Summary
Immünofloresan ile (osteoblastlar özgü) 2.3Col1a1-GFP ile diğeri (kemik hücrelere özgü): İki / Cre fareler (özellikle kondrosit olarak ifade edilmiştir) (her yerde her zaman bütün hücrelerde ifade edilmiştir) Rosa26 tdTomato kombinasyonları izleme grupları geliştirdi. veri kemik hücrelerine kondrosit doğrudan dönüşümünü göstermektedir.
Abstract
Hücre soyu izleme sistemi gelişim biyolojisi çalışmalarında ağırlıklı olarak kullanılmıştır. Cre rekombinazın kullanımı belirli bir hücre çizgisi ve döl muhabir aktivasyonu için izin verir. Burada, kondrositler doğrudan uzun kemik ve Cre, Col10a1-Cre ve Agrekanın-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) iki çeşit kullanarak mandibular kondil gelişimi sırasında osteoblast ve osteositleri dönüşme olduğunu göstermek için teknik izleme hücre soyu kullanılan Rosa26 ile geçti tdTomato. Col10 ve Agrekanın Hem kondrositlerin için belirteçleri iyi tanınmaktadır.
Bu temelde, belirli hücre belirteçleri ifadesini analiz ederek floresan immünohistokimya-tanımlamak hücre kaderi ile birlikte izleme yeni bir yöntem hücre soyu geliştirdi. Runx2 (erken evre osteojenik hücreler için bir işaret) ve dentin matrisi protein1 (DMP1ve, geç evre osteojenik hücreler için bir işaret) idikondrosit türetilmiş kemik hücreleri ve bunların farklılaşma durumunu tanımlamak için kullanılan. Bu kombinasyon, hücre soyu izleme uygulaması genişletir, ama aynı zamanda bileşik farelerin nesil kolaylaştırır sadece. Daha da önemlisi, ana hücre döl sayısı, yeri ve farklılaşma durumları yalnız izleme hücre soyu daha fazla bilgi sağlayan, aynı anda görüntülenir. Sonuç olarak, hücre soyu takip teknikleri ve immünofloresan birlikte uygulamaya in vivo olarak, hücre biyolojisi araştırmak için güçlü bir araçtır.
Introduction
gelişimi sırasında, endokondral kemik oluşumu iskelet hacmi% 80'inden sorumludur. Yaygın olarak hipertrofik kondrositlerin apoptozu ile başlar inanılmaktadır. Daha sonra, altta yatan kemik iliği hücreleri istila ve kemik iliği ve periost kökenli hücreler 1,2 yeni kemik birikimi ile takip anjiyogenezi başlatmak. Hipertrofik kondrositlerin hücre kaderi (HC), ancak, yıllardır 3 tartışma konusu olmuştur. Başlangıçta, HCS kondrosit farklılaşması yolunun sonu olarak kabul edildi ve apoptoz genellikle HCS nihai kaderi olduğu düşünülmüştür. Şimdi, bazı araştırmacılar en azından bazı HCS hayatta olabilir ve endokondral kemik oluşumuna katkıda bulunduğunu göstermektedir. O büyümeyi önerdi rağmen plaka kondrositler ultrastrüktürdeki, immünohistokimyasal dayalı osteoblast içine transdifferentiate yeteneği vardı ve in vitro, 46 bu yöntemlerin w hiçbiri çalışmalarıosteoblast soy kondrosit katkı gösteren kesin ere.
Hücre soyu izleme tekniği hücre kaderi incelemek için daha titiz bir yol sağlar. Kısaca söylemek gerekirse, sadece spesifik bir hücre türü ifade edilen bir yeniden bağlayıcı enzim, bildirici genin ekspresyonunu uyarır. Bu şekilde, bu hücrenin tipi ve onların soyundan kalıcı 7 etiketlenir. Cre-loxP sistemi yaygın soy izleme kullanılır. Cre (rekombinaz enzim) iki loxP siteleri arasında DUR dizisi tüketim ve belirli bir hücre hattı (Şekil 1A) 'de muhabir aktive eder. Bazı durumlarda, araştırmacı, östrojen reseptörü (Cre ERT2) 8 modifiye edilmiş bir formu kaynaşmaya Cre neden tamoksifen gibi bir ilaç ile Cre aktif hale getirmek için uygun bir zaman noktası seçebilir. Floresan gazeteciler onlar dramatik karmaşıklığını azaltmak için deneyler izleme soy standart haline gelmiştirve 8,9 izleme hücre kaderinin doğruluğunu ve verimliliğini artırmak. bunun kolayca 7 (Şekil 1A) görüntülenmiştir yapma, parlak floresan proteini ve güçlü Epifloresans beri tdTomato floresan gazetecilere arasında en iyi seçenek haline geliyor.
