Summary
Мы разработали два набора трассировки комбинаций в Rosa26 tdtomato (экспрессируется во всех клетках) / Cre (специфически экспрессируется в хондроцитах) мышей: один с 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и один с иммунофлюоресценции (специфичные для костных клеток). Полученные данные показывают, прямое превращение хондроцитов в костных клеток.
Abstract
Система отслеживания клеточных клонов была использована главным образом в развитии исследований по биологии. Использование Cre рекомбиназой позволяет активацию репортера в определенной клеточной линии, и все потомство. Здесь мы использовали клеточную линию трассировку технику , чтобы продемонстрировать , что хондроциты непосредственно превращаются в остеобласты и остеоциты во время длинных трубчатых костей и развития нижней челюсти мыщелка с использованием двух видов Cre, Col10a1-Cre и агрекана-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), скрещивают с Rosa26 tdTomato. Оба Col10 и аггрекан хорошо узнаваемым маркеры для хондроцитов.
Исходя из этого, мы разработали новый метод-клеточной линии трассировки в сочетании с флуоресцентной иммуногистохимии-клеток, чтобы определить судьбу путем анализа экспрессии специфических клеточных маркеров. Runx2 (маркер для остеогенных клеток на ранней стадии) и дентина матрица protein1 (DMP1, маркер для поздней стадии остеогенных клеток)используется для идентификации хондроцитов происхождения костных клеток и их состояние дифференцировки. Такое сочетание не только расширяет применение отслеживании клеточных клонов, но и упрощает генерацию сложных мышей. Что еще более важно, количество, расположение и дифференциации статусы родительской клетки потомстве отображаются одновременно, обеспечивая больше информации, чем клеточной линии отслеживания в одиночку. В заключение отметим , что совместное применение методов отслеживании клеточных клонов и иммунофлюоресценции является мощным инструментом для исследования клеточной биологии в естественных условиях.
Introduction
В процессе разработки, формирование эндохондральной кости приходится более 80% от объема скелета. Широко распространено мнение о том, что она начинается с апоптозом гипертрофических хондроцитов. Затем клетки из нижележащего костного мозга вторжению и инициировать ангиогенез, с последующим новым отложение костной ткани за счет костной marrow- и надкостницы клеток , полученных в 1,2 раза . Клетка судьба гипертрофированных хондроцитов (ГЦ), однако, был предметом споров в течение десятилетий 3. Первоначально ГЦ считались конец хондроцитов пути дифференцировки и апоптоза обычно считается окончательная судьба ГЦ. Теперь, некоторые исследователи предполагают, что по крайней мере некоторые HCs могли бы выжить и способствовать формированию эндохондральной кости. Несмотря на то, что они предложили , чтобы рост пластины хондроциты имел возможность трансформироваться в остеобласты , основанные на ультраструктуры, иммуногистохимического окрашивания, и в пробирке не изучает 46, ни один из этих методов шпрежде чем окончательное в демонстрации хондроцитов вклад в остеобластов линии.
Методика отслеживания клеточных клонов обеспечивает более строгий подход к изучению клеточной судьбы. Коротко говоря, рекомбиназа фермент, который экспрессируется только в определенном типе клеток, стимулирует экспрессию гена-репортера. Таким образом, этот тип клеток и их потомков постоянно помечены 7. Система Cre-LoxP обычно используется в трассировке линии. Cre (рекомбиназа фермент) будет эксцизии последовательности , то между двумя LoxP сайтов и активировать репортер в специфической клеточной линии (рисунок 1А). В некоторых случаях исследователь может выбрать благоприятный момент времени , чтобы активировать Cre с помощью лекарственного средства, такие как тамоксифен, в результате чего Cre сплавить с измененной формой рецептора эстрогена (CRE ERT2) 8. Флуоресцентные репортеры стали стандартом в линии отслеживания экспериментов, поскольку они резко снижают сложностьи повысить точность и эффективность клеточной судьбы кальку 8,9. tdTomato становится лучшим выбором среди флюоресцентных репортеров , поскольку она имеет самый яркий флуоресцентный белок и самый сильный эпифлуоресцентной, что делает его легко визуализировать 7 (рисунок 1А).
