Summary
Hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones en Rosa26 tdtomato (ubicuamente expresado en todas las células) / Cre (expresa específicamente en condrocitos) ratones: uno con 2.3Col1a1-GFP (específico para los osteoblastos) y uno con inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran la transformación directa de los condrocitos en las células óseas.
Abstract
El sistema de rastreo de linaje de células se ha utilizado predominantemente en los estudios de biología del desarrollo. El uso de la recombinasa Cre permite la activación del reportero en una línea celular específica y toda la progenie. En este caso, se utilizó la línea celular de rastreo técnica para demostrar que los condrocitos se transforman directamente en los osteoblastos y los osteocitos durante hueso largo y el desarrollo cóndilo mandibular utilizando dos tipos de Cre, Col10a1-Cre y Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), cruzamos con Rosa26 tdTomato. Tanto Col10 y agrecano son marcadores bien reconocidos por los condrocitos.
Sobre esta base, hemos desarrollado un nuevo linaje de células método de seguimiento en relación con el destino de células inmunohistoquímica para definir fluorescente mediante el análisis de la expresión de marcadores de células específicas. Runx2 (un marcador de células osteogénicas en fase inicial) y la dentina protein1 matriz (DMP1, un marcador para las células de la última etapa osteogénicas) eranse utiliza para identificar las células óseas de condrocitos derivados y su estado de diferenciación. Esta combinación no sólo amplía la aplicación de rastreo de linaje de células, sino que también simplifica la generación de ratones compuestos. Más importante aún, los estados de número, ubicación, y la diferenciación de la progenie celular parental se muestran simultáneamente, proporcionando más información de la línea celular de rastreo solo. En conclusión, la co-aplicación de técnicas de trazado de linaje celular y de inmunofluorescencia es una herramienta poderosa para la investigación de biología celular in vivo.
Introduction
Durante el desarrollo, la formación de hueso endocondral representa más del 80% del volumen esquelético. Se cree ampliamente que comienza con la apoptosis de los condrocitos hipertróficos. Posteriormente, las células de la médula ósea subyacente invaden y iniciar la angiogénesis, seguido por la deposición de hueso nuevo por marrow- ósea y células derivadas de periostio 1,2. El destino celular de condrocitos hipertróficos (HC), sin embargo, ha sido un tema de debate durante décadas 3. Inicialmente, los HC se considera que el final de la vía de diferenciación de condrocitos, y la apoptosis en general se piensa que es el destino final de los HC. Ahora, algunos investigadores sugieren que al menos algunos HC podrían sobrevivir y contribuir a la formación de hueso endocondral. A pesar de que propusieron que el crecimiento de condrocitos placa tenían la capacidad de transdifferentiate en osteoblastos sobre la base de ultraestructura, tinción inmunohistoquímica, y los estudios in vitro de 46 años, ninguno de estos métodos were definitiva para demostrar la contribución de los condrocitos al linaje de osteoblastos.
La técnica de rastreo de linaje celular proporciona una manera más rigurosa para estudiar el destino celular. En pocas palabras, una enzima recombinasa, que sólo se expresa en un tipo específico de célula, estimula la expresión del gen reportero. De esta manera, este tipo de células y sus descendientes son etiquetados de forma permanente 7. El sistema Cre-loxP se utiliza comúnmente en el rastreo de linaje. Cre (la enzima recombinasa) será escindir la secuencia de parada entre los dos sitios loxP y activar el reportero en una línea celular específica (Figura 1A). En algunos casos, el investigador puede elegir un punto de tiempo favorable para activar Cre mediante el uso de un fármaco, tal como tamoxifeno, causando Cre para fusionar a una forma modificada del receptor de estrógeno (Cre ERT2) 8. reporteros fluorescentes han convertido en el estándar en el linaje de rastreo experimentos, ya que reducen drásticamente la complejidady mejorar la precisión y la eficiencia de la celda destino de rastreo 8,9. tdTomato se está convirtiendo en la mejor elección entre los reporteros fluorescentes ya que tiene la proteína fluorescente más brillante y la más fuerte de epifluorescencia, lo que es fácilmente visualizada 7 (Figura 1A).