Sistem izleme Rosa26 tdTomato soy kullanarak, grubumuz ve diğer araştırmacılar HCS gelişimi 10-14 esnasında kemik hücreleri içine fenotip değiştirebilir göstermiştir. 2.3Col1a1-GFP (osteoblastlar özgü) ile bağışıklık fluorışıması (kemik hücrelere özgü): Bunu yapmak için, Rosa26 tdTomato (her yerde ifade, tüm hücrelerde) / Cre (kondrosit özgü) fareler ile kombinasyonlar izleme iki set geliştirdi. Veri iki yolun in vivo hücre kaderine çalışma uygulanabilir yollar olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm protokoller gözden ve Teksas A & Diş Hekimliği M University College'da Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
1. Hayvan Yetiştiriciliği
- Bu çalışmada, üç hayvan modelleri kullanarak. İlk kullanım Col10a1-CRE 15 fareler kondil oluşumunda embriyonik kondrositlerin kaderi araştırmak ve Rosa26 tdTomato onları geçmeye (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) farelerde Col10a1- elde etmek için Cre ve Rosa26 tdTomato fareler. Daha sonra, 2.3Col1a1-GFP uygulanan farelerden 16 bu fareler çapraz. Col10a1-Cre kullanın; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP fareler hücre soyu izleme deneyleri (Şekil 1B) gerçekleştirmek için.
- Doğum sonrası kondrosit kaderini incelemek için, adım 1.1 gibi aynı prosedürü izleyin, ama Agrekanın-CRE ERT2 (Agg-Cre ERT2 kullanmak) 17,18 hattı ve Agg-Cre ERT2 tutmak; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP fareler hücre soyu izleme deneyleri (Şekil 1C) gerçekleştirmek için. doğum sonrası 14. günde tamoksifen enjekte edilir.
- Immünofloresan ile teknik izleme hücre soyu birleştirmek için, Agg-Cre ERT2 fareler ve Rosa26 tdTomato fareler çapraz. Deneyde her iki geni taşıyan fareler kullanın ve doğum sonrası 3. günde (Şekil 1D) üzerine tamoksifen enjekte edilir.
2. Malzeme hazırlanması
- 10 mg / ml'lik bir konsantrasyonda% 10 etanol ve% 90 mısır yağı içinde tamoksifen toz eritilir. Enjeksiyon için bir dozaj, 75 mg / kg'dır.
- 7.4 pH değerini ayarlamak için 2M sodyum hidrat kullanılarak,% 4'lük bir konsantrasyona PBS içinde paraformaldehit (PFA) toz içinde çözülür. Kurban sonra doku (mandibular kondil ve arka bacak burada kullanılan) düzeltmek için% 4 PFA çözüm kullanın. Çünkü onuntoksisite, eldiven ve yüz maskesi ile kaputun içindeki PFA anlaştım.
- 7.4 pH değerini ayarlamak için 2M sodyum hidrat kullanılarak,% 10 bir konsantrasyona damıtılmış su içinde EDTA toz eritilir. Mandibular kondil ve arka bacak kirecini% 10 EDTA kullanın.
- % 15 ve% 30 arasında konsantrasyonlarda PBS içinde sükroz toz eritilir. yumuşatma sonra doku kurutmak için sukroz çözümü kullanın.
- 2 mg / ml, pH 5.0 bir konsantrasyonda PBS içinde hyaluronidaz toz eritilir. Bu çözüm immünofloresan antijen alımı içindir.
- Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 3 sığır serum albümini (BSA) ve% 20 keçi serumu içeren bir bloklama solüsyonu hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanın.
- Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 2 keçi serumu ihtiva eden bir birincil antikor bir çözelti hazırlamak için 1.5 ml tüp kullanın. Runx2 400 ve 1: 100 DMP1ve için primer antikor konsantrasyonu, 1'dir.
- hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanarakYanlış pozitif sonuçlardan kaçınmak için immunofluorescent boyama kontrol olarak tavşan IgG çözüm. Çözelti PBS içinde% 2 keçi serumu içerir. Runx2 kontrolü için tavşan IgG konsantrasyonu 1: 400; 100: DMP1ve, 1. Aynı anda deney ve kontrol boyama yapın.
- Runx2 ya DMP1ve immünofloresan boyama PBS içinde% 2 keçi serumu ihtiva eden bir ikincil antikor çözeltisi hazırlamak için, 1.5 ml tüp kullanın. 500: 1 bir seyreltmede ikincil antikor kullanın.
3. Slayt Konfokal Mikroskopi Hazırlık (Sadece izleme Hücre Lineage, İmmünofloresan ile hiçbir Kombinasyon)
- Olumlu bir zaman noktasında Agg-CRE ERT2 farelerde tamoksifen enjekte edilir.
- İlk olarak, kafes fare kaldırın. Ardından, karın açığa farenin arkasındaki deriyi kapmak ve ters çevirin sol başparmak ve işaret parmağınızı kullanın. şırıngayı tutmak için sağ elinizi kullanın. Enjeksiyon için uygun bir giriş noktası L verildieft veya hypogastrium sağ tarafında, karaciğer ve mesane kaçınarak.