Используя родословие Rosa26 tdTomato трассировку системы, наша группа и другие исследователи показали , что ГЦ могут изменить свой фенотип в костных клеток в процессе развития 10-14. Для достижения этой цели , мы разработали два набора отслеживании комбинации с Rosa26 tdtomato (повсеместного выражение во всех клетках) / Cre (специфичными к хондроцитов) мышей: 2.3Col1a1-GFP (специфичными к остеобластов) и иммунофлюоресценции (характерные для костных клеток). Полученные данные показывают , что оба метода являются жизнеспособными пути исследования клеточной судьбы в естественных условиях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все протоколы были рассмотрены и одобрены животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) в Texas A & M University College стоматологии по.
1. Животноводство
- Используйте три модели животных в данном исследовании. Для того, чтобы исследовать судьбу эмбриональных хондроцитов в формировании мыщелка, сначала используйте Col10a1-CRE 15 мышей и скрестить их с Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Гт (РОСА) 26Sor ТМ9 (CAG-tdTomato) Hze / J) мышей для получения Col10a1- Cre и Rosa26 tdTomato мышей. Далее пересечь этих мышей с 2.3Col1a1, GFP мышей 16. Используйте Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP мышей , чтобы выполнить трассировку клеточных клонов экспериментов (рис 1б).
- Изучить судьбу послеродовых хондроцитов, следовать той же процедуре, что и в шаге 1.1, но использовать агрекана-CRE ERT2 (Agg-Cre ERT2) 17,18 линия и держать Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP мышей , чтобы выполнить трассировку клеточных клонов экспериментов (рис 1C). Вводят тамоксифен на постнатальный день 14.
- Чтобы объединить клеточную линию трассировку технику с иммунофлуоресценции, крест мышей Agg-Cre ERT2 и мышей Rosa26 tdTomato. Используйте мышей , которые несут оба гена в эксперименте и впрыснуть тамоксифен на послеродовом 3 -й день (рис 1D).
2. Подготовка материала
- Растворить тамоксифеном порошок в 10% этанола и 90% масла кукурузы при концентрации 10 мг / мл. Дозировка для инъекций 75 мг / кг.
- Растворить порошок параформальдегида (PFA) в PBS до концентрации 4%, с использованием 2 М гидроокисью натрия, чтобы отрегулировать значение рН до 7,4. Используйте 4% раствора PFA для фиксации ткани (нижнечелюстной мыщелок и задние ноги используются здесь) после жертвы. Из-за еготоксичность, ручка PFA в капюшоне с перчатками и лицевую маску.
- Растворить порошок EDTA в дистиллированной воде до концентрации 10%, с использованием 2 М гидроокисью натрия, чтобы отрегулировать значение рН до 7,4. Используйте 10% ЭДТА до декальцинировать нижнечелюстной мыщелок и заднюю ногу.
- Растворить порошок сахарозы в PBS при концентрациях 15% и 30%. Используйте раствор сахарозы обезвоживает ткани после того, как декальцинации.
- Растворить порошок гиалуронидазы в PBS при концентрации 2 мг / мл, рН 5,0. Это решение предназначено для извлечения иммунофлюоресценции антигена.
- С помощью 1,5-мл пробирку с получением раствора блокирующего, содержащего 3% бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 20% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 специфического окрашивания.
- С помощью 1,5-мл пробирку, чтобы получить раствор первичного антитела, содержащего 2% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 специфического окрашивания. Концентрация первичного антитела составляет 1: 400 для Runx2 и 1: 100 для DMP1.
- Используйте 1,5-мл пробирку для подготовкиIgG кролика раствор в качестве контроля для иммунофлуоресцентного окрашивания, чтобы избежать ложных положительных результатов. Раствор содержит 2% сыворотки козьего в PBS. Концентрацию кроличьего IgG для контроля Runx2 составляет 1: 400; для DMP1, 1: 100. Выполнение эксперимента и контроля окрашивания одновременно.
- Используйте 1,5 мл пробирку, чтобы приготовить вторичный раствор антител, содержащий 2% сыворотки козьего в PBS для Runx2 или DMP1 иммунофлуоресцентного окрашивания. С помощью вторичного антитела в разведении 1: 500.
3. Задвиньте Подготовка к конфокальной микроскопии (Cell Lineage Tracing Только Нет Комбинация с иммунофлуоресценции)
- Вводят тамоксифен в CRE-Agg ERT2 мышей при благоприятном момент времени.
- Во-первых, удалить мышь из клетки. Затем, используя большой палец левой руки и указательный палец, чтобы захватить кожу на спине мыши и перевернуть его, обнажив живот. Используйте правую руку, чтобы удерживать шприц. Оптимальная точка входа для инъекций на лEFT или с правой стороны нижней части живота, избегая печени и мочевого пузыря.
- Держите шприц параллельно задних ног мыши и вводят внутрибрюшинно. Дозировка для инъекций 75 мг / кг. Веса мышей в возрасте от 2-х недель, 3 недели и 4 недели примерно 7 - 9 г, 11 - 13 г, и 16 - 18 г, соответственно.
- Обезболить мышей с комбинацией Ксилазин / Ketaset.
- Для приготовления рабочего раствора, сначала разбавить ксилазина и Ketaset дистиллированной водой до концентрации 1 мг / мл и 5 мг / мл, соответственно. Затем смешать ксилазина и Ketaset в соотношении 1: 2. Дозировка для инъекций составляет 30 мкл / г.
- Вводите как на этапе 3.1. Подтвердите обезболивание, зажимая лодыжку мыши. Мышь находится в бессознательном, если он не имеет никакой реакции.
- Заливать мышей с 4% PFA после обезболиванием.
- После того, как мышь теряет сознание, фиксируют четыре ноги мыши на борту entirelу обнажить живот.
- Пропитайте живота с 70% этанола и произвести вырезание из нижней части живота к шее вдоль средней линии. Pinch и одновременно потяните кожу на боковых сторонах, чтобы выявить брюшину. Используйте рассечение ножницами, чтобы сделать продольное иссечение.
- Отрежьте и снимите передние ребра, чтобы обнажить сердце. Прокол сердца от левого желудочка с 22 G шприца, держать шприц, и одновременно сократить слот в правом предсердии.
- Медленно вводят 4% PFA, который перфузию вдоль сердечно-сосудистой системы в то время как кровь смывает из разреза из правого предсердия. Объем PFA для перфузией составляет 1 мл / г. Выполните этот шаг в шкафу класса I по биологической безопасности, который с трудом вентиляционным каналом здание системы выпуска отработавших газов.
- Снимают кожу мыши и поместить все тело в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку, которая содержит 40 мл 4% PFA зафиксировать в течение ночи при температуре 4 ° С.
- Используйте рассечение ножницами и # 3 и # 5 щипцов тщательно удалить нижнюю челюсть и заднюю ногу от тела и удаления мышц и сухожилий на поверхности. Выполните этот шаг в шкафу класса I по биологической безопасности, который с трудом вентиляционным каналом здание системы выпуска отработавших газов.
- Обрежьте нижнюю челюсть на две части в дистальной области третьего моляра. Точно так же, срезанные бедренной и большеберцовой костей в диафиза подвергать полость костного мозга с целью ускорения декальцификацию. Помещенный часть, которая включает в себя процесс мыщелка и мыщелкового и вместе с задней ноги на 40-мл 10% -ного EDTA до накипь при 4 ° С в течение 2 - 4 дней в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
- С помощью 50 мл 15% сахарозы в обезвоживают мыщелка и заднюю ногу в течение ночи при температуре 4 ° С в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
- Используйте 30% сахарозы к обезвоживанию мыщелка и заднюю ногу в течение ночи при температуре 4 ° С в 50-мл полипропиленовую центрифужную пробирку.
- Вдоль сагиттальной плоскости, встраивать образца сОктябре на режущую пластину в cryosection машине.
- Горизонтально лежал мыщелка или заднюю ногу в монтажной формы. Погрузите ткань в ОСТ и оставить его в cryosection машине, пока не замерзнет октября.