Al utilizar el linaje Rosa26 tdTomato sistema de rastreo, nuestro grupo y otros investigadores han demostrado que los HC puede cambiar su fenotipo en células óseas durante el desarrollo 10-14. Para lograr esto, hemos desarrollado dos conjuntos de rastreo de combinaciones con Rosa26 tdtomato (expresión ubicua en todas las células) / Cre (específico de condrocitos) ratones: 2.3Col1a1-GFP (específico de osteoblastos) e inmunofluorescencia (específico de células óseas). Los datos demuestran que ambos métodos son formas viables para estudiar el destino de células in vivo.
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Protocol
Todos los protocolos fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado de Animales y el empleo (IACUC) de la Texas A & M University College of Dentistry.
Cría de Animales 1.
- Use tres modelos animales en este estudio. Para investigar el destino de los condrocitos embrionarios en la formación de cóndilo, primer uso Col10a1 Cre-15 ratones y cruzarlos con Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) Hze / J) para obtener ratones Col10a1- Cre ratones y Rosa26 tdTomato. A continuación, cruzar estos ratones con ratones 2.3Col1a1 16-GFP. Utilice Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1B).
- Para estudiar el destino de los condrocitos postnatales, siga el mismo procedimiento que en el paso 1.1, pero el uso de la ERT2 Aggrecan cre-(Agg-Cre ERT2) 17,18 línea y mantener la AGG-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP para llevar a cabo los experimentos de rastreo de linaje de células (Figura 1C). Inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 14.
- Para combinar el linaje de células trazando técnica de inmunofluorescencia, cruzar ratones Agg-Cre ERT2 y ratones Rosa26 tdTomato. Utilice los ratones que llevan ambos genes en el experimento e inyectar el tamoxifeno en el día postnatal 3 (Figura 1D).
2. Preparación de materiales
- Disolver el polvo tamoxifeno en 10% de etanol y aceite de maíz 90% a una concentración de 10 mg / ml. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg.
- Disolver el polvo de paraformaldehído (PFA) en PBS a una concentración de 4%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Use la solución PFA 4% para fijar el tejido (el cóndilo mandibular y la pata trasera se utilizan aquí) después del sacrificio. Debido a sutoxicidad, manejar PFA en la campana con guantes y una mascarilla.
- Disolver el polvo EDTA en agua destilada a una concentración de 10%, utilizando hidrato de sodio 2 M para ajustar el valor pH a 7,4. Utilice 10% EDTA para descalcificar el cóndilo mandibular y la pata trasera.
- Disuelva el polvo de sacarosa en PBS a concentraciones de 15% y 30%. Utilice la solución de sacarosa para deshidratar el tejido después de la descalcificación.
- Disolver el polvo hialuronidasa en PBS a una concentración de 2 mg / ml, pH 5,0. Esta solución es para la recuperación de antígeno por inmunofluorescencia.
- Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de bloqueo que contiene 3% de albúmina de suero bovino (BSA) y suero de cabra al 20% en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia.
- Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo primario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. La concentración del anticuerpo primario es de 1: 400 para Runx2 y 1: 100 para DMP1.
- Use un tubo de 1,5 ml para prepararla solución de IgG de conejo como el control para la tinción de inmunofluorescencia para evitar resultados falsos positivos. La solución contiene 2% de suero de cabra en PBS. La concentración de la IgG de conejo para el control Runx2 es 1: 400; para DMP1, 1: 100. Realizar el experimento y el control de la tinción de forma simultánea.
- Use un tubo de 1.5 ml para preparar una solución de anticuerpo secundario que contiene 2% de suero de cabra en PBS para la tinción Runx2 o DMP1 de inmunofluorescencia. Utilice el anticuerpo secundario a una dilución de 1: 500.
3. Preparación de los portaobjetos de microscopía confocal (linaje celular rastreo solamente, ninguna combinación con inmunofluorescencia)
- Inyectar el tamoxifeno en el cre-Agg ERT2 ratones en un punto de tiempo favorable.