- fare arka ayakları şırınga paralel tutun ve intraperitoneal enjekte. Enjeksiyon için bir dozaj, 75 mg / kg'dır. sırasıyla 18 g - 9 g, 11 - - 13 g, 16 2 hafta, 3 hafta, ve eski 4 haftalık yaşlarda faresinin ağırlıkları yaklaşık 7'dir.
- Bir Xylazine / Ketaset kombinasyonu ile fareler anestezi.
- çalışma çözeltisi hazırlamak için, ilk olarak sırası ile, 1 mg / ml ve 5 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar damıtılmış su ile iksilazin ve Ketaset seyreltin. 2 oranında: Sonraki, bir 1 ketamin ve Ketaset karıştırın. Enjeksiyon için bir dozaj 30 ul / g'dır.
- Adım 3.1 olarak enjekte edilir. Farenin bileğini kısma anesthetization onaylayın. o hiçbir tepki varsa fare bilinçsiz olduğunu.
- anesthetization sonra% 4 PFA ile fareler serpmek.
- Fare bilincini kaybeder sonra entirel bir gemide fare dört bacağı düzeltmeky karın maruz kalmaktadır.
- % 70 etanol ile karın doyurmak ve orta hat boyunca boyun alt karın bir eksizyonu yapmak. periton zarı ortaya çıkarmak için yan taraflarına cilt çekin aynı anda çimdik ve. uzunlamasına eksizyon yapmak için diseksiyon makas kullanın.
- kesiniz ve kalp maruz ön kaburga kaldırın. Sağ kulak kepçesi bir yuvayı kesmek aynı zamanda, bir 22 G şırınga ile sol ventrikül kalbi delinme şırıngayı tutun ve.
- Yavaş yavaş kardiyovasküler sistem üzerinde perfüze% 4 PFA, enjekte ederken sağ kulak kepçesi gelen kesme dışında kan basması. perfüzyon için PFA hacmi 1 ml / gramdır. Sert-Kanallı bina egzoz sistemine bir Sınıf I biyogüvenlik kabini içinde bu adımı gerçekleştirin.
- fare deri soyulabilir ve 4 ° C'de gece boyunca düzeltmek için% 4 PFA içinde 40 ml içeren 50 ml'lik polipropilen santrifüj tüpü içine bütün vücudu koydu.
- dikkatle vücuttan çene ve arka bacak kaldırmak için diseksiyon makas ve # 3 ve # 5 forseps kullanabilir ve yüzeyde kasları ve tendonları kaldırmak için. Sert-Kanallı bina egzoz sistemine bir Sınıf I biyogüvenlik kabini içinde bu adımı gerçekleştirin.
- Üçüncü molar distal bölgede iki parçaya mandibula kesin. Benzer şekilde, decalcification hızlandırmak amacıyla kemik iliği boşluğuna maruz orta cisim olarak femur ve tibia kesti. kondil ve kondiler işlemi kapsamaktadır parçası koymak ve% 10 EDTA, 40 ml arka bacak ile birlikte 2, 4 ° C'de kirecini göre - 50-ml polipropilen santrifüj tüpüne 4 gün.
- 50 ml polipropilen santrifüj tüpüne 4 ° C'de kondil ve gece boyunca arka bacak kurutmak için% 15 sakroz, 50 ml kullanın.
- 50 ml polipropilen santrifüj tüpü içinde gece boyunca 4 ° C'de kondil ve arka bacak kurutmak için% 30 sakroz kullanın.
- sagital düzlem boyunca, örnek ile gömmekcryosection makinesinde kesici plaka Ekim
- Yatay kondili veya montaj kalıp içinde arka bacak yatıyordu. OCT doku Batmak ve Ekim donuyor kadar cryosection makinede bırakın.
- Kesme plaka üzerinde Ekim bloğu monte edin. Ekim tamamen donmuş olduğundan emin olmak için kesme işleminden önce yaklaşık 15 dakika boyunca bekleyin.
- 10 mikron bölüme kondili ve arka bacak kesti. -20 ° C'de slaytlar ve mağaza bölümleri toplayın.
- boyama önce suyu çıkarmak için 37 ° C'lik bir oda içinde slayt inkübe edin.
- 5 dakika için damıtılmış su ile iki kez slaytlar yıkayın.
- Her bölümde etrafında suyu siliniz. bölümleri daire ve çember içine DAPI veya non-floresan anti-solmaya montaj çözümü düşmesi hidrofobik bir bariyer kalem kullanın. Dikkatle kapak kayma uzandı.
Runx2 ve DMP1ve 4. İmmünohistokimyasal Boyama
NOT: IgG conimmünohistokimyasal yanlış pozitif sinyaller önlemek için kumanda gereklidir. Deney ve kontrol grupları için boyama aynı anda yapılması gerekmektedir.
- boyama önce suyu çıkarmