Summary
Vi udviklede to sæt sporing kombinationer i Rosa26 tdtomato (ubikvitært udtrykt i alle celler) / Cre (specifikt udtrykkes i chondrocytter) mus: en med 2.3Col1a1-GFP (specifik for osteoblaster) og en med immunofluorescens (specifikt for knogleceller). Dataene viser den direkte omdannelse af chondrocytter i knogleceller.
Abstract
Den cellelinie sporingssystem er blevet anvendt, overvejende udviklingsmæssige biologiske undersøgelser. Anvendelsen af Cre-rekombinase giver mulighed for aktivering af reporter i et specifikt cellelinie og alt afkom. Her brugte vi cellen afstamning sporing teknik til at vise, at chondrocytter direkte omdanne til osteoblaster og osteocytter under lange knogler og mandibular condylus udvikling ved hjælp af to slags Cre, Col10a1-Cre og aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), krydset med Rosa26 tdTomato. Både Col10 og aggrecan er velkendt markører for chondrocytter.
På dette grundlag har vi udviklet en ny metode-celle afstamning opsporing sammenholdt med fluorescerende immunhistokemi-at definere celle skæbne ved at analysere ekspressionen af specifikke cellemarkører. Runx2 (en markør for debuterende osteogene celler) og Dentin matrix protein1 (DMP1, en markør for sen-fase osteogene celler) varanvendes til at identificere chondrocyt-afledte knogleceller og deres differentiering status. Denne kombination ikke blot udvider anvendelsen af cellelinie opsporing, men også forenkler genereringen af sammensatte mus. Endnu vigtigere er de tal, placering, og differentiering status for forældre celle afkom vises samtidig, som giver mere information end celle afstamning sporing alene. Afslutningsvis co-anvendelse af celle afstamning sporing teknikker og immunofluorescens er et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellebiologi in vivo.
Introduction
Under udvikling, endochondral knogledannelse tegner sig for over 80% af skelet volumen. Det er en udbredt opfattelse, at den begynder med apoptose af hypertrofe chondrocytter. Efterfølgende cellerne fra den underliggende knoglemarv invadere og initiere angiogenese efterfulgt af ny knogle aflejring af knogle marrow- og periosteum-afledte celler 1,2. Cellen skæbne hypertrofe chondrocytter (HC) har imidlertid været et problem for debat i årtier 3. Først blev HC'er betragtet som enden af chondrocyt differentieringsvej, og apoptose blev generelt anset for at være den endelige skæbne HC'er. Nu, nogle forskere antyder, at nogle HC'er mindste kunne overleve og bidrage til endochondral knogledannelse. Selvom de foreslog, at væksten plade chondrocytter havde evnen til at transdifferentiate til osteoblaster baseret på ultrastruktur, immunhistokemisk farvning og in vitro-undersøgelser 46, ingen af disse metoder were endelig demonstrere chondrocyt bidrag til osteoblast afstamning.
Cellen afstamning sporing teknik giver en mere stringent måde at studere celle skæbne. Kort fortalt set en rekombinase enzym, som kun udtrykkes i en bestemt type celle, stimulerer ekspressionen af reportergenet. På denne måde er denne celletype og deres efterkommere permanent mærket 7. Cre-loxP-systemet er almindeligt anvendt i afstamning sporing. Cre (rekombinase enzym) vil udskære STOP-sekvensen mellem de to loxP-steder og aktivere reporter i et specifikt cellelinje (figur 1A). I nogle tilfælde kan investigator vælge et gunstigt tidspunkt til at aktivere Cre ved anvendelse af et lægemiddel, såsom tamoxifen, forårsager Cre at sammensmelte til en modificeret form af østrogenreceptoren (Cre ERT2) 8. Fluorescerende journalister er blevet standard i afstamning sporing eksperimenter, fordi de dramatisk reducere kompleksitetenog forbedre nøjagtigheden og effektiviteten af celle skæbne sporing 8,9. tdTomato bliver det bedste valg blandt fluorescerende reportere, da det har den klareste fluorescerende protein og den stærkeste epifluorescens, hvilket gør det nemt visualiseres 7 (figur 1A).