- En primer lugar, eliminar un ratón de su jaula. A continuación, utilice el pulgar y el dedo índice izquierdo para agarrar la piel en la parte posterior del ratón y darle la vuelta, dejando al descubierto el abdomen. Utilice la mano derecha para sostener la jeringa. El punto de entrada óptimo para la inyección es en la lEFT oa la derecha de hipogastrio, evitando el hígado y la vesícula.
- Mantener la jeringa en paralelo a las patas traseras del ratón y se inyecta por vía intraperitoneal. La dosis para la inyección es de 75 mg / kg. Los pesos de los ratones a las edades de 2 semanas, 3 semanas y 4 semanas de edad son aproximadamente 7 - 9 g, 11 - 13 g, y 16 - 18 g, respectivamente.
- Anestesiar a los ratones con una combinación xilazina / Ketaset.
- Para preparar la solución de trabajo, diluir primero la xilazina y Ketaset con agua destilada a una concentración de 1 mg / ml y 5 mg / ml, respectivamente. A continuación, mezclar la xilazina y Ketaset en una proporción de 1: 2. La dosificación para inyección es 30 l / g.
- Inyectar como en el paso 3.1. Confirmar la anestesia pellizcando el tobillo del ratón. El ratón está inconsciente si no tiene una reacción.
- Perfundir los ratones con PFA al 4% después de la anestesia.
- Después de que el ratón pierde la conciencia, fijar las cuatro patas del ratón sobre una tabla de entirely exponer el abdomen.
- Saturar el abdomen con un 70% de etanol y hacer una escisión de la parte inferior del abdomen hasta el cuello a lo largo de la línea media. Pellizcar y simultáneamente tirar de la piel a los lados laterales para revelar la membrana peritoneal. Use las tijeras de disección para hacer una escisión longitudinal.
- Cortar y quitar las costillas delanteras para exponer el corazón. Perforar el corazón del ventrículo izquierdo con una jeringa de 22 G, mantenga la jeringa, y al mismo tiempo cortar una ranura en la aurícula derecha.
- Lentamente inyectar el 4% PFA, que se perfundió a lo largo del sistema cardiovascular mientras que los rubores de sangre fuera del corte de la aurícula derecha. El volumen de la PFA para la perfusión es 1 ml / gramo. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio.
- Retire la piel del ratón y puso todo el cuerpo en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml que contiene 40 ml de PFA al 4% para fijar la noche a 4 ° C.
- Use las tijeras de disección y # 3 y # 5 pinzas para retirar con cuidado la mandíbula y la pata trasera del cuerpo y para eliminar los músculos y los tendones en la superficie. Realice este paso en una cabina de bioseguridad de Clase I que es difícil de tuberías para el sistema de salida del edificio.
- Cortar la mandíbula en dos artículos en la región distal del tercer molar. Del mismo modo, cortar el fémur y la tibia en la mitad del tallo para exponer la cavidad de la médula ósea a fin de acelerar la descalcificación. Ponga la parte que incluye el proceso cóndilo y condilar y junto con la pata trasera en 40 ml de 10% de EDTA para descalcificar a 4 ° C durante 2 - 4 días en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
- Usar 50 ml de 15% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
- Utilice 30% de sacarosa para deshidratar el cóndilo y la pata trasera durante la noche a 4 ° C en un tubo de centrífuga de polipropileno de 50 ml.
- A lo largo del plano sagital, incrustar la muestra conPTU respecto de la placa de corte en la máquina criogénica.
- Horizontalmente sentar las cóndilo o la pata trasera en el molde de montaje. Sumergir el tejido en OCT y dejarlo en la máquina criogénica hasta la OCT se congela.
- Montar el bloque de PTU respecto de la placa de corte. Esperar aproximadamente 15 min antes de cortar para asegurar que el OCT es completamente congelado.
- Cortar el cóndilo y la pata trasera en secciones de 10 micras. Recoger las secciones en portaobjetos y se almacena a -20 ° C.
- Incubar el portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción.
- Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada durante 5 minutos.
- Limpiar el agua alrededor de cada sección. Utilice un bolígrafo barrera hidrofóbica para rodear las secciones y soltar DAPI o solución de montaje anti-fade no fluorescente en el círculo. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta.
4. La tinción inmunohistoquímica para Runx2 y DMP1
NOTA: El aire IgGcontrol es necesario para la tinción inmunohistoquímica para evitar falsos positivos señales. La tinción de los grupos experimentales y de control necesita ser realizado simultáneamente.
- Incubar los portaobjetos en una cámara de 37 ° C para eliminar el agua antes de la tinción.
- Lavar los portaobjetos dos veces con agua destilada.
- Utilice el lápiz barrera hidrofóbica que encuentre todos los tramos de la diapositiva. A partir de este paso, añadir toda la solución preparada en el círculo para cubrir completamente las secciones.
- Tratar las secciones con hialuronidasa en una cámara húmeda a 37 ° C durante 30 min. El volumen de la solución (en pasos de 4,5 - 4,8) depende del tamaño de la sección. Utilice 50 l de solución para el cóndilo y 100 l para el hueso largo. Lavar con PBST (PBS que contiene 0,1% de Tween 20) tres veces.
- Preparar y aplicar la solución de bloqueo a cada sección y se incuba en una cámara húmeda durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Se incuban las secciones con primariasolución de anticuerpo (Runx2 de conejo anti-ratón o de conejo anti-ratón DMP1) a 4 ° C durante la noche. Lavar con PBS tres veces.
- Se incuban las secciones con solución de anticuerpo secundario (de cabra anti-conejo, Alexa Fluor 488) durante 2 horas a temperatura ambiente. Lavar con PBS tres veces.
- Limpiar el agua alrededor de la sección y soltar DAPI en el círculo para cubrir la sección en la diapositiva. Coloque con cuidado por la hoja de la cubierta.
5. Microscopía Confocal
- Captura de imágenes de células fluorescentes usando un microscopio confocal en longitudes de onda que van de 488 micras (verde) a 561 micras (rojo). Tomar varias imágenes apiladas a 200 Hz (dimensiones de 1.024 x 1.024) 19 utilizando 10X, 20X, 63X y lentes.
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Representative Results
Directamente condrocitos se transforman en células óseas (osteoblastos y osteocitos) en el cóndilo mandibular y hueso largo.
Aggrecan, un gen crítico para la condrogénesis, se expresa principalmente en los primeros y maduras condrocitos 18. Como resultado, la inyección de tamoxifeno a las 2 semanas de edad en Agg-Cre ERT2; Ratones Rosa26 tdTomato activan el reportero de color rojo-tomate en todos los condrocitos y sus células hijas. La línea 2.3Col1a1-GFP dio lugar a un color verde fluorescentes en el colágeno 1-expresión de las células óseas, específicamente los osteoblastos y pre-osteocitos. El color amarillo (rojo combinado con verde) indicó la presencia de células de hueso de condrocitos derivados que expresaban el gen de colágeno 1. En la Figura 2A, la mayoría de las células óseas en el proceso condilar debajo del cartílago eran rojos o Yellow (una célula roja que había comenzado a secretar verde fluorescente-COL1A1, apareciendo por lo tanto amarillo cuando se superponen los dos fluoróforos). Estos resultados proporcionan una fuerte evidencia de que estas células óseas se derivaron de los condrocitos. Resultados similares se observaron también durante el desarrollo de los huesos largos, donde la mayoría de las células óseas se deriva de los condrocitos, tanto en la epífisis (Figura 2B) y la metáfisis (Figura 2C).
Para investigar más a fondo estos resultados, cruzamos los ratones Col10al-Cre con Rosa26 tdTomato; Ratones 2.3Col1a1-GFP. Col10a1 es un marcador altamente específico para los HC, expresa sólo en los HC y sus descendientes. Por otra parte, Col10a1-Cre no es inducible, que refleja la diferenciación de células desde el inicio de la expresión Col10a1 (en E14.5). En las trabéculas cerca de la interfaz cartílago-hueso (nivel Superior) de 3 semanas de edad, ratones, rojo y scélulas fluorescentes amarillas ome fueron predominantes, mientras que las células fluorescentes verdes eran escasos. En una zona un poco más inferior (nivel medio), la mayoría de las células eran fluorescentes de color amarillo, con un poco menos de color rojo fluorescente. Las células fluorescentes verdes parecían dominar sólo en la zona más inferior de la apófisis condilar (nivel inferior) (Figura 3) .Esta tendencia indica que el crecimiento del cóndilo es aportado mayormente por las células óseas a transformado de HC. La distribución de las células fluorescentes rojas y verdes en el proceso condilar también es consistente con la dirección-inferior-a Superior de crecimiento condilar.
La técnica de rastreo de linaje de células demuestra claramente que la apoptosis no es el único destino para los HC. Tanto las líneas Agg-Cre ERT2 y Col10a1-Cre indican que las células de hueso de condrocitos derivados son la principal fuente para el desarrollo óseo en el proceso condilar y en la epífisisy la metáfisis de los huesos largos.
La aplicación conjunta de Inmunofluorescencia La tinción y Rastreo linaje celular Permite el control de la diferenciación celular.
La técnica de rastreo de linaje de células también se puede combinar con técnicas de inmunohistoquímica fluorescente para determinar el tipo de célula por la detección de un marcador específico de células. Este método tiene varias ventajas para el estudio del destino celular. En primer lugar, el investigador puede todavía definir las características de las células mediante la selección de marcadores apropiados, incluso sin la línea de GFP de ratón específico, que amplía la aplicación para el linaje de células rastreo técnica. En segundo lugar, se simplifica la generación de ratones compuestos. Por ejemplo, sólo tenemos que generar Agg-Cre ERT2; Los ratones compuestos rosa26 tdTomato para producir el color rojo después de la activación de Cre (en el día postnatal 3), en lugar de crear Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato ratones, lo que requiere más cruces.
En este estudio, hemos elegido dos anticuerpos para la tinción de inmunofluorescencia. Se opuso Runx2, un factor de transcripción crítico durante la maduración de osteoblastos (etapa temprana de células osteogénicas); la otra fue contra DMP1, expresada en osteocitos maduros (fase tardía de células osteogénicas). En la Figura 4, la fluorescencia verde representa la expresión de anticuerpos o Runx2 DMP1 en el 2-semanas de edad proceso condilar. En la Figura 4A, tres tipos de células de color en el hueso subcondral están presentes. El color amarillo (superposición de fluorescencia roja y verde) en el núcleo representa las células óseas de condrocitos derivados que expresan Runx2, lo que indica que estas células eran osteoblastos inmaduros en la superficie del hueso. Además, había-rojo fluorescente las células óseas que no expresan Runx2 (f rojoluorescence sin verde superpuesta). Estas células representan células óseas de condrocitos derivados de maduros en la matriz ósea. Las células fueron menos comunes los que sólo tienen núcleos-fluorescente verde, que indica las células óseas no derivados del condrocitos con expresión Runx2 o una transformación que se produjo antes de la activación de Cre. La imagen sugiere que las células óseas rojos y aquellos con núcleos amarillos fueron las poblaciones de células mayoría que contribuyen a la formación de hueso subcondral del cóndilo.
Por otra parte, casi todos, de células de médula de condrocitos derivados de rojo en la matriz ósea tenía tinción DMP1 alrededor de sus cuerpos celulares. Pocas osteocitos fueron positivos para DMP1 pero carecían de cuerpos de células rojas (Figura 4B). También hay dos explicaciones posibles para estas células: o son células óseas no condrocitos derivados de, o son células óseas de condrocitos derivados que transformaron antes de la inyección tamoxifeno. Además, no hay células óseas rojosen la superficie del hueso expresado DMP1, lo que indica que no se maduran osteocitos.