- Установите блок ОКТ на режущей пластине. Подождите примерно 15 минут прежде, чем порезать, чтобы гарантировать, что ОКТ полностью заморожены.
- Обрежьте мыщелок и заднюю ногу на секции 10 мкм. Соберите разделы на слайдах и хранить при температуре -20 ° C.
- Выдержите слайд в камере C 37 °, чтобы удалить воду перед окрашиванием.
- Промыть слайдов дважды дистиллированной водой в течение 5 мин,
- Вытрите воду вокруг каждой секции. Используйте гидрофобный барьер пера круг секций и падение DAPI или не-флуоресцирующий анти-выцветанию решение для монтажа в круг. Аккуратно сложить покровное.
4. Иммуногистохимическое Окрашивание для Runx2 и DMP1
ПРИМЕЧАНИЕ: IgG противТроль необходимо для иммуногистохимического окрашивания, чтобы избежать ложных положительных сигналов. Окрашивание для экспериментальной и контрольной групп должна выполняться одновременно.
- Инкубируйте слайдов в камере C 37 °, чтобы удалить воду перед окрашиванием.
- Вымойте слайды дважды дистиллированной водой.
- Используйте гидрофобный барьер пера обвести все разделы на слайде. От этого шага, добавьте все приготовленного раствора в круг, чтобы полностью покрыть секции.
- Treat участки с гиалуронидаза во влажной камере при 37 ° С в течение 30 мин. Объем раствора (в шагах 4.5 - 4.8), зависит от размера участка. Используйте 50 мкл раствора для мыщелка и 100 мкл для длинных трубчатых костей. Промыть PBST (PBS, содержащем 0,1% Tween 20) три раза.
- Подготовить и применить блокирующий раствор для каждой секции и инкубировать их во влажной камере в течение 1 часа при комнатной температуре.
- Инкубируйте участки с первичнымРаствор антитела (кроличьи антитела мыши Runx2, или кроличье анти-мышь DMP1) при 4 ° С в течение ночи. Промывают ЗФР три раза.
- Инкубируйте участки с раствором вторичными антителами (козий анти-кроличий, Alexa Fluor 488) в течение 2 ч при комнатной температуре. Промывают ЗФР три раза.
- Вытрите воду вокруг секции и падение DAPI в круг, чтобы покрыть раздел на слайде. Аккуратно сложить покровное.
5. конфокальной микроскопии
- Захват флуоресцентные изображения клеток с помощью конфокальной микроскопии в диапазоне длин волн от 488 мкм (зеленый) до 561 мкм (красный). Возьмите несколько сложенных изображения с частотой 200 Гц (размеры 1,024 × 1,024) 19 с использованием 10X, 20X и 63X линзы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytes Непосредственно Превращение в костные клетки (остеобласты и остеоциты) в нижнечелюстной мыщелок и длинных трубчатых костей.
Агрекана, критический ген хондрогенезе, в основном выражается в ранних и зрелых хондроцитов 18. В результате, нагнетание тамоксифена в 2 -х недельном возрасте в Agg-Cre ERT2; Мышей Rosa26 tdTomato активировал красно-томатного репортер во всех хондроцитов и их дочерние клетки. 2.3Col1a1-GFP линии привело к зелено-флуоресцирующих цвета в коллагена 1-экспрессирующих костных клеток, специфически остеобласты и предварительные остеоцитов. Желтый цвет (красный в сочетании с зеленым) показала наличие хондроцитов , полученных костных клеток , которые экспрессируют ген коллагена 1. На фигуре 2А, большинство из костных клеток в мыщелкового отростка под хрящом были красные или уellow (красная клетка, которая начала секретируют зеленого флуоресцирующего COL1A1, в результате чего появляется желтый, когда были наложены два флуорофоров). Эти результаты убедительно показали, что эти клетки кости были получены из хондроцитов. Аналогичные результаты наблюдались и в течение длительного развития костей, где большинство костных клеток были получены из хондроцитов в обоих эпифизом (Фигура 2В) и метафиза (фиг.2с).
Для дальнейшего изучения этих результатов, мы пересекли мышей Col10al-CRE с Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP мышей. Col10a1 является весьма специфическим маркером для ГЦ, экспрессируется только в ГЦ и их потомков. Кроме того, Col10a1-Cre является неиндуцибельных, которая отражает клеточную дифференцировку с самого начала выражения Col10a1 (на E14.5). В трабекул вблизи границы раздела хрящ-кость (улучшенный уровень) 3-недельного возраста мышей, красный и секоторые желтые флуоресцирующие клетки преобладали, в то время как зеленые флуоресцирующие клетки были скудными. В несколько более низкого области (средний уровень), большинство клеток были флуоресцирующих желтый, с немного меньшим количеством флуоресцирующих красным. Зеленые флуоресцирующие клетки появились доминировать только в самой нижней области мыщелкового отростка (нижний уровень) (рисунок 3) .Эта тенденция указывает на то, что рост мыщелковая в основном способствовали трансформированными костных клеток из ГЦ. Распределение красного и зеленого флуоресцирующих клеток в процессе мыщелка также согласуется с нижней к превосходящий направлению роста мыщелка.
Метод трассировки клеточных клонов ясно показывает, что апоптоз не единственная судьба для ГЦ. Обе линии Agg-Cre ERT2 и Col10a1-Cre показывают , что хондроцитов полученные клетки кости являются основным источником для развития костей в процессе мыщелкового и в эпифизеи метафиз в длинных трубчатых костей.
Совместное применение иммунофлуоресцентного Окрашивание и Cell Lineage Tracing Включает отслеживание дифференцировка клеток.
Метод трассировки клеточных клонов могут быть также объединены с флуоресцентной иммуногистохимии для определения типа клетки путем обнаружения клеточного специфического маркера. Этот метод имеет ряд преимуществ для изучения судьбы клеток. Во-первых, исследователь может по-прежнему определяют характеристики клеток путем выбора подходящих маркеров, даже без конкретной линии GFP мыши, которая расширяет применение для клеточной линии отслеживания техники. Во-вторых, это упрощает генерирование сложных мышей. Например, нам нужно только сгенерировать Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato соединения мышей , чтобы произвести красный цвет после активации Cre (в послеродовом 3 -й день), вместо того чтобы создавать Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato мышей, которых требует большего количества крестов.
В данном исследовании мы выбрали два антитела для иммунофлуоресцентного окрашивания. Один из них был против Runx2, критического фактора транскрипции во время созревания остеобластов (ранней стадии остеогенных клеток); другой был против DMP1, выраженной в зрелых остеоцитов (поздней стадии остеогенных клеток). На рисунке 4, зеленая флуоресценция представляет собой выражение антитела RUNX2 или DMP1 в 2-недельных мыщелкового процесса. На фиг.4А, три типа цветных клеток в субхондральной кости присутствуют. Желтый цвет (накладывание красной и зеленой флуоресценции) в ядре представляет собой хондроцитов происхождения костных клеток, выражающих Runx2, указывая, что эти клетки были незрелые остеобласты на поверхности кости. Кроме того, были красно-флуоресцирующих костные клетки, которые не экспрессируют Runx2 (красный еluorescence без наложенного зеленого цвета). Эти клетки представляют собой зрелые хондроцитов происхождения костных клеток в костном матриксе. Наименее распространенные клетки были те только с зелеными-флуоресцирующих ядер, что указывает на не-хондроцитов, полученных из костных клеток с выражением Runx2 или трансформации, которые имели место до активации CRE. Изображение показывает, что красные клетки кости и те, с желтыми ядрами были популяции большинство клеток, способствующие мыщелкового субхондральной формирования кости.
С другой стороны, почти каждый красный, хондроцитов происхождения костных клеток в костном матриксе имели DMP1 окрашивание вокруг их тела клеток. Немногие остеоцитами были положительными для DMP1 , но не хватало красных клеток тела (рис 4б). Есть также два возможных объяснения этих клеток: либо они не являются хондроцитов происхождения костных клеток, или они являются хондроцитов происхождения костных клеток, которые трансформированы до тамоксифена инъекции. нет Кроме того, не красные клетки костина поверхности кости выражается DMP1, указывая, что они не были зрелыми остеоцитов.
Взятые вместе, данные из паттернов экспрессии для обоих ранне- (Runx2) и маркеры поздней стадии (DMP1) остеогенных клеток были совместимы с предыдущим исходом с использованием Cre в сочетании с 2.3Col1a1-GFP. Эти данные свидетельствуют о том, что сочетание иммунофлуоресценции и прослеживания Rosa26 tdTomato является хорошим способом для изучения клеточной судьбы. Что еще более важно, исследователи могут различать тип клеток, идентифицировать стадии дифференцировки, и наблюдать преобразованные числа клеток одновременно с помощью иммунофлуоресценции с различными маркерами, что обеспечивает больше информации , чем Rosa26 tdTomato отслеживания в одиночку.
Рисунок 1. Механизм клеточной линии Трассировка и йе поколение компаунд-мышей. А) Система Cre-LoxP обычно используется в трассировке линии. Cre вырезает последовательность СТОП между двумя LoxP сайтов, а также белок tdTomato (флуоресцирующих красный) постоянно выражается в конкретной клеточной линии. Б) Три модели животных упоминаются в этой статье. Мы использовали 2,3 COL1A1-GFP; Мышей Rosa26 tdTomato и скрестили их с мышами Col10a1-CRE. Col10a1-Cre является неиндуцибельных, которая отражает клеточную дифференцировку с самого начала выражения Col10a1 (на E14.5). C) агрекана-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) еще одна Cre линия также пересекается с 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato мышей. Cre активировали в возрасте 2 недель, с помощью тамоксифена инъекции (Tm: тамоксифена). D) Для того , чтобы совместить иммунофлюоресценции с отслеживанием клеточных клонов, мы сгенерировали Agg-Cre ERT2; <EM> мышей Rosa26 tdTomato, активированный Cre в послеродовом 3 -й день, и исполнил RUNX2 и DMP1 иммунофлюоресценции (Tm: тамоксифен). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2. Переход от хондроцитов костные клетки (остеобласты и остеоциты) в нижнечелюстной мыщелок и длинных трубчатых костей с использованием Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Составные Мыши. А) Cre активировали тамоксифена на постнатальный день 14, и мышей умерщвляли через 4 недели. Существовали три цветные клетки в мыщелковая процесс: чистый красный (хондроцитов происхождения костных клеток), желтый (красный в сочетании с зеленым, показывая хондроцитов происхождения костных клеток, экспрессирующих ген коллагена 1), и чистый зеленый (не хондроцит , получаемый костные клетки с геном коллагена 1) , Большинство костных клеток в мыщелкового отростка под хрящом пожелтели или чистый красный (белые стрелки), в то время как несколько костных клеток были зеленые (синие стрелки). Эти данные обеспечивают убедительное доказательство, что хондроциты непосредственно превращаться в костные клетки и способствуют формированию мыщелкового отростка в процессе развития (Tm: тамоксифена, С: хрящ, B: кость). B, C) Большинство костных клеток в эпифиза и метафиза были хондроцитов происхождения (белая стрелка: хондроцитов-трансформированные клетки кости в желтый или чисто красный, синий стрелка: Non-хондроцитов происхождения костных клеток в чистом зеленый; AC: суставном хрящ; GP: рост пластины).пустым "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Переход от хондроцитов костных клеток в нижнечелюстной мыщелок Использование Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Составные Мыши. A) В процессе мыщелкового от 3-недельных мышей, зеленые клетки кости были явное меньшинство в трабекул вблизи границы раздела хрящ-кость (улучшенный уровень, а1), в то время как красный и некоторые желтые клетки преобладали. В среднем уровне (а2), желтые клетки были в большинстве своем , с меньшим количеством слегка красных клеток. Зеленые клетки оказались в большинстве своем только в самой нижней зоне (A3), Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4. Совместная локализация двух маркеров для остеогенных клеток с Lineage трассировки фона в мыщелкового отростка с использованием 2-недельных Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Составные Мыши. А) Желтый цвет в ядрах представляет хондроцитов происхождения костные клетки , экспрессирующие Runx2 (белые стрелки) на поверхности губчатой кости под мыщелка хряща. Чистые красные костные клетки без экспрессии Runx2 представляют зрелых хондроцитов