Som bruger Rosa26 tdTomato afstamning sporingssystem, har vores gruppe og andre forskere vist, at HC kan ændre deres fænotype i knogleceller under udvikling 10-14. For at opnå dette, har vi udviklet to sæt sporing kombinationer med Rosa26 tdtomato (allestedsnærværende ekspression i alle celler) / Cre (specifikt for chondrocytter) mus: 2.3Col1a1-GFP (specifik for osteoblaster) og immunofluorescens (specifikt for knogleceller). Dataene viser, at begge metoder er levedygtige måder at studere celle skæbne in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller blev revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved Texas A & M University College of Dentistry.
1. Husdyravl
- Bruge tre dyremodeller i denne undersøgelse. For at undersøge, hvilken skæbne de embryonale chondrocytter i condylus dannelse, første brug Col10a1-Cre 15 mus og krydse dem med Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) mus for at opnå Col10a1- Cre og Rosa26 tdTomato mus. Dernæst krydser disse mus med 2.3Col1a1-GFP mus 16. Brug Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP-mus til at udføre de cellelinje sporing eksperimenter (figur 1b).
- For at undersøge skæbnen for de postnatale chondrocytter, følge samme fremgangsmåde som i trin 1.1, men bruge Aggrecan-CRE ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 linje og holde Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP mus til at udføre de celle afstamning sporing eksperimenter (Figur 1C). Sprøjt tamoxifen på postnatal dag 14.
- At kombinere cellen afstamning sporing teknik med immunofluorescens, krydse Agg-Cre ERT2 mus og Rosa26 tdTomato mus. Brug mus, der bærer begge gener i eksperimentet og injicere de tamoxifen på postnatal dag 3 (figur 1D).
2. Klargøring
- tamoxifen-pulver i 10% ethanol og 90% majsolie opløses i en koncentration på 10 mg / ml. Doseringen til injektion 75 mg / kg.
- den paraformaldehyd (PFA) pulver i PBS opløses til en koncentration på 4%, under anvendelse af 2 M natrium-hydrat at justere pH-værdi til 7,4. Brug 4% PFA løsning til at løse væv (mandibular condylus og bagben bruges her) efter aflivning. På grund af sintoksicitet, håndtag PFA i hætten med handsker og en ansigtsmaske.
- EDTA pulver i destilleret vand opløses til en koncentration på 10%, under anvendelse af 2 M natrium-hydrat at justere pH-værdi til 7,4. Brug 10% EDTA til afkalke mandibulær condylus og bagben.
- sucrose pulver i PBS i koncentrationer på 15% og 30% opløses. Brug saccharoseopløsning at dehydrere vævet efter afkalkning.
- hyaluronidasen pulver i PBS opløses i en koncentration på 2 mg / ml, pH 5,0. Denne løsning er for immunfluorescens antigen hentning.
- Brug en 1,5-ml rør til fremstilling af en blokerende opløsning, der indeholder 3% bovint serumalbumin (BSA) og 20% gedeserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunfluorescensfarvning.
- Brug en 1,5-ml rør til fremstilling af en primær antistofopløsning, som indeholder 2% gedeserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunfluorescensfarvning. Koncentrationen af det primære antistof er 1: 400 for Runx2 og 1: 100 for DMP1.
- Brug en 1,5-ml rør til fremstillingkanin IgG-opløsning som kontrol for immunfluorescensfarvning at undgå falske positive resultater. Opløsningen indeholder 2% gedeserum i PBS. Koncentrationen af kanin-IgG i Runx2 kontrol er 1: 400; for DMP1, 1: 100. Udfør eksperimentet og kontrol farvning samtidigt.
- Brug en 1,5 ml rør til fremstilling af en sekundært antistof opløsning, der indeholder 2% gedeserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunfluorescensfarvning. Brug det sekundære antistof ved en fortynding på 1: 500.
3. Skub Forberedelse til konfokalmikroskopi (Cell Lineage Tracing kun, ingen Kombination med Immunofluorescens)
- Sprøjt tamoxifen i Agg-CRE ERT2 mus til en favorabel tidspunkt.
- Først skal du fjerne en mus fra sit bur. Brug derefter venstre tommelfinger og pegefinger til at få fat i huden på ryggen af musen, og vend det, udsætter maven. Bruge højre hånd til at holde sprøjten. Det optimale indgang til injektion er på left eller højre side af hypogastrium, undgå lever og blære.
- Opbevar sprøjten parallelt med bagbenene på mus og injicere intraperitonealt. Doseringen til injektion 75 mg / kg. Vægtene af mus ved alderen 2 uger, 3 uger og 4 uger gamle er ca. 7 - 9 g 11 - 13 g og 16 - 18 g hhv.
- Anesthetize mus med en xylazin / Ketaset kombination.
- Til fremstilling arbejdsopløsningen, først fortyndes Xylazin og Ketaset med destilleret vand til en koncentration på 1 mg / ml og 5 mg / ml. Dernæst blandes Xylazin og Ketaset i et 1: 2-forhold. Doseringen til injektion er 30 pl / g.
- Injicer som i trin 3.1. Bekræft bedøvelse ved at knibe musens ankel. Musen er bevidstløs, hvis det ikke har nogen reaktion.
- Perfundere musene med 4% PFA efter bedøvelse.
- Efter musen mister bevidstheden, fastsætte de fire ben med musen på et bræt for at entirely udsættes maven.
- Mætte maven med 70% ethanol og foretage en udskæring fra underlivet til halsen langs midterlinien. Klem og samtidig trække huden til de laterale sider for at afsløre den peritoneale membran. Brug dissektion saks til at gøre en langsgående udskæring.
- Skær og fjern de forreste ribben at eksponere hjertet. Punktere hjertet fra venstre ventrikel med en 22 G sprøjten, så hold sprøjten, og samtidig skære en slids i den rigtige øret.
- Injicer langsomt 4% PFA, som perfunderes langs det kardiovaskulære system, mens blodet flushes ud af snittet fra højre forkammer. Volumenet af PFA til perfusion er 1 ml / gram. Udfør dette trin i en klasse I biosikkerhed kabinet, der er hårdt ledes til bygningen udstødningssystemet.
- Peel off musens hud og sætte hele kroppen i en 50 ml polypropylen centrifugerør, der indeholder 40 ml 4% PFA at fastsætte natten over ved 4 ° C.
- Brug dissektion saks og # 3 og # 5 pincet til forsigtigt at fjerne underkæben og bagben fra kroppen og fjerne muskler og sener på overfladen. Udfør dette trin i en klasse I biosikkerhed kabinet, der er hårdt ledes til bygningen udstødningssystemet.
- Skær underkæben i to stykker på det distale område af den tredje molar. Tilsvarende sender lårbenet og skinnebenet i midshaft at blotlægge knoglemarven hulrum for at fremskynde afkalkning. Sætte den del, der omfatter kondyl og kondylære proces og langs med bagbenet i 40 ml 10% EDTA til afkalkning ved 4 ° C i 2 - 4 dage i en 50-ml polypropylen centrifugerør.
- Brug 50 ml 15% sucrose for at dehydrere den kondyl og bagben natten over ved 4 ° C i en 50-ml polypropylen centrifugerør.
- Bruge 30% saccharose til dehydrering af condylus og bagben natten over ved 4 ° C i en 50 ml polypropylen centrifugerør.
- Langs det sagittale plan, integrere prøven medOLT skærepladen i kryosektionen maskinen.
- Vandret lægge kondyl eller bagbenet i montering mug. Nedsænkes vævet i OCT og overlade det i kryosektionen maskinen, indtil OLT fryser.
- Monter OLT blok på skærende pladen. Vent ca 15 min før opskæring at sikre, at OLT er helt frosset.
- Skær kondyl og bagben i 10-um snit. Saml afsnittene om dias og opbevares ved -20 ° C.
- Inkubér objektglasset i et 37 ° C kammer til fjernelse af vandet før farvning.
- Vaskes objektglassene to gange med destilleret vand i 5 minutter.
- Tør vandet omkring hver sektion. Brug en hydrofob barriere pen til cirkel afsnittene og slip DAPI eller ikke-fluorescerende anti-fade monteringsløsning ind i cirklen. Læg forsigtigt ned dækglasset.
4. immunhistokemisk farvning for Runx2 og DMP1
BEMÆRK: IgG control er nødvendig for immunhistokemisk farvning for at undgå falske positive signaler. Farvningen for forsøgs- og kontrolgrupperne skal udføres samtidigt.
- Glassene inkuberes tildækket i et 37 ° C kammer til fjernelse af vandet før farvning.
- Vaskes objektglassene to gange med destilleret vand.
- Brug den hydrofobe barriere pen til cirkel alle sektioner på dias. Fra dette trin, tilføje alle den fremstillede opløsning ind i cirklen til helt at dække sektionerne.
- Behandl sektionerne med hyaluronidase i et fugtigt kammer ved 37 ° C i 30 minutter. Volumenet af opløsningen (i trin 4.5 - 4.8) afhænger af størrelsen af sektionen. Brug 50 ul løsning for kondyl og 100 pi for lang knogle. Vask med PBST (PBS, der indeholder 0,1% Tween 20) tre gange.
- Forberede og anvende blokeringsopløsningen til hvert afsnit og inkuber dem i et fugtigt kammer i 1 time ved stuetemperatur.
- Inkuber afsnittene med primærantistofopløsning (kanin-anti-muse Runx2, eller kanin-anti-muse DMP1) ved 4 ° C natten over. Vask med PBS tre gange.
- Inkubér sektioner med sekundært antistof opløsning (gede-anti-kanin, Alexa Fluor 488) i 2 timer ved stuetemperatur. Vask med PBS tre gange.
- Tør vandet omkring sektionen og slip DAPI ind i cirklen for at dække det afsnit på diaset. Læg forsigtigt ned dækglasset.
5. Konfokal mikroskopi
- Capture fluorescerende celle billeder via et konfokalt mikroskop ved bølgelængder i området fra 488 um (grøn) til 561 um (rød). Tag flere stakkede billeder ved 200 Hz (dimensioner 1024 × 1024) 19 bruger 10X, 20X, og 63x objektiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytter direkte Transform i knogleceller (osteoblaster og osteocytter) i Mandibular condyl og Long Bone.
Aggrecan, en kritisk gen for chondrogenese hovedsageligt udtrykkes i tidlige og modne chondrocytter 18. Som følge heraf injektionen af tamoxifen på 2 uger gamle i Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato mus aktiveret røde tomat reporter i alle chondrocytter og deres datterceller. Den 2.3Col1a1-GFP linje gav anledning til en grøn-fluorescerende farve i collagen 1-udtrykkende knogleceller, specielt osteoblaster og præ-osteocytter. Den gule farve (rød kombineret med grøn) indikerede tilstedeværelsen af chondrocyt-afledte knogle celler, som udtrykte collagen 1-genet. I figur 2A, de fleste af knogleceller i kondylære proces under brusken var røde eller yellow (en rød celle, der var begyndt at udskille grøn-fluorescerende COL1A1 og derved optræder gul, når de to fluorophorer blev overlejret). Disse resultater har klart dokumenteret, at disse knogleceller blev afledt af chondrocytter. Lignende resultater blev også observeret under lang knogle udvikling, hvor størstedelen af knogleceller blev afledt fra chondrocytter i både epifysen (figur 2B) og metafyse (figur 2C).
For yderligere at undersøge disse resultater, vi krydsede Col10al-Cre mus med Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP-mus. Col10a1 er en meget specifik markør for HCS, kun udtrykkes i HCS og deres efterkommere. Desuden Col10a1-Cre er ikke-inducerbar, som afspejler celledifferentiering fra begyndelsen af Col10a1 ekspression (ved E14.5). I trabekler nær brusk og knogle (superior niveau) 3-uger gamle mus, rød og sogle gule fluorescerende celler var fremherskende, mens de grønne fluorescerende celler var knappe. I en lidt mere ringere område (midterste niveau), at størstedelen af cellerne var fluorescerende gul, med lidt færre fluorescerende rød. Grønne fluorescerende celler syntes at dominere kun i det mest ringere område af kondyl proces (ringere niveau) (figur 3) .Dette tendens viser, at kondylær vækst hovedsagelig er bidraget til af transformerede knogleceller fra HC'er. Fordelingen af de røde og grønne fluorescerende celler i kondylære proces er også i overensstemmelse med ringere-til-overlegen retning kondylære vækst.
Den cellelinie sporing teknik viser klart, at apoptose er ikke den eneste skæbne for HCS. Både AGG-Cre ERT2 og Col10a1-Cre linjer angiver, at chondrocyt-afledte knogleceller er den største kilde til knogleudvikling i kondylære proces og i epifysenog metafyse i lange knogler.
Co-anvendelse af immunfluorescensfarvning og Cell Lineage Sporing Aktiverer Sporing af Cell Differentiering.
Den cellelinie sporing teknik kan også kombineres med fluorescerende immunohistokemi til bestemmelse af celletype ved påvisning af en cellespecifik markør. Denne fremgangsmåde har flere fordele for studiet af cellens skæbne. For det første kan forskeren stadig definere celle-egenskaberne ved at vælge egnede markører, selv uden den specifikke GFP mus linje, der udvider programmet for cellen afstamning sporing teknik. For det andet forenkler genereringen af sammensatte mus. For eksempel, vi behøver kun at generere Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato sammensatte mus til at producere den røde farve efter aktivering Cre (ved postnatal dag 3), i stedet for at skabe Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato mus, der kræver flere kors.
I denne undersøgelse valgte vi to antistoffer til immunfluorescensfarvning. Den ene var mod Runx2, en kritisk transkriptionel faktor under osteoblast modning (tidlige fase af osteogene celler); den anden var mod DMP1, udtrykt i modne osteocytter (sent tidspunkt i osteogene celler). I figur 4 den grønne fluorescens repræsenterer Runx2 eller DMP1 antistofekspression i 2 uger gamle kondylære proces. I figur 4A, tre typer af farvede celler i den subchondrale knogle er til stede. Den gule farve (overlejring af rød og grøn fluorescens) i kernen repræsenterer chondrocyt-afledte knogle celler, der udtrykker Runx2, hvilket indikerer, at disse celler var umodne osteoblaster på knogleoverfladen. Desuden var der rød-fluorescerende knogle celler, som ikke udtrykker Runx2 (rød fluorescence uden overlejret grøn). Disse celler repræsenterer modne chondrocyt-afledte knogleceller i knoglematrix. De mindst almindelige celler var dem med kun grøn-fluorescerende kerner, hvilket indikerer ikke-chondrocyt-afledte knogleceller med Runx2 udtryk eller en transformation, der fandt sted før Cre aktivering. Billedet viser, at de røde knogleceller og dem med gule kerner var de fleste cellepopulationer bidrager til kondylære subchondral knogledannelse.
På den anden side, næsten hver rød, chondrocyt-afledte knogle celle i knoglematrixen havde DMP1 farvning omkring deres cellelegemer. Få osteocyter var positive for DMP1 men manglede røde cellelegemer (figur 4B). Der er også to mulige forklaringer på disse celler: enten de er ikke-chondrocyt-afledte knogleceller, eller de er chondrocyt-afledte knogle celler, som er transformeret forud for tamoxifen injektion. Desuden er ingen røde knoglecellerpå overfladen af knoglen udtrykt DMP1, hvilket indikerer, at de ikke var modne osteocytter.
