Summary
Vi utviklet to sett med sporing kombinasjoner i Rosa26 tdtomato (overalt uttrykt i alle celler) / Cre (spesielt uttrykt i chondrocytes) mus: en med 2.3Col1a1-GFP (spesifikke for osteoblaster) og ett med immunfluorescens (spesifikke for beinceller). Dataene viser den direkte transformasjon av kondrocytter inn i beinceller.
Abstract
Cellen avstamning tracing system har vært brukt hovedsakelig i utviklingsbiologi studier. Bruken av Cre rekombinase gjør det mulig for aktivering av reporter i en spesifikk cellelinje og alt avkom. Her brukte vi cellen avstamning tracing teknikk for å vise at chondrocytes direkte forvandle seg til osteoblaster og osteocytter under lange bein og kjeve knokkelen utvikling ved hjelp av to typer Cre, Col10a1-Cre og aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), krysset med Rosa26 tdTomato. Både Col10 og aggrecan er godt anerkjent markører for chondrocytes.
På bakgrunn av dette, har vi utviklet en ny metode-celle avstamning sporing i forbindelse med fluorescerende immunhistokjemi å definere celle skjebne ved å analysere uttrykket av spesifikke cellemarkører. Runx2 (en markør for tidlig stadium osteogene celler) og Dentin matrise protein1 (DMP1, en markør for sent stadium osteogene celler) varanvendes for å identifisere kondrocytt-avledede beinceller og deres differensiering status. Denne kombinasjonen er ikke bare utvider anvendelsen av cellen avstamning tracing, men forenkler også generering av sammensatte mus. Enda viktigere er de nummer, beliggenhet, og differensierings statusene foreldrecellen avkom vises samtidig, noe som gir mer informasjon enn celle avstamning sporing alene. I konklusjonen, co-anvendelse av cellen avstamning sporing teknikker og immunfluorescens er et kraftig verktøy for å undersøke cellebiologi in vivo.
Introduction
Under utviklingen utgjør endochondral bendannelse for over 80% av skjelettvolum. Det er en utbredt oppfatning at det begynner med apoptose av hypertrofiske chondrocytes. Deretter ble cellene fra den underliggende benmarg invadere og sette i gang angiogenese, etterfulgt av nytt ben avsetning av ben marrow- og periosteum-avledede celler 1,2. Cellen skjebne hypertrofiske chondrocytes (HC'er), derimot, har vært et problem for debatt i flere tiår 3. Til å begynne med ble HC'er ansett for å være den ende av kondrocytt differensiering vei, og apoptose ble generelt antatt å være den endelige skjebnen til HC'er. Nå, noen forskere antyder at i det minste noen HC'er kunne overleve og bidra til endochondral beindannelse. Selv om de foreslås at veksten plate chondrocytter hadde evnen til å transdifferentiate inn i osteoblaster basert på ultrastruktur, immunhistokjemisk farging, og in vitro studier 46 Ingen av disse metodene were definitive demonstrere chondrocyttransplantasjon bidrag til osteoblast avstamning.
Cellen avstamning tracing teknikk gir en mer grundig måte å studere celle skjebne. I korthet sett, en rekombinase enzym, som bare uttrykkes i et bestemt type celler, stimulerer ekspresjonen av reportergenet. På denne måten blir denne type celle og deres etterkommere permanent merket 7. Den Cre-loxP system er vanligvis brukes i avstamning sporing. Cre (den recombinase enzym) vil eksisere STOP sekvens mellom de to loxP-seter og aktivere reporter i en bestemt cellelinje (figur 1A). I noen tilfeller kan undersøkeren velge et gunstig tidspunkt for å aktivere Cre ved hjelp av et stoff, slik som tamoxifen, forårsaker Cre til å smelte til en modifisert form av østrogenreseptoren (Cre ERT2) 8. Fluorescent journalister har blitt standard i avstamning tracing eksperimenter fordi de dramatisk redusere kompleksitetenog forbedre nøyaktigheten og effektiviteten av celle skjebne sporing 8,9. tdTomato blir det beste valget blant fluorescerende reportere siden det har den lyseste fluorescerende protein og den sterkeste epifluorescence, noe som gjør det enkelt visualisert 7 (figur 1A).
