Summary
Nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações em Rosa26 tdtomato (ubiquamente expressa em todas as células) / Cre (especificamente expresso em condrócitos) camundongos: um com 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e um com imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram a transformação directa de condrócitos em células ósseas.
Abstract
O sistema de rastreamento de linhagem celular foi usado predominantemente em estudos de biologia do desenvolvimento. A utilização da recombinase Cre permite a activação do repórter em uma linha celular específica e toda a progénie. Aqui, utilizou-se a linhagem de células rastreio técnica para demonstrar que os condrócitos transformar directamente em osteoblastos e os osteócitos durante ossos longos e desenvolvimento côndilo mandibular utilizando dois tipos de Cre, Col10a1-Cre e agrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzados com Rosa26 tdTomato. Ambos Col10 e agrecano marcadores são bem reconhecido para condrócitos.
Nesta base, nós desenvolvemos uma nova linhagem de células método de rastreio em conjunto com o destino celular imuno-fluorescente para definir por meio da análise da expressão de marcadores de células específicos. Runx2 (um marcador de células osteogênicas em início de carreira) e protein1 matriz de dentina (DMP1; um marcador para células em estágio final osteogênicos) foramutilizado para identificar as células de osso derivadas de condrócitos e o seu estado de diferenciação. Esta combinação não só amplia a aplicação de rastreio linhagem celular, mas também simplifica a geração de ratinhos compostos. Mais importante, os status de número, a localização e diferenciação de progênie de células-mãe são exibidos simultaneamente, fornecendo mais informações do que a linhagem celular de rastreamento sozinho. Em conclusão, a co-aplicação de técnicas de rastreio de linhagem celular e de imunofluorescência é uma ferramenta poderosa para investigar a biologia de células in vivo.
Introduction
Durante o desenvolvimento, a formação de osso endocondral responde por mais de 80% do volume do esqueleto. Acredita-se que começa com a apoptose de condrócitos hipertróf icos. Subsequentemente, as células da medula óssea subjacente invadir e iniciar angiogénese, seguido por nova deposição óssea por marrow- óssea e células derivadas de periósteo 1,2. O destino de células de condrócitos hipertróficas (HCs), no entanto, tem sido um tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, foram consideradas HCs ser o final da via de diferenciação de condrócitos, e a apoptose foi geralmente considerado para ser o destino final de HCs. Agora, alguns investigadores sugerem que pelo menos alguns HCs poderia sobreviver e contribuir para a formação de osso endocondral. Embora eles proposto que o crescimento dos condrócitos placa tinha a capacidade de transdiferenciar em osteoblastos com base em ultra-estrutura, coloração imuno-histoquímica, e estudos in vitro, 46, nenhum destes métodos were definitiva em condrócitos demonstrando contribuição para a linhagem dos osteoblastos.
A técnica de linhagem celular de rastreamento fornece uma maneira mais rigorosa para estudar o destino celular. Resumidamente falando, uma enzima recombinase, o qual é expresso apenas em um tipo específico de célula, estimula a expressão do gene repórter. Desta forma, este tipo de célula e seus descendentes são permanentemente marcado 7. O sistema Cre-loxP é comumente usado no rastreamento de linhagem. Cre (a enzima recombinase) vai excisar a sequência de paragem entre os dois locais loxP e activar o repórter em uma linha celular específica (Figura 1A). Em alguns casos, o investigador pode escolher um ponto de tempo favorável para activar Cre usando uma droga, tal como tamoxifeno, causando Cre para fundir a uma forma modificada do receptor de estrogénio (Cre ERT2) 8. repórteres fluorescentes tornaram-se o padrão na linhagem rastreamento experimentos porque reduzem drasticamente a complexidadee melhorar a precisão e eficiência da célula destino traçado 8,9. tdTomato está se tornando a melhor escolha entre os repórteres fluorescentes uma vez que tem o mais brilhante proteína fluorescente ea epifluorescência mais forte, tornando-se facilmente visualizado 7 (Figura 1A).
Ao utilizar o Rosa26 tdTomato linhagem sistema de detecção, o nosso grupo e outros investigadores mostraram que HCs pode alterar o seu fenótipo em células ósseas durante o desenvolvimento 10-14. Para conseguir isso, nós desenvolvemos dois conjuntos de rastreamento combinações com Rosa26 tdtomato (expressão omnipresente em todas as células) / Cre (específico para condrócitos) ratos: 2.3Col1a1-GFP (específico para osteoblastos) e imunofluorescência (específico para células ósseas). Os dados demonstram que ambos os métodos são meios viáveis para estudar o destino celular in vivo.
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Protocol
Todos os protocolos foram revisados e aprovados pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC) da Texas A & M University College of Dentistry.
Reprodução 1. animal
- Use três modelos animais neste estudo. Para investigar o destino dos condrócitos embrionárias na formação côndilo, primeiro uso Col10a1-Cre 15 ratos e passe com Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) ratos para obter Col10a1- Cre e Rosa26 tdTomato ratinhos. Em seguida, atravessar esses camundongos com 2.3Col1a1-GFP ratos 16. Use Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1B).
- Para estudar o destino dos condrócitos pós-natal, siga o mesmo procedimento como no passo 1.1, mas usar o ERT2 agrecan-cre (Agg-Cre ERT2) 17,18 linha e manter a Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP para executar as experiências de rastreio linhagem celular (Figura 1C). Injectar tamoxifeno no dia pós-natal 14.
- Para combinar a linhagem celular de rastreamento técnica com imunofluorescência, atravessar ratos Agg-Cre ERT2 e camundongos Rosa26 tdTomato. Use ratinhos que transportam ambos os genes na experiência e injectar as tamoxifeno no dia pós-natal 3 (Figura 1D).
2. Preparação de Material
- Dissolve-se o pó de tamoxifeno em 10% de etanol e óleo de milho a 90% a uma concentração de 10 mg / ml. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg.
- Dissolve-se o pó de paraformaldeído (PFA) em PBS a uma concentração de 4%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 4% de solução PFA para fixar o tecido (o côndilo mandibular e perna são usados aqui) após o sacrifício. Devido à suatoxicidade, lidar com PFA na capa com luvas e uma máscara.
- Dissolve-se o pó de EDTA em água destilada a uma concentração de 10%, com 2 M de hidrato de sódio para ajustar o valor do pH para 7,4. Use 10% EDTA a descalcificação do côndilo mandibular e perna.
- Dissolve-se o pó de sacarose em PBS a concentrações de 15% e 30%. Use a solução de sacarose para desidratar o tecido após descalcificação.
- Dissolve-se o pó de hialuronidase em PBS a uma concentração de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solução é para a recuperação de antigénio de imunofluorescência.
- Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de bloqueio que contém 3% de albumina de soro bovino (BSA) e soro de cabra a 20% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente.
- Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparar uma solução de anticorpo primário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. A concentração do anticorpo primário é de 1: 400 para Runx2 e 1: 100 para DMP1.
- Utilizar um tubo de 1,5 mL, para preparara solução de IgG de coelho como controlo para a coloração de imunofluorescência para evitar resultados positivos falsos. A solução contém soro de cabra a 2% em PBS. A concentração do IgG de coelho de controlo Runx2 é de 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar o experimento e controle coloração simultaneamente.
- Utilizar um tubo de 1,5 ml para preparar uma solução de anticorpo secundário que contém soro de cabra a 2% em PBS para a coloração ou Runx2 DMP1 imunofluorescente. Utilizar o anticorpo secundário com uma diluição de 1: 500.
3. Deslize Preparação para microscopia confocal (Lineage celular Rastreamento Apenas, nenhuma combinação com Imunofluorescência)
- Injectar tamoxifeno na-cre Agg ERT2 ratos em um ponto de tempo favorável.
- Em primeiro lugar, remover um mouse de sua gaiola. Em seguida, use o polegar eo dedo indicador esquerdo para agarrar a pele na parte de trás do rato e entregá-lo, expondo o abdômen. Use a mão direita para segurar a seringa. O ponto de entrada óptima para a injecção é a Left ou lado direito do hipogástrio, evitando o fígado e bexiga.
- Manter a seringa paralelo com as pernas traseiras do mouse e injectar por via intraperitoneal. A dosagem para injecção é de 75 mg / kg. Os pesos dos ratos nas idades de 2 semanas, 3 semanas e 4 semanas de idade são de aproximadamente 7-9 g, 11-13 g, e 16-18 g, respectivamente.
- Anestesiar os ratos com uma combinação Xilazina / Ketaset.
- Para preparar a solução de trabalho, em primeiro lugar diluir a xilazina e Ketaset com água destilada a uma concentração de 1 mg / ml e 5 mg / ml, respectivamente. Em seguida, misturar a xilazina e Ketaset em uma proporção de 1: 2. A dosagem para injecção é de 30 ul / g.
- Injectar como no passo 3.1. Confirmar a anestesia por beliscar o tornozelo do mouse. O mouse é inconsciente, se não tem reação.
- Perfundir os ratos com PFA 4% após anestesia.
- Após o mouse perde a consciência, corrigir as quatro pernas do mouse em uma placa de entirely expor o abdômen.
- Saturar o abdômen com etanol 70% e fazer uma excisão da parte inferior do abdómen para o pescoço ao longo da linha média. Comprima e, simultaneamente, puxa a pele para os lados laterais para revelar a membrana peritoneal. Use tesouras de dissecação para fazer uma excisão longitudinal.
- Cortar e remover as costelas frente para expor o coração. Perfurar o coração do ventrículo esquerdo com uma seringa G 22, segure a seringa, e, simultaneamente, cortar uma abertura na aurícula direita.
- Lentamente injetar a PFA 4%, o que é perfundido ao longo do sistema cardiovascular enquanto as ondas de sangue para fora do corte da aurícula direita. O volume do PFA para perfusão é de 1 ml / grama. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício.
- Retire a pele do rato e colocar todo o corpo para um tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contém 40 ml de 4% de PFA para fixar durante a noite a 4 ° C.
- Use tesouras de dissecação e # 3 e # 5 fórceps para remover cuidadosamente a mandíbula e perna traseira do corpo e para remover os músculos e tendões na superfície. Execute esta etapa em uma cabine de segurança biológica Classe I que é difícil-canalizado para o sistema de escape edifício.
- Cortar a mandíbula em duas peças na região distal do terceiro molar. Do mesmo modo, cortar o fémur e a tíbia, na parte média da diáfise os para expor a cavidade da medula óssea, a fim de acelerar a descalcificação. Colocar a parte que inclui o processo de côndilo e condilar e juntamente com a perna traseira em 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 dias num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
- Utilizar 50 ml de 15% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C num tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
- Usar 30% de sacarose para desidratar o côndilo e pata traseira durante a noite a 4 ° C em um tubo de 50 ml de centrífuga de polipropileno.
- Ao longo do plano sagital, incorporar a amostra comOutubro sobre a placa de corte na máquina de criocorte.
- Horizontalmente deitou a cabeça da mandíbula ou a pata traseira no molde de montagem. Mergulhe o tecido em outubro e deixá-lo na máquina criocorte até o outubro congela.
- Monte o bloco de outubro sobre a placa de corte. Esperar por cerca de 15 minutos antes de cortar para garantir que o OCT é completamente congelado.
- Cortar a cabeça da mandíbula e perna em seções de 10 mícrons. Recolher as secções em lâminas e armazenar a -20 ° C.
- Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração.
- Lavar as lâminas duas vezes com água destilada durante 5 minutos.
- Limpe a água em torno de cada seção. Use uma caneta barreira hidrofóbica para circundar as seções e soltar DAPI ou solução de montagem anti-fade não-fluorescente dentro do círculo. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento.
4. imuno coloração para Runx2 e DMP1
NOTA: O IgG controlo é necessário para coloração imuno-histoquímica para evitar sinais de falsos-positivos. A coloração para os grupos experimentais e de controlo necessita de ser realizados simultaneamente.
- Incubar as lâminas numa câmara de 37 ° C para remover a água antes da coloração.
- Lavar as lâminas duas vezes com água destilada.
- Use a caneta barreira hidrofóbica para circundar todas as seções no slide. A partir deste passo, adicionar toda a solução preparada para dentro do círculo para cobrir completamente as secções.
- Trate as seções com hialuronidase em câmara húmida a 37 ° C durante 30 minutos. O volume da solução (em passos de 4,5 - 4,8) depende do tamanho da secção. Use 50 ml de solução para o côndilo e 100 ul para o osso longo. Lavar com PBST (PBS que contém 0,1% de Tween 20), três vezes.
- Preparar e aplicar a solução de bloqueio a cada secção e incubar numa câmara húmida durante 1 h à temperatura ambiente.
- Incubar as seções com primárioA solução de anticorpo (Runx2 de coelho anti-rato, coelho ou anti-ratinho DMP1) a 4 ° C durante a noite. Lavar com PBS três vezes.
- Incubam-se as secções com solução de anticorpo secundário (anticorpo de cabra anti-coelho, Alexa Fluor 488) durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavar com PBS três vezes.
- Limpe a água ao redor da seção e soltar DAPI para dentro do círculo para cobrir a seção sobre o slide. Estabeleço com cuidado a tampa de deslizamento.
5. Microscopia Confocal
- Capturar imagens de células fluorescentes utilizando um microscópio confocal em comprimentos de onda que vão de 488 uM (verde) a 561 uM (vermelho). Tomar várias imagens empilhadas a 200 Hz (dimensões de 1.024 × 1.024) 19 utilizando 10X, 20X e 63X lentes.
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Representative Results
Condrócitos Diretamente transformar em células ósseas (osteoblastos e osteócitos) no Mandibular Condyle e Long Bone.
Agrecano, um gene crítico para chondrogenesis, se expressa principalmente no início e maduros condrócitos 18. Como resultado, a injecção de tamoxifeno às 2 semanas de idade em Agg-Cre ERT2; Camundongos Rosa26 tdTomato activado o repórter-tomate vermelho em todos os condrócitos e suas células filhas. A linha 2.3Col1a1-GFP deu origem a uma cor verde-fluorescente de colagénio-1 expressando células ósseas, osteoblastos e especificamente pré-osteócitos. A cor amarela (vermelho combinada com verde) indicou a presença de células de osso derivadas de condrócitos que expressavam o gene do colagénio 1. Na Figura 2A, a maioria das células do osso no processo condilar abaixo da cartilagem estavam vermelhos ou yellow (uma célula vermelha que tinha começado a secretar verde-fluorescente COL1A1, aparecendo assim amarelo quando os dois fluoróforos foram sobrepostas). Estes resultados forneceram evidência forte de que estas células ósseas foram derivados a partir de condrócitos. Resultados semelhantes foram também observados durante o desenvolvimento de ossos longos, onde a maioria das células ósseas foram derivados a partir de condrócitos, tanto na epífise (Figura 2B) e a metáfise (Figura 2C).
Para investigar mais estes resultados, atravessamos ratos Col10al-Cre com Rosa26 tdTomato; Ratinhos 2.3Col1a1-GFP. Col10a1 é um marcador altamente específico para HCs, expresso apenas em HCs e seus descendentes. Além disso, Col10a1-Cre é não indutível, que reflecte a diferenciação de células desde o início da expressão Col10a1 (em E14.5). No trabéculas perto da interface da cartilagem-osso (patamar superior) de 3 semanas de idade, ratinhos, vermelho e scélulas fluorescentes amarelas ome foram predominantes, enquanto as células fluorescentes verdes eram escassos. Em uma área ligeiramente mais inferior (nível médio), a maioria das células eram fluorescente amarela, com um pouco menos fluorescência vermelha. Células fluorescentes verdes apareceu para dominar apenas na área mais inferior do processo condilar (nível inferior) (Figura 3) .Esta tendência indica que o crescimento da cabeça da mandíbula é em grande parte contribuiu para células ósseas transformado de HCs. A distribuição das células fluorescentes verdes e vermelhas no processo condilar também é consistente com a direcção inferior-a-superior de crescimento condilar.
A técnica linhagem celular traçado demonstra claramente que a apoptose não é o único destino para HCs. Ambas as linhas de Agg-Cre e ERT2 Col10a1-Cre indicam que as células de osso derivadas de condrócitos são a fonte principal para o desenvolvimento ósseo no processo condilar e na epífisee metáfise no osso longo.
Co-aplicação de imunofluorescência Coloração e rastreamento celular Lineage permite o acompanhamento do diferenciação celular.
A técnica de rastreio linhagem celular também pode ser combinada com imuno fluorescência para determinar o tipo de células através da detecção de um marcador específico de células. Este método tem várias vantagens para o estudo do destino celular. Primeiro, o pesquisador pode ainda definir as características de células selecionando marcadores apropriados, mesmo sem o mouse linha GFP específica, que amplia a aplicação para a linhagem celular de rastreamento técnica. Em segundo lugar, ela simplifica a geração de ratinhos compostos. Por exemplo, precisamos apenas para gerar Agg-Cre ERT2; Ratinhos compostos Rosa26 tdTomato para produzir a cor vermelha após activação Cre (no dia pós-natal 3), em vez de criar Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato ratos, o que requer mais cruzes.
Neste estudo, nós escolhemos dois anticorpos para coloração de imunofluorescência. Um deles foi contra Runx2, um fator de transcrição crítica durante a maturação dos osteoblastos (fase inicial de células osteogénicas); o outro foi contra DMP1, expresso em osteócitos maduro (fase tardia de células osteogénicas). Na Figura 4, a fluorescência verde representa a expressão de anticorpos ou Runx2 DMP1 no 2 semanas de idade processo condilar. Na Figura 4A, três tipos de células coloridas no osso subcondral estão presentes. A cor amarela (sobreposição de fluorescência vermelha e verde) no núcleo representa as células de osso derivadas de condrócitos que expressam Runx2, indicando que estas células eram imaturas osteoblastos na superfície do osso. Além disso, havia-vermelho fluorescente células ósseas que não expressam Runx2 (f vermelholuorescence sem verde sobreposta). Estas células representam células de osso derivadas de condrócitos maduros da matriz óssea. As células menos comuns foram aqueles com apenas núcleos verde-fluorescente, indicando células ósseas não-condrócitos derivados com expressão Runx2 ou uma transformação que ocorreu antes da ativação Cre. A imagem sugere que as células vermelhas e os ossos com núcleos amarelos foram as populações de células que contribuem para a maior parte da formação de osso subcondral condilar.
Por outro lado, quase todos, célula óssea vermelha derivado de condrócitos na matriz óssea tinha coloração DMP1 em torno dos seus corpos celulares. Poucas osteócitos foram positivos para DMP1 mas faltava corpos de glóbulos vermelhos (Figura 4B). Existem também duas explicações possíveis para estas células: ou eles são células ósseas não-derivada de condrócito, ou eles são células de osso derivadas de condrócitos que transformadas antes da injecção de tamoxifeno. Além disso, não há células ósseas vermelhassobre a superfície do osso expressa DMP1, indicando que não estavam maduras osteócitos.
Tomados em conjunto, os dados dos padrões de expressão de ambos precoce (Runx2) e marcadores de fase final (DMP1) de células osteogénicas foram consistentes com o resultado anterior utilizando Cre combinado com 2.3Col1a1-GFP. Estes dados demonstram que a combinação de imunofluorescência e Rosa26 tdTomato traçado é uma boa maneira de estudar o destino celular. Mais importante, os investigadores podem distinguir o tipo de célula, identificar o estágio de diferenciação, e observar os números de células transformadas simultaneamente usando imunofluorescência com diferentes marcadores, que fornece mais informações do que Rosa26 tdTomato rastreamento sozinho.
Figura 1. O Mecanismo de Linhagem Rastreamento e the Geração dos Ratos compostos. A) O sistema Cre-loxP é comumente usado no rastreamento de linhagem. Cre extirpa a sequência de paragem entre os dois sítios loxP, e a proteína tdTomato (fluorescência vermelha) é expressa de forma permanente na linha celular específica. B) Três modelos animais são mencionados neste artigo. Usamos 2.3 COL1A1-GFP; Camundongos Rosa26 tdTomato e cruzou-os com ratos Col10a1-Cre. Col10a1-Cre é não indutível, que reflecte a diferenciação de células desde o início da expressão Col10a1 (em E14.5). C) agrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) é outra linha de Cre também cruzado com 2.3Col1a1-GFP; Camundongos Rosa26 tdTomato. Cre foi activado a 2 semanas de idade por uma injecção de tamoxifeno (Tm: tamoxifeno). D) A fim de combinar a imunofluorescência com traçado linhagem celular, geramos Agg-Cre ERT2; <em> camundongos Rosa26 tdTomato, ativado Cre no dia pós-natal 3, e realizou o Runx2 e DMP1 imunofluorescência (Tm: tamoxifeno). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. A transformação de condrócitos a células ósseas (osteoblastos e osteócitos) no Mandibular Condyle e Long óssea utilizando Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Mice compostos. A) Cre foi activada por tamoxifeno no dia pós-natal 14, e os ratinhos foram sacrificados após 4 semanas de idade. Havia três células coloridas na processo condilar: vermelho puro (células de osso derivadas de condrócitos), amarela (vermelho combinada com verde, indicando células de osso derivadas de condrócitos que expressavam o gene do colagénio 1), e verde puro (derivado não condrócitos células ósseas com o gene do colagénio 1) . A maioria das células ósseas no processo condilar abaixo da cartilagem estavam vermelhos amarelo ou puro (setas brancas), enquanto algumas células ósseas eram verdes (setas azuis). Estes dados fornecem fortes evidências de que os condrócitos transformar directamente nas células ósseas e contribuem para a formação do processo condilar durante o desenvolvimento (Tm: tamoxifeno; C: cartilagem; B: óssea). B, C) A maioria das células ósseas na epífise e metáfise foram condrócitos derivado (seta branca: células ósseas transformou-condrócitos em amarelo ou vermelho puro; seta azul: células ósseas não derivado de condrócitos em puro verde; AC: articular cartilagem; GP: placa de crescimento).blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. A transformação de condrócitos a células ósseas no côndilo mandibular Usando Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Mice compostos. A) No processo condilar de ratinhos de 3 semanas de idade, as células ósseas verdes eram uma minoria distinta no trabeculae perto da interface cartilagem-osso (nível superior, a1), enquanto vermelho e algumas células amarelas foram predominantes. No nível médio (a2), células amarelas estavam em maioria, com um pouco menos glóbulos vermelhos. Células verdes parecia ser na maioria só na zona mais inferior (a3). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. O co-localização de dois marcadores para células osteogênicas com o fundo de rastreamento de Lineage no Processo Condilar usando 2 semanas de idade Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Ratos compostos. A) A cor amarela nos núcleos representa células de osso derivadas de condrócitos que expressam Runx2 (setas brancas) na superfície do osso trabecular por baixo da cartilagem côndilo. As células ósseas vermelhos pura, sem expressão Runx2 representam células de osso derivadas de condrócitos maduros da matriz óssea (setas amarelas). o feweAs células ST foram aqueles que transportam apenas os núcleos verdes, que representa células óssea, quer não-derivada de condrócito e células ósseas transformadas a partir de condrócitos antes da activação Cre (Tm: tamoxifeno). B) No osso trabecular abaixo da cartilagem do côndilo, quase todas as células de osso derivadas de condrócitos vermelho na matriz óssea realizada coloração DMP1 em torno de seus corpos celulares (setas brancas). Apenas alguns dos osteócitos foram positivos para DMP1 mas faltava cor vermelha em seus corpos celulares (setas amarelas). Existem duas possibilidades para estas células: células ósseas não derivado de condrócitos ou células de osso derivadas de condrócitos resultantes antes da injecção tamoxifeno. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Devido às limitações tecnológicas, é sempre difícil de investigar o comportamento de células in vivo. No entanto, a técnica de linhagem celular de rastreamento está provando ser uma ferramenta poderosa para estudar biologia celular 7-9. Neste estudo, nós melhorar ainda mais este protocolo, combinando-a com a imunofluorescência. Deste modo, o destino da célula pode ser definido por vários marcadores relacionados, que alarga a aplicação do rastreio linhagem. Além disso, esta co-localização do sinal de imunofluorescência e tomate simultaneamente exibe o número de descendência da célula fundador, a sua localização, e seu estado de diferenciação, fornecendo mais informações do que a linhagem celular de rastreamento sozinho. Além disso, o uso de marcadores específicos de células podem simplificar a geração de ratinhos compostos, acelerando a investigação.
A especificidade da Cre é crucial para a atribuição inequívoca de linhagem e a precisão do 20,21 resultados. É muito importante para selecionar as linhas Cre apropriados para verificar o destino celular. Neste estudo, escolhemos Col10a1, porque é considerado um marcador específico para condrócitos hipertróf icos 10,11, e agrecano, porque é também um marcador bem reconhecido para condrócitos 18. Há também bons modelos Cre utilizados em outros campos. A linha Scleraxis-Cre (SCX-Cre), por exemplo, é útil na investigação do tendão e do ligamento desde scleraxis é um factor de transcrição hélice-volta-hélice, que é um marcador para o tendão e ligamento linhagem celular 22. Outra Cre chamado DMP1-Cre é comumente utilizada em estudos skeleton- e relacionados com o dente porque DMP1 é altamente expressa em odontoblastos e osteócitos 23,24.
Comparado com os sistemas Cre não indutíveis, a activação de Cre indutível pode ser limitada espacialmente e temporalmente 20. No entanto, algumas limitações devem ser consideradas na concepção do experimento e interpretar os resultados demodelos induteis Cre. Em primeiro lugar, a dose de tamoxifeno pode alterar a eficiência de activação Cre e o número de células marcadas. Doses baixas irá rotular a população de interesse a uma densidade clonal 25; doses elevadas podem rotular toda a piscina progenitor 7,26. Assim, a dose deve ser escolhido dependendo do objectivo da experiência. Em segundo lugar, o tamoxifeno tem um potencial de toxicidade, especialmente em doses elevadas, 27,28. Por esta razão, é preferível para diminuir a dose para evitar abortos tardios quando se injecta 29 durante a gravidez.
Em conclusão, a co-aplicação de técnicas de rastreio de linhagem celular e de imunofluorescência é uma ferramenta poderosa para investigar a biologia de células in vivo. No futuro, os investigadores podem tentar executar simultaneamente imunofluorescência com dois anticorpos diferentes sobre o fundo do sinal de tomate. Este método pode mostrar o padrão de expressão de dois marcadores em uma secção, tornando-se mais fácil para oinvestigador de comparar e analisar os resultados. Além disso, esta co-aplicação pode ainda ser melhorada por imunofluorescência em situ para diminuir a coloração não específica que pode existir por meio de imunofluorescência convencional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
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