细胞稀少。在一个稍微逊色区域（中间电平），大部分细胞是发荧光的黄色，具有稍微少一些荧光红色。绿色荧光的细胞似乎支配仅在髁突（劣级）（ 图3）的最下区域。这种趋势表明，髁突的生长是通过从碳氢化合物转化的骨细胞主要贡献。在髁突的红色和绿色荧光的细胞的分布也与髁突生长的劣到向上的方向是一致的。
细胞世系追踪技术，清楚地表明，细胞凋亡是不是碳氢化合物的唯一命运。无论是AGG的Cre重组ERT2和COL10A1-Cre的线表示软骨细胞衍生骨细胞是在髁突骨发育和骨骺的主要来源与干骺端在长骨。
免疫荧光染色和细胞世系追踪的共同应用，使细胞分化的跟踪。
细胞谱系追踪技术也可以用荧光免疫组织化学结合，以确定由检测一个细胞特异性标记的细胞类型。该方法对细胞命运的研究几个优点。首先，研究人员仍然可以通过选择适当的标记物，即使没有特定的GFP鼠标线，从而拓宽了细胞谱系追踪技术的应用定义电池特性。其次，它简化了化合物的小鼠的产生。举例来说，我们只需要生成AGG的Cre重组ERT2; ROSA26 tdTomato复合小鼠产生红色激活酶Cre（3日龄）后，而不是创建AGG的Cre重组酶ERT2; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato小鼠，这需要更多的杂交。
在这项研究中，我们选择了免疫荧光染色两种抗体。一个是对Runx2的，成骨细胞的成熟过程中的一个关键转录因子（骨细胞的早期）;另一个是对DMP1，成熟骨（骨细胞的末期）表示。在图4中 ，绿色荧光表示在2周龄髁突的Runx2的或DMP1抗体表达。在图4A中，三种类型的软骨下骨着色细胞的存在。在细胞核中的黄色（红色和绿色的荧光叠加）表示软骨衍生骨细胞中表达Runx2的，这表明这些细胞在骨表面上未成熟的成骨细胞。此外，还有红色荧光骨细胞不表达Runx2的（红色˚Fluorescence不叠加绿色）。这些细胞代表了骨基质的成熟软骨细胞衍生骨细胞。最不常见的细胞那些只有绿色荧光核，表明非软骨细胞衍生骨细胞Runx2的表达或Cre重组酶激活才发生了转变。图像表明，红骨细胞和那些与黄色细胞核大多数细胞群有助于髁软骨下骨的形成。
另一方面，几乎每一个红，软骨衍生的骨中的骨基质的细胞有围绕它们的细胞体DMP1染色。几个骨细胞呈阳性DMP1但缺乏红细胞体（ 图4B）。也有用于这些细胞的两种可能的解释：要么它们是非软骨衍生的骨细胞，或者它们是在此之前的他莫昔芬注射转化软骨衍生骨细胞。此外，无红骨细胞骨的表面上表达DMP1，这表明它们没有成熟骨细胞。
综上所述，从骨细胞的早发都（Runx2的）和后期标记（DMP1）的表达模式的数据与使用的Cre与2.3Col1a1-GFP结合以前的结果是一致的。这些数据表明，免疫荧光和ROSA26 tdTomato跟踪的组合是研究细胞命运的好方法。更重要的是，研究人员可以区分细胞类型，确定分化阶段，并通过使用免疫荧光用不同的标记，这比ROSA26 tdTomato单独跟踪提供了更多的信息观察同时转化的细胞数。
图 1. 细胞谱系跟踪和日机理复合小鼠E世代。 A）的酶Cre-loxP系统在沿袭跟踪常用。 Cre的切除的tdTomato蛋白（荧光红色）中的特定细胞系永久表达的两个loxP序列之间的停止序列和。 B）三种动物模型在本文中提及。我们使用2.3 COL1A1-GFP; ROSA26 tdTomato小鼠和越过他们COL10A1 Cre重组酶的小鼠。 COL10A1-Cre的非诱导的，它反映了从COL10A1表达（在E14.5）的最开始的细胞分化。 C） 聚集蛋白聚糖-酶Cre ERT2（总比分Cre重组ERT2）是另一种酶Cre线还具有交叉2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato老鼠。 （：他莫昔芬的Tm）的Cre遭到了他莫昔芬注射后2周的年龄激活。 D）为了与细胞谱系追踪的免疫相结合，我们产生AGG的Cre重组ERT2; <EM> ROSA26 tdTomato小鼠，激活酶Cre在出生后3天，并进行了Runx2的和DMP1免疫（商标：他莫昔芬）。 请点击此处查看该图的放大版本。