Ved hjelp av Rosa26 tdTomato avstamning sporing system, har vår gruppe og andre forskere vist at HC'er kan endre sin fenotype til beinceller under utvikling 10-14. For å oppnå dette, har vi utviklet to sett med tracing kombinasjoner med Rosa26 tdtomato (allestedsnærværende ekspresjon i alle celler) / Cre (spesifikk til kondrocytter) mus: 2.3Col1a1-GFP (spesifikk til osteoblaster) og immunfluorescens (spesifikk til benceller). Dataene viser at begge metoder er levedyktige måter å studere celle skjebne in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle protokoller ble gjennomgått og godkjent av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) ved Texas A & M University College of Dentistry.
1. husdyravl
- Bruk tre dyremodeller i denne studien. For å undersøke skjebnen til embryonale chondrocytes i knokkelen formasjon, første gangs bruk Col10a1-Cre 15 mus og krysse dem med Rosa26 tdTomato (B6, 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) mus for å få Col10a1- Grobunn og Rosa26 tdTomato mus. Deretter krysse disse musene med 2.3Col1a1-GFP mus 16. Bruk Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP mus til å utføre celle avstamning tracing eksperimenter (Figur 1b).
- For å studere skjebnen til postnatal chondrocytes, følger du samme fremgangsmåte som i trinn 1.1, men bruker aggrecan-ere ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 linje og holde Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP mus til å utføre celle avstamning tracing eksperimenter (figur 1C). Injisere tamoxifen på postnatal dag 14.
- Å kombinere cellen avstamning tracing teknikk med immunfluorescens, krysser Agg-Cre ERT2 mus og Rosa26 tdTomato mus. Bruk mus som bærer både gener i forsøket og injisere de tamoxifen på postnatal dag 3 (figur 1D).
2. Materiale Forberedelse
- Oppløs tamoxifen pulver i 10% etanol og 90% maisolje ved en konsentrasjon på 10 mg / ml. Doseringen for injeksjon er 75 mg / kg.
- Oppløs paraformaldehyd (PFA) pulver i PBS til en konsentrasjon på 4%, under anvendelse av 2 M natrium-hydrat for å justere pH-verdien til 7,4. Bruk 4% PFA løsning for å fikse vevet (underkjevens knokkelen og bakben er brukt her) etter avliving. På grunn av sintoksisitet, håndtere PFA i hetten med hansker og ansiktsmaske.
- Oppløs EDTA pulver i destillert vann til en konsentrasjon på 10%, ved å anvende 2 M natrium-hydrat for å justere pH-verdien til 7,4. Bruk 10% EDTA For å fjerne kjeve knokkelen og bakben.
- Oppløs sukrose pulver i PBS ved konsentrasjoner på 15% og 30%. Bruk sukroseløsning å tørke vev etter avkalking.
- Oppløs hyaluronidase pulveret i PBS ved en konsentrasjon på 2 mg / ml, pH 5,0. Denne løsningen er for immunofluorescens antigen gjenfinning.
- Bruke et 1,5 ml rør for å fremstille en blokkerende oppløsning som inneholder 3% bovint serumalbumin (BSA) og 20% geiteserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunofluorescerende farging.
- Bruke et 1,5 ml rør for å fremstille en primær antistoffoppløsning som inneholder 2% geiteserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunofluorescerende farging. Konsentrasjonen av det primære antistoff er 1: 400 for Runx2 og 1: 100 for DMP1.
- Bruke et 1,5 ml rør for å fremstillekanin IgG-oppløsning som kontroll for immunofluorescerende farging for å unngå falske positive resultater. Oppløsningen inneholder 2% geiteserum i PBS. Konsentrasjonen av kanin IgG for Runx2 kontroll er 1: 400; for DMP1, 1: 100. Utfør eksperimentet og kontroll flekker samtidig.