Tomados en conjunto, los datos de los patrones de expresión de tanto temprana (Runx2) y los marcadores de la fase tardía de (DMP1) de células osteogénicas fueron consistentes con el resultado anterior utilizando Cre combinado con 2.3Col1a1-GFP. Estos datos demuestran que la combinación de inmunofluorescencia y rastreo Rosa26 tdTomato es una buena manera de estudiar el destino celular. Más importante aún, los investigadores pueden distinguir el tipo de célula, identificar la etapa de diferenciación, y observar el número de células transformadas de forma simultánea mediante el uso de inmunofluorescencia con diferentes marcadores, lo que proporciona más información que Rosa26 tdTomato rastreo solo.
Figura 1. El Mecanismo de linaje celular Rastreo y THe Generación de los ratones compuestas. A) El sistema Cre-loxP se utiliza comúnmente en el rastreo de linaje. Cre escinde la secuencia de parada entre los dos sitios loxP, y la proteína tdTomato (fluorescencia roja) se expresa de forma permanente en la línea celular específica. B) Tres modelos animales se mencionan en este documento. Se utilizó 2,3 COL1A1-GFP; Ratones Rosa26 tdTomato y las cruzaron con ratones Col10a1-Cre. Col10a1-Cre no es inducible, que refleja la diferenciación de las células desde el comienzo de la expresión Col10a1 (en E14.5). C) Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) es otra línea Cre también se cruzó con 2.3Col1a1-GFP; Ratones Rosa26 tdTomato. Cre se activó a las 2 semanas de edad mediante una inyección tamoxifeno (Tm: tamoxifeno). D) Con el fin de combinar la inmunofluorescencia con trazado de linaje de células, hemos generado Agg-Cre ERT2; <em> ratones Rosa26 tdTomato, activan Cre en el día postnatal 3, y se realizó el Runx2 y DMP1 inmunofluorescencia (Tm: tamoxifeno). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. La transformación de condrocitos a las células óseas (osteoblastos y osteocitos) en el cóndilo mandibular y Long hueso utilizando Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Los ratones Compuesto rosa26 tdTomato. A) Cre se activó por el tamoxifeno en el día postnatal 14, y los ratones se sacrificaron a las 4 semanas de edad. Había tres celdas de color en el proceso condilar: rojo puro (células óseas de condrocitos derivados), amarillo (rojo combinado con el verde, lo que indica las células óseas de condrocitos derivados que expresaban el gen del colágeno 1), y verde puro (derivado no condrocitos células óseas con el gen del colágeno 1) . La mayoría de las células óseas en el proceso condilar debajo del cartílago eran de color rojo o amarillo puro (flechas blancas), mientras que pocas células óseas eran verdes (flechas azules). Estos datos proporcionan una fuerte evidencia de que los condrocitos transformar directamente en las células óseas y contribuyen a la formación del proceso condilar durante el desarrollo (Tm: tamoxifeno; C: cartílago; B: hueso). B, C) La mayoría de las células óseas en la epífisis y metáfisis se condrocitos-deriva (flecha blanca: las células óseas a condrocitos transformado en amarillo o rojo puro; la flecha azul: las células óseas no condrocitos derivados en verde puro; CA: articular cartílago; GP: placa de crecimiento).blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. La transformación de condrocitos a las células óseas en el cóndilo mandibular Usando Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Los ratones Compuesto rosa26 tdTomato. A) En el proceso condilar de ratones de 3 semanas de edad, las células óseas verdes eran una clara minoría en las trabéculas cerca de la interfase cartílago-hueso (nivel superior, a1), mientras que algunas células rojas y amarillas fueron predominantes. En el nivel medio (a2), células amarillas eran mayoría, con un poco menos de los glóbulos rojos. Células verdes parecían estar en la mayoría sólo en la zona más inferior (a3). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. La co-localización de dos marcadores de células osteogénicas con el fondo Linaje de trazado en el cóndilo medio de 2 semanas de edad Agg-Cre ERT2; rosa26 tdTomato Los ratones compuestos. A) El color amarillo en los núcleos representa las células óseas de condrocitos derivados que expresan Runx2 (flechas blancas) en la superficie del hueso trabecular debajo del cartílago del cóndilo. Las células óseas rojos puros sin expresión Runx2 representan células óseas de condrocitos derivados de maduros en la matriz ósea (flechas amarillas). el fewest células fueron aquellos que transporte únicamente núcleos verdes, que representa las células óseas o bien no condrocitos derivados o células óseas transformadas a partir de condrocitos antes de la activación Cre (Tm: tamoxifeno). B) En el hueso trabecular debajo del cartílago del cóndilo, casi todas las células del hueso de condrocitos derivados de rojo en la matriz ósea realiza tinción DMP1 alrededor de sus cuerpos de células (flechas blancas). Sólo unos pocos de los osteocitos fueron positivos para DMP1 pero carecían de color rojo en sus cuerpos celulares (flechas amarillas). Hay dos posibilidades para estas células: las células óseas no condrocitos derivados de células óseas o condrocitos derivados de derivados antes de la inyección tamoxifeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Debido a las limitaciones tecnológicas, siempre es difícil de investigar el comportamiento de las células in vivo. Sin embargo, la técnica de rastreo de linaje celular está demostrando ser una herramienta poderosa para el estudio de la biología celular 7-9. En este estudio, podemos mejorar aún más este protocolo mediante la combinación con inmunofluorescencia. De esta manera, el destino celular puede ser definido por múltiples marcadores relacionados, que amplía la aplicación de rastreo de linaje. Por otra parte, esta co-localización de la señal de inmunofluorescencia y tomate muestra simultáneamente el número de progenie de la célula fundadora, su ubicación y su estado de diferenciación, que proporciona más información que la línea celular de rastreo solo. Además, el uso de marcadores específicos de células puede simplificar la generación de ratones compuestos, la aceleración de la investigación.
La especificidad de la CRE es fundamental para la atribución inequívoca de linaje y la exactitud de los resultados 20,21. Es muy importante para seleccionar las líneas de Cre apropiadas para verificar el destino celular. En este estudio, hemos elegido Col10a1, ya que se considera un marcador específico de condrocitos hipertróficos 10,11, y agrecano, porque también es un bien reconocido marcador de condrocitos 18. También hay buenos modelos Cre utilizados en otros campos. La línea Scleraxis-Cre (SCX-Cre), por ejemplo, es útil en el tendón y ligamento investigación desde scleraxis es un factor de transcripción hélice-bucle-hélice básico que es un marcador para el tendón y ligamento linaje celular 22. Otra Cre llama DMP1-Cre se utiliza comúnmente en estudios skeleton- y relacionados con el diente porque DMP1 es altamente expresado en odontoblastos y osteocitos 23,24.
En comparación con los sistemas Cre no inducibles, la activación de inducible Cre puede limitarse espacialmente y temporalmente 20. Sin embargo, algunas limitaciones deben ser considerados en el diseño del experimento y la interpretación de los resultados demodelos Cre inducible. En primer lugar, la dosis de tamoxifeno puede cambiar la eficiencia de la activación de Cre y el número de células marcadas. Las dosis bajas etiquetarán la población de interés a una densidad clonal 25; Las dosis altas pueden etiquetar todo el reservorio progenitor 7,26. Por lo tanto, la dosis debe ser seleccionada dependiendo de la finalidad del experimento. En segundo lugar, el tamoxifeno tiene una toxicidad potencial, especialmente en dosis altas 27,28. Por esta razón, es mejor disminuir la dosis para evitar los abortos tardíos cuando se inyecta durante el embarazo 29.
En conclusión, la co-aplicación de técnicas de trazado de linaje celular y de inmunofluorescencia es una herramienta poderosa para la investigación de biología celular in vivo. En el futuro, los investigadores pueden intentar realizar simultáneamente inmunofluorescencia con dos anticuerpos diferentes sobre el fondo de la señal de tomate. Este método puede mostrar el patrón de expresión de dos marcadores en una sección, por lo que es más fácil para elinvestigador para comparar y analizar los resultados. Por otra parte, este co-aplicación puede mejorarse aún más en inmunofluorescencia in situ para reducir la tinción no específica que puede existir a través de inmunofluorescencia convencional.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
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- Kronenberg, H. M.
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