Tilsammen data fra udtrykket mønstre for både den tidlige (Runx2) og sen-fase markører (DMP1) af osteogene celler var i overensstemmelse med den tidligere udfald ved hjælp Cre kombineret med 2.3Col1a1-GFP. Disse data viser, at kombinationen af immunofluorescens og Rosa26 tdTomato sporing er en god måde at studere celle skæbne. Endnu vigtigere er, kan efterforskerne skelne celletype identificere differentiering scenen, og observere de transformerede celle numre samtidigt ved hjælp af immunofluorescens med forskellige markører, som giver flere oplysninger end Rosa26 tdTomato sporing alene.
Figur 1. Ordningen for Cell Lineage Sporing og the Generering af forbindelsen Mus. A) The Cre-loxP-systemet er almindeligt anvendt i afstamning sporing. Cre exciserer STOP-sekvensen mellem de to loxP-steder, og tdTomato protein (fluorescerende rød) er permanent udtrykt i den specifikke cellelinie. B) Tre dyremodeller er nævnt i dette dokument. Vi brugte 2,3 COL1A1-GFP; Rosa26 tdTomato mus og krydsede dem med Col10a1-Cre mus. Col10a1-Cre er ikke-inducerbar, som afspejler celledifferentiering fra begyndelsen af Col10a1 ekspression (ved E14.5). C) Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) er en anden Cre linje også krydset med 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato mus. Cre blev aktiveret ved 2 uger gamle ved en tamoxifen injektion (Tm: tamoxifen). D) For at kombinere immunofluorescens med celle afstamning opsporing, genereret vi Agg-Cre ERT2; <em> Rosa26 tdTomato mus, aktiveret Cre på postnatal dag 3, og udførte Runx2 og DMP1 immunofluorescens (Tm: tamoxifen). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Transformation fra Chondrocytter til knogleceller (osteoblaster og osteocytter) i Mandibular condyl og Long Bone Brug Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Sammensatte Mus. A) Cre blev aktiveret ved tamoxifen på postnatal dag 14, og musene blev aflivet efter 4 uger gamle. Der var tre farvede celler i kondylær proces: ren rød (chondrocyt-afledte knogleceller), gul (rød kombineret med grøn, hvilket indikerer chondrocyt-afledte knogle celler, som udtrykte collagen 1-genet), og ren grøn (ikke-chondrocyt afledt knogleceller med collagen 1-genet) . De fleste af knogleceller i kondylære proces under brusken var gul eller ren rød (hvide pile), medens nogle få knogleceller var grønt (blå pile). Disse data giver stærke beviser for, at chondrocytter direkte forvandle knogleceller og bidrager til dannelsen af kondylær proces under udvikling (Tm: tamoxifen; C: brusk; B: knogler). B, C) De fleste af knogleceller i epifysen og metafyse blev chondrocytter afledt (hvid pil: chondrocyt-transformerede knogleceller i gul eller ren rød, blå pil: ikke-chondrocyt-afledte knogleceller i ren grøn, AC: artikulær brusk; GP: vækst plade).blank "> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Transformation fra Chondrocytter til knogleceller i Mandibular kondyl Brug Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Sammensatte Mus. A) I kondylære processen fra 3 uger gamle mus, grønne knogleceller var en tydelig mindretal i bjælkerne nær brusk og knogle (superior niveau, a1), mens rød og nogle gule celler var fremherskende. I den midterste niveau (a2), gule celler var i flertal, med lidt færre røde blodlegemer. Grønne celler syntes at være i de fleste kun i den mest ringere område (a3). Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Co-lokalisering af to markører for osteogene Celler med Lineage-sporing Baggrund i kondylære Process Brug 2 uger gamle Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Sammensatte mus. A) Den gule farve i kerner betegner chondrocyt-afledte knogle celler, der udtrykker Runx2 (hvide pile) på overfladen af det trabekulære knogle under kondyl brusk. De rene røde knogleceller uden Runx2 ekspression repræsenterer modne chondrocyt-afledte knogleceller i knoglematrixen (gule pile). Den fewest celler var dem, som udelukkende transporterer grønne kerner, der repræsenterer enten ikke-chondrocyt-afledte knogle celler eller transformerede knogle celler fra chondrocytter før Cre aktivering (Tm: tamoxifen). B) I knogletrabecula under kondyl brusk, næsten hver rød chondrocyt-afledte knogle celle i knoglen matrix gennemført DMP1 farvning omkring deres celle organer (hvide pile). Kun nogle få af de osteocytter var positive for DMP1 men manglede røde farve i deres cellelegemer (gule pile). Der er to muligheder for disse celler: ikke-chondrocyt-afledte knogleceller eller chondrocyt-afledte knogleceller opstået før tamoxifen injektion. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grund af teknologiske begrænsninger, er det altid vanskeligt at undersøge opførslen af celler in vivo. Imidlertid er cellelinie opsporing teknik viser sig at være et effektivt værktøj til at studere cellebiologi 7-9. I denne undersøgelse, vi yderligere forbedre denne protokol ved at kombinere det med immunofluorescens. På denne måde kan celleskæbne defineres af flere beslægtede markører, som udvider anvendelsen af afstamning sporing. Desuden dette samarbejde lokalisering af immunfluorescens og tomat signal viser samtidig antallet af afkom af grundlæggeren celle, deres placering og deres differentiering status, som giver mere information end celle afstamning sporing alene. Derudover kan brugen af cellespecifikke markører forenkle dannelsen af sammensatte mus, fremskynde undersøgelsen.
Specificiteten af Cre er afgørende for entydig tildeling af afstamning og nøjagtigheden af resultaterne 20,21. Det er meget imtigt at vælge de relevante Cre linjer for at kontrollere cellens skæbne. I denne undersøgelse valgte vi Col10a1, fordi det betragtes som en specifik markør for hypertrofe chondrocytter 10,11 og aggrecan, fordi det også er en velkendt markør for chondrocytter 18. Der er også gode Cre modeller, der anvendes på andre områder. Den Scleraxis-Cre (SCX-Cre) linje, for eksempel, er nyttigt i senen og ligament forskning siden scleraxis er en grundlæggende helix-loop-helix transcription faktor, der er en markør for senen og ligament cellelinje 22. En anden Cre kaldte DMP1-Cre er almindeligt anvendt i skeleton- og tand-relaterede undersøgelser, fordi DMP1 er stærkt udtrykt i odontoblasts og osteocyter 23,24.
Sammenlignet med ikke-inducerbare Cre-systemer, kan aktiveringen af inducerbare Cre begrænses rumligt og tidsligt 20. Dog bør visse begrænsninger tages i betragtning ved udformningen af forsøget og fortolkning af resultaterne afinducerbare Cre modeller. Først kan dosis af tamoxifen ændre effektiviteten af Cre-aktivering og antallet af mærkede celler. Lave doser vil mærke populationen af interesse på en klontæthed 25; høje doser kan mærke hele stamfader pool 7,26. Således skal dosis udvælges afhængig af formålet med forsøget. For det andet, tamoxifen har potentielle toksicitet, især i høje doser 27,28. Af denne grund er det bedre at reducere dosis for at undgå sent sigt aborter under injektionen under graviditet 29.
Afslutningsvis co-anvendelse af celle afstamning sporing teknikker og immunofluorescens er et kraftfuldt værktøj til at undersøge cellebiologi in vivo. I fremtiden kan forsger til samtidig udføre immunofluorescens med to forskellige antistoffer over tomat signal baggrund. Denne metode kan vise ekspressionsmønsteret for to markører i én sektion, hvilket gør det lettere for detinvestigator at sammenligne og analysere resultaterne. Desuden kan denne co-ansøgning forbedres yderligere ved in situ immunofluorescens at mindske ikke-specifik farvning, der kan eksistere gennem konventionel immunofluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M.
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P.
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al.
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