- Bruke et 1,5 ml rør for å fremstille et sekundært antistoff oppløsning som inneholder 2% geiteserum i PBS i Runx2 eller DMP1 immunofluorescerende farging. Bruk det sekundære antistoff ved en fortynning på 1: 500.
3. Skyv Forberedelse til konfokalmikroskopi (Cell Lineage Følge Only, ingen kombinasjon med immunfluorescens)
- Sprøyt tamoxifen i Agg-ere ERT2 mus på et gunstig tidspunkt.
- Først fjerne en mus fra buret sitt. Deretter bruker venstre tommel og pekefinger for å ta tak i huden på baksiden av musen og snu det, utsette magen. Bruk høyre hånd til å holde sprøyten. Den optimale inngangspunkt for injeksjon er på left eller høyre side av hypogastrium, unngå leveren og blære.
- Oppbevar sprøyten parallelt med bakbena på musen og injisere intraperitonealt. Doseringen for injeksjon er 75 mg / kg. Vekten av musene på alderen 2 uker, 3 uker og 4 uker gamle er ca 7-9 g, 11-13 g, og 16 - 18 g, henholdsvis.
- Anesthetize mus med en Xylazine / Ketaset kombinasjon.
- For å fremstille arbeidsoppløsningen, først fortynne xylazin og Ketaset med destillert vann til en konsentrasjon på 1 mg / ml og 5 mg / ml, respektivt. Deretter blande xylazine og Ketaset i et 1: 2 forhold. Doseringen for injeksjon er 30 mL / g.
- Injiser som i trinn 3.1. Bekreft anesthetization ved å knipe musens ankelen. Musen er bevisstløs hvis den ikke har noen reaksjon.
- Perfuse musene med 4% PFA etter bedøvelsen.
- Etter musen mister bevisstheten, fikse de fire bena på musen på et bord for å entirely eksponere magen.
- Mette magen med 70% etanol og foreta en beskjæring fra nedre del av magen til halsen langs midtlinjen. Klemme og samtidig trekke huden til tverrsidene for å avsløre bukhinnen. Bruk disseksjon saks for å lage en langsgående excision.
- Klipp av og fjerne de fremre ribbeina å avsløre hjertet. Punkter hjertet fra venstre hjertekammer med en 22 G sprøyte, hold sprøyten, og samtidig kutte et spor i riktig atriet.
- Sakte injisere 4% PFA, som er dynket langs kardiovaskulære systemet mens blod spyler ut av kuttet fra høyre atriet. Volumet av PFA for perfusjon er 1 ml / gram. Utfør dette trinnet i en klasse I biosikkerhet kabinett som er hard-kanal til bygningen eksosanlegget.
- Trekk av musens hud og sette hele kroppen til en 50-ml polypropylen sentrifugerør som inneholder 40 ml av 4% PFA å feste over natten ved 4 ° C.
- Bruk disseksjon saks og # 3 og # 5 pinsett for å forsiktig fjerne kjeven og bakben fra kroppen og å fjerne muskler og sener på overflaten. Utfør dette trinnet i en klasse I biosikkerhet kabinett som er hard-kanal til bygningen eksosanlegget.
- Skjær kjeven i to deler i den distale delen av den tredje molar. På tilsvarende måte, klippet femur og tibia i midshaft for å eksponere hulrommet benmargen for å akselerere avkalking. Sette den delen som omfatter knokkelen og condylar prosess og sammen med bakbenet inn i 40 ml 10% EDTA For å fjerne ved 4 ° C i 2 - 4 dager i en 50-ml polypropylen sentrifugerør.
- Bruk 50 ml 15% sukrose for å tørke knokkelen og bakben over natten ved 4 ° C i et 50 ml polypropylen sentrifugerør.
- Bruke 30% sukrose for å tørke knokkelen og bakben over natten ved 4 ° C i et 50 ml polypropylen sentrifugerør.
- Langs sagittal plan, legge prøven medOktober på skjæreplaten i cryosection maskinen.