происхождения костных клеток в костном матриксе (желтые стрелки). feweй клетки, несущие только зеленые ядра, представляющие либо не хондроцитов происхождения костных клеток или трансформированные костных клеток из хондроцитов перед активацией Cre (Tm: тамоксифен). Б) В губчатой кости под мыщелка хряща, почти каждый красный хондроцитов происхождения костных клеток в костной матрицы проводили DMP1 окрашивание вокруг их тел клеток (белые стрелки). Лишь немногие из остеоцитах были положительными для DMP1, но не хватало красного цвета в их клеточных тел (желтые стрелки). Есть две возможности для этих клеток: без хондроцитов происхождения костных клеток или хондроцитов полученных костных клеток, возникающих перед тем тамоксифена инъекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Из - за технических ограничений, всегда трудно исследовать поведение клеток в живом организме . Тем не менее, метод трассировки клеточных клонов, оказывается мощным инструментом для изучения клеточной биологии 7-9. В данном исследовании мы улучшить этот протокол путем объединения его с иммунофлюоресценции. Таким образом, клеточная судьба может быть определена с помощью нескольких связанных маркеров, что расширяет применение трассировке ростка. Кроме того, эта совместная локализация иммунофлуоресцентного и томатным сигнала одновременно отображает количество потомков основателя ячейки, их местоположение, и их статус дифференциации, предоставляя больше информации, чем клеточной линии отслеживания в одиночку. Кроме того, использование клеточных маркеров специфических может упростить генерацию составных мышей, ускоряя исследование.
Специфика Cre имеет решающее значение для однозначного присвоения линии и точности 20,21 результатов. Это очень имВАЖН, чтобы выбрать соответствующие строки CRE проверить судьбу клеток. В данном исследовании мы выбрали Col10a1, потому что считается специфическим маркером для гипертрофических хондроцитов 10,11 и аггрекан, потому что это также хорошо узнаваемым маркером для хондроцитов 18. Есть также хорошие модели Cre, используемые в других областях. Линия Scleraxis-Cre (SCX-CRE), например, является полезным в сухожилии и исследования лигамента поскольку scleraxis является основной спираль-петля-спираль фактор транскрипции , который является маркером линии передачи 22 клеток сухожильных и связкой. Другой Cre называется DMP1-Cre обычно используется в каркасно и зубов , связанных с исследованиями , потому что DMP1 высоко выражается в одонтобластами и Остеоциты 23,24.
По сравнению с неиндуцибельных системами Cre, активация индуцибельной Cre может быть ограничено во времени и пространстве 20. Тем не менее, некоторые ограничения следует учитывать при проектировании эксперимента и интерпретации результатовиндуцируемые модели CRE. Во-первых, доза тамоксифена может изменить эффективность активации Cre и число меченых клеток. Низкие дозы будут маркировать население интереса на клональной плотности 25; высокие дозы могут маркировать весь пул клеток - предшественников 7,26. Таким образом, доза должна быть выбрана в зависимости от целей эксперимента. Во- вторых, тамоксифен обладает потенциальной токсичности, особенно в высоких дозах 27,28. По этой причине, то лучше уменьшить дозу , чтобы избежать поздних сроках при введении во время беременности 29.
В заключение отметим , что совместное применение методов отслеживании клеточных клонов и иммунофлюоресценции является мощным инструментом для исследования клеточной биологии в естественных условиях. В будущем исследователи могут попытаться одновременно выполнять иммунофлюоресценции с двумя различными антителами над фоном томат сигнала. Этот метод может показать характер экспрессии двух маркеров в одной секции, что делает его более легким дляСледователь сравнивать и анализировать результаты. Кроме того, это совместное применение может быть дополнительно улучшена путем иммунофлуоресценции на месте , чтобы уменьшить неспецифическое окрашивание , которое может существовать через обычный иммунофлюоресценции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M.
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P.
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al.
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