图 2. 软骨细胞在颌骨髁状突和长骨骨细胞（成骨细胞和骨细胞）使用 此Agg Cre重组 ERT2 改造 ; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato 复合小鼠。 A）的Cre被激活的他莫昔芬对14日龄和小鼠在4周龄处死。有三个颜色的单元格中的髁突：纯红（软骨衍生骨细胞），黄色（红色与绿色的结合，这表明所表达的胶原1基因软骨衍生骨细胞），和纯绿色（非软骨衍生骨细胞与胶原1基因） 。大多数骨细胞软骨下的髁突呈黄色或纯红（白箭头），而少数骨细胞是绿色的（蓝色箭头）。这些数据提供了强有力的证据表明在开发过程中的软骨细胞直接转变成骨细胞，并有助于髁状突的形成（商标：他莫昔芬; C：软骨; B：骨）。 B，C）大多数骨细胞在骨骺和干骺端进行软骨细胞源性（白色箭头：软骨细胞转化的骨细胞在黄色或纯红色，蓝色箭头：非软骨细胞衍生骨细胞的纯绿色; AC：关节软骨; GP：生长板）。空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图3.软骨细胞在颌骨髁状突使用 Col10al Cre重组 骨细胞的转型 ; 2.3Col1a1-GFP; ROSA26 tdTomato 复合小鼠 。 A）从3周龄小鼠髁突，绿骨细胞的软骨骨界面附近的小梁明显的少数（ 优级，A1），而红的，有黄细胞为主。处于中等水平（A2），黄细胞占多数，有略少的红细胞。绿色细胞似乎是在大多数只有在最劣区（a3）的。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.两个标记与在髁状突的谱系追踪背景骨细胞使用2周龄 AGG的Cre重组酶 ERT2 的共定位 ; ROSA26 tdTomato 复方小鼠。 一）黄色在细胞核表示髁软骨下的骨小梁的表面上表达Runx2的（白色箭头）软骨衍生骨细胞。纯红骨细胞，而不表达Runx2的代表在骨基质（黄色箭头）的成熟软骨细胞衍生骨细胞。该feweST细胞是那些只携带绿核，较软骨细胞要么不软骨细胞衍生骨细胞或转化骨细胞激活酶Cre（商标：他莫昔芬）之前。 B）在骨小梁髁软骨的下方，在骨基质几乎每一个红软骨衍生骨细胞进行DMP1染色围绕它们的细胞体（白色箭头）。只有少数的骨细胞的阳性DMP1但在它们的细胞体（黄色箭头）缺乏红色。有两种可能性，这些细胞：非软骨细胞衍生骨细胞或软骨细胞衍生骨细胞注射他莫昔芬前产生。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
由于技术限制，它始终是难以调查细胞在体内的行为。然而，细胞谱系追踪技术已被证明是用于研究细胞生物学7-9的有力工具。在这项研究中，我们进一步通过与免疫相结合的方法进行改进。以这种方式，细胞命运可以由多个相关的标志物，从而拓宽谱系追踪中的应用来定义。此外，免疫荧光和番茄信号的此共定位同时显示的创始人细胞，它们的位置，以及它们的分化状态的后代的数目，提供比细胞谱系单独跟踪的详细信息。此外，使用细胞特异性标记可以简化化合物的小鼠的产生，加速调查。
酶Cre的特异性是谱系的明确归属和结果20,21的精度是至关重要的。这是非常即时portant选择适当的酶Cre线验证细胞命运。 在这项研究中，我们选择了COL10A1，因为它被认为是肥大软骨10,11和聚集蛋白聚糖的特异性标记物，因为它也是软骨细胞18一个公认的标记。也有在其他领域使用良好的Cre机型。所述Scleraxis Cre重组（SCX-CRE）线，例如，因为scleraxis是为肌腱和韧带细胞谱系22的标记物碱性螺旋-环-螺旋转录因子是在肌腱和韧带研究是有用的。另一个名为Cre的DMP1-Cre重组酶在skeleton-和牙齿有关的研究常用的，因为DMP1在成牙本质细胞高表达和骨细胞23,24。
与非诱导Cre的系统相比，可诱导的Cre的活化可以在空间上和时间20的限制。然而，设计实验和解释的结果时，一些限制，应考虑诱导表达Cre车型。首先，他莫昔芬的剂量可能会改变的Cre活化的效率和标记的细胞的数目。低剂量的标签在克隆密度25感兴趣的人群;高剂量可标号的整个祖池7.26。因此，该剂量必须根据实验的目的来选择。其次，他莫昔芬有潜在的毒性，特别是在高剂量27,28。由于这个原因，最好是减少剂量，以避免晚期流产妊娠29期间注入时。
总之，细胞谱系追踪技术和免疫荧光共应用是用于体内研究细胞生物学的有力工具。在未来，研究者可以尝试与在番茄信号背景两种不同抗体同时执行免疫荧光。该方法可以显示两个标记的表达模式在一个部分，使其更容易的研究者比较和分析结果。此外，这种共同的应用程序，可以进一步通过原位免疫荧光改进以减少可能通过常规免疫荧光存在的非特异性染色。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
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