- Horisontalt legge knokkelen eller bakben i monterings mold. Senk vevet i oktober og la den i cryosection maskinen før oktober fryser.
- Monter oktober blokken på kutteplaten. Vent i ca. 15 minutter før skjæring for å sikre at oktober er fullstendig frosset.
- Skjær knokkelen og bakben i 10-mikrometer seksjoner. Samle avsnittene om lysbilder og oppbevar ved -20 ° C.
- Inkuber objektglasset i et 37 ° C kammeret for å fjerne vannet før farging.
- Vask objektglassene to ganger med destillert vann i 5 minutter.
- Tørk av vannet rundt hver del. Bruk en hydrofob barriere penn til sirkel seksjonene og slippe DAPI eller ikke-fluorescerende anti-fade monteringsløsning inn i sirkelen. Nøye legge ned dekkglass.
4. Immunhistokjemisk farging for Runx2 og DMP1
MERK: IgG control er nødvendig for immunhistokjemisk farging for å unngå falske positive signaler. Den farging for de eksperimentelle og kontrollgrupper må utføres samtidig.
- Inkuber glir i en 37 ° C kammeret for å fjerne vannet før farging.
- Vask objektglassene to ganger med destillert vann.
- Bruk hydrofobe barriere pennen til sirkel alle seksjonene på lysbildet. Fra dette trinnet, legge all den ferdige løsningen inn i sirkelen for å fullstendig dekke deler.
- Behandle seksjonene med hyaluronidase i et fuktighetskammer ved 37 ° C i 30 minutter. Volumet av oppløsningen (i trinn 4,5 - 4,8) avhenger av størrelsen av seksjonen. Bruk 50 mL av løsning for knokkelen og 100 ul i det lange bein. Vask med PBST (PBS som inneholder 0,1% Tween 20) tre ganger.
- Fremstille og anvende den blokkerende løsning til hver seksjon og inkuber dem i et fuktig kammer i 1 time ved romtemperatur.
- Inkuber seksjoner med primærantistoffoppløsning (kanin-anti-mus Runx2, eller kanin-anti-mus DMP1) ved 4 ° C over natten. Vask med PBS tre ganger.
- Inkuber seksjoner med sekundært antistoff løsning (geite-anti-kanin, Alexa Fluor 488) i 2 timer ved romtemperatur. Vask med PBS tre ganger.
- Tørk av vannet rundt delen og slippe DAPI inn i sirkelen for å dekke delen på lysbildet. Nøye legge ned dekkglass.
5. konfokalmikroskopi
- Capture fluorescerende celle bilder med en konfokalmikroskop på bølgelengder som varierer fra 488 nm (grønn) til 561 nm (rød). Ta flere stablede bilder ved 200 Hz (dimensjoner på 1024 × 1024) 19 bruker 10X, 20X og 63x objektiver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytes Direkte Transform til beinceller (osteoblaster og osteocytter) i Mandibular knokkelen og lange ben.
Aggrecan, en kritisk genet for chondrogenesis, er hovedsakelig uttrykt i tidlige og modne chondrocytes 18. Som et resultat av injeksjon av tamoxifen på 2 uker gamle i Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato mus aktivert røde tomat reporter i alle chondrocytes og deres datterceller. Den 2.3Col1a1-GFP linjen ga opphav til en grønn-fluorescerende farge i kollagen 1-uttrykke beinceller, spesielt osteoblaster og pre-osteocytter. Den gule farge (rød kombinert med grønn) indikerte tilstedeværelse av kondrocytt-avledede benceller som uttrykte kollagen 1-genet. I figur 2A er de fleste av beinceller i condylar prosessen under brusken var røde eller yEllow (en rød celle som hadde begynt å utskille grønn-fluorescerende Col1a1, og dermed vises gul når de to fluorophores ble overlagret). Disse resultatene ga sterke bevis for at disse bein celler ble avledet fra kondrocytter. Lignende resultater ble også observert under lange bein utvikling, der flertallet av bein celler ble avledet fra chondrocytes i både epifysen (figur 2B) og metafysært (figur 2C).
For ytterligere å undersøke disse resultatene, krysset vi Col10al-Cre mus med Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP mus. Col10a1 er en svært spesifikk markør for HC'er, uttrykkes bare i HC'er og deres etterkommere. Videre er Col10a1-Cre ikke-induserbar, noe som gjenspeiler celledifferensiering fra begynnelsen av Col10a1 uttrykket (ved E14.5). I trabeculae nær brusk-ben-grensesnitt (overordnet nivå) av 3 uker gamle mus, rød og some gule fluorescerende celler var dominerende, mens grønne fluorescerende celler var knappe. I en litt mer dårligere område (midtre nivå), de fleste av cellene var fluorescerende gul, med litt færre fluorescerende rødt. Grønne fluorescerende celler så ut til å dominere bare i de mest dårligere området av condylar prosessen (dårligere nivå) (figur 3) .Denne trend indikerer at condylar vekst er mest bidratt til av transformerte celler fra bein HC'er. Fordelingen av de røde og grønne fluorescerende celler i condylar prosessen er også i overensstemmelse med den dårligere-til-overlegne retning condylar vekst.
Cellen avstamning oppsporing teknikk viser klart at apoptose er ikke den eneste skjebne for HC'er. Både Agg-Cre ERT2 og Col10a1-Cre linjer indikerer at chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller er den viktigste kilden for bein utvikling i condylar prosessen og i epifysenog metafyse i lange ben.
Samtidig bruk av Immunofluorescent Farging og Cell Lineage Tracing Aktiverer sporing av celledifferensiering.
Cellen avstamning tracing teknikk kan også kombineres med fluorescerende immunhistokjemi for å bestemme den celletype ved påvisning av en celle-spesifikk markør. Denne fremgangsmåte har flere fordeler for studiet av cellen skjebne. Først kan forskeren fortsatt definere celleegenskaper ved å velge hensiktsmessige markører, selv uten spesifikk GFP mus linje, som utvider bruksområdet for cellen avstamning tracing teknikk. For det andre, forenkler det generering av sammensatte mus. For eksempel må vi bare å generere Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato sammensatte mus for å produsere den røde fargen etter aktivering Cre (ved postnatal dag 3), i stedet for å skape Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato mus, noe som krever flere kors.
I denne studien, valgte vi to antistoffer for immunofluorescerende farging. En var mot Runx2, en kritisk faktor under transkripsjonen osteoblast modning (tidlig stadium av osteogene celler); den andre var mot DMP1, uttrykt i modne osteocytter (sent stadium av osteogene celler). På figur 4 representerer den grønne fluorescens den Runx2 eller DMP1 antistoff ekspresjon i 2-ukers-gamle condylar prosess. I figur 4A, tre typer av fargede celler i det subkondrale ben er til stede. Den gule farge (overlagring av rød og grønn fluorescens) i kjernen representerer de kondrocytt-avledede beinceller som uttrykker Runx2, noe som indikerer at disse cellene var umodne osteoblaster på benoverflaten. I tillegg var det rød-fluorescerende beinceller som ikke uttrykker Runx2 (red fluorescence uten lagret grønn). Disse cellene representerer modne kondrocytt-avledet benceller i benmatriks. De minst vanlige celler var de med bare grønne-fluorescerende kjerner, noe som indikerer ikke-chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller med Runx2 uttrykk eller en forvandling som skjedde før Cre aktivering. Bildet antyder at de røde beinceller og de med gule kjerner var de fleste cellepopulasjoner som bidrar til condylar subchondrale beindannelse.
På den annen side, nesten hver rød, kondrocytt-avledede ben celle i benmatriks hadde DMP1 farving rundt sine cellelegemer. Få osteocytter var positive for DMP1 men manglet røde cellelegemer (figur 4B). Det finnes også to mulige forklaringer på disse cellene: enten de er ikke-kondrocytt-avledede benceller, eller de er kondrocytt-avledede benceller som forvandlet forut for tamoxifen injeksjon. I tillegg, ingen røde beincellerpå overflaten av benet uttrykt DMP1, noe som indikerer at de ikke var modne osteocytter.
Til sammen dataene fra de uttrykk mønstre for både tidlig- (Runx2) og sene stadier av markører (DMP1) av osteogene celler var i overensstemmelse med den forrige utfallet hjelp Cre kombinert med 2.3Col1a1-GFP. Disse dataene viser at kombinasjonen av immunfluorescens og Rosa26 tdTomato sporing er en god måte å studere celle skjebne. Enda viktigere, kan etterforskerne skille celletype, identifisere differensiering scenen, og observere de transformerte celletallene samtidig ved hjelp av immunfluorescens med ulike markører, som gir mer informasjon enn Rosa26 tdTomato sporing alene.
Figur 1. Mekanisme for Cell Lineage Sporing og the Generering av det sammensatte Mus. A) Den Cre-loxP-systemet er vanligvis brukes i avstamning tracing. Cre excises STOP sekvensen mellom de to loxP-seter, og tdTomato protein (fluorescerende rød) er permanent uttrykt i den spesifikke cellelinje. B) Tre dyremodeller er nevnt i denne artikkelen. Vi brukte 2,3 Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato mus og krysset dem med Col10a1-Cre mus. Col10a1-Cre er ikke-induserbar, noe som gjenspeiler den celledifferensiering helt fra begynnelsen av Col10a1 uttrykk (ved E14.5). C) aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) er en annen Cre linje også krysset med 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato mus. Cre ble aktivert ved 2 ukers alder ved en tamoxifen injeksjon (Tm: tamoxifen). D) For å kombinere immunfluorescens med cellen avstamning tracing, genererte vi Agg-Cre ERT2; <em> Rosa26 tdTomato mus, aktiveres Cre ved postnatal dag tre, og utførte Runx2 og DMP1 immunfluorescens (Tm: tamoxifen). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Transformasjon fra Chondrocytter til beinceller (osteoblaster og osteocytter) i Mandibular knokkelen og Long Bone Bruke Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Sammensatte mus. A) Cre ble aktivert ved tamoxifen på postnatal dag 14, og musene ble avlivet ved 4 uker gammel. Det var tre fargede celler i condylar prosessen: ren rød (chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller), gul (rød kombinert med grønt, som indikerer chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller som uttrykte kollagen 1 genet), og ren grønn (ikke-chondrocyttransplantasjon avledet beinceller med kollagen 1 genet) . De fleste av beinceller i condylar prosessen under brusken var gul eller ren rød (hvite piler), mens noen beinceller var grønne (blå piler). Disse dataene gir et sterkt bevis på at chondrocytter direkte transformere inn i beinceller og bidrar til dannelsen av den condylar prosess under utvikling (Tm: tamoxifen; C: brusk; B: ben). B, C) Majoriteten av benceller i epifysen og metafyse ble kondrocytt-avledede (hvit pil: kondrocytt-transform benceller i gult eller ren rød, blå pil: ikke-kondrocytt-avledet benceller i ren grønn, AC: artikulære brusk, GP: vekst plate).blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Transformasjon fra Chondrocytter til beinceller i Mandibular knokkelen Bruke Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Sammensatte mus. A) I condylar prosessen fra tre uker gamle mus, grønne beinceller var en tydelig mindretall i trabeklene nær brusk-ben-grensesnitt (overordnet nivå, a1), mens røde og noen gule celler var dominerende. I midten nivå (a2), gule celler var i flertall, med litt færre røde blodceller. Grønne celler så ut til å være i det meste bare i de mest dårligere området (a3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. samlokalisering av to Markører til osteogene celler med Lineage-tracing Bakgrunn i Condylar prosessen ved hjelp av to uker gammel Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Sammensatte Mus. A) Den gule fargen i kjernen utgjør kondrocytt-avledede beinceller som uttrykker Runx2 (hvite piler) på overflaten av det trabeklære benet under brusken knokkelen. De rene røde beinceller uten Runx2 uttrykk representerer modne chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller i beinmassen (gule piler). den Fewest celler var de bærer bare grønne kjerner, som representerer enten ikke-chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller eller transformbeinceller fra chondrocytes før Cre aktivering (Tm: tamoxifen). B) I det trabeklære benet under brusken knokkelen, nesten hver rød kondrocytt-avledet ben celle i benmatriks båret DMP1 farving rundt sine cellelegemer (hvite piler). Bare et fåtall av de osteocytter var positive for DMP1 men manglet rød farge i sine cellelegemer (gule piler). Det er to muligheter for disse cellene: non-chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller eller chondrocyttransplantasjon-avledet beinceller som oppstår før tamoxifen injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
På grunn av teknologiske begrensninger, er det alltid vanskelig å undersøke oppførselen til celler in vivo. Imidlertid blir celle avstamning tracing teknikk vist seg å være et kraftig verktøy for å studere cellebiologi 7-9. I denne studien har vi ytterligere forbedre denne protokollen ved å kombinere den med immunfluorescens. På denne måte kan celle skjebne defineres av flere beslektede markører, som utvider anvendelsen av avstamning sporing. Videre viser denne samlokalisering av immunfluorescens og tomat signal samtidig antall avkom av grunnleggeren cellen, deres plassering, og deres differensiering status, som gir mer informasjon enn celle avstamning sporing alene. I tillegg kan bruk av celle-spesifikke markører forenkle dannelsen av sammensatte mus, akselererende undersøkelse.
Spesifisitet av Cre er avgjørende for utvetydig tildeling av avstamning og nøyaktigheten av resultatene 20,21. Det er meget imtig å velge de riktige Cre linjer for å verifisere mobil skjebne. I denne studien valgte vi Col10a1, fordi det er ansett som en spesifikk markør for hypertrofiske chondrocytes 10,11 og aggrecan, fordi det er også et velkjent merke for chondrocytes 18. Det er også gode Cre modeller som brukes i andre felt. Den Scleraxis-Cre (SCX-Cre) linje, for eksempel, er nyttige i sener og ligament forskning siden scleraxis er et grunnleggende helix-loop-helix transkripsjonsfaktor som er en markør for den sene og ligament celle avstamning 22. En annen Cre kalt DMP1-Cre er vanligvis brukes i skeleton- og tannrelaterte studier fordi DMP1 er sterkt uttrykt i odontoblaster og osteocytter 23,24.
Sammenlignet med ikke-induserbare Cre systemer, kan aktivering av induserbare Cre begrenses romlig og tidsmessig 20. Imidlertid bør enkelte begrensninger tas i betraktning ved utformingen av eksperimentet og tolke resultatene avinduserbare Cre modeller. For det første kan dosen av tamoksifen forandre effektiviteten av Cre aktivering og antall merkede celler. Lave doser vil merke bestanden av interesse på en klonal tetthet 25; høye doser kan merke hele stamcellepoolen 7,26. Således må dosen velges avhengig av formålet av forsøket. For det andre har tamoxifen potensielle toksisitet, spesielt i høye doser 27,28. Av denne grunn er det bedre å redusere dosen for å unngå senaborter ved injisering under svangerskapet 29.
I konklusjonen, co-anvendelse av cellen avstamning sporing teknikker og immunfluorescens er et kraftig verktøy for å undersøke cellebiologi in vivo. I fremtiden kan etterforskere forsøke å samtidig utføre immunfluorescens med to forskjellige antistoffer over tomat signal bakgrunnen. Denne metoden kan vise uttrykket mønster for to markører i én del, noe som gjør det lettere foretterforsker for å sammenligne og analysere resultatene. Videre kan dette ko-søknad ytterligere forbedres ved in situ immunofluorescens for å redusere ikke-spesifikk farging som kan forekomme gjennom konvensjonelle immunfluorescens.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M.
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P.
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al.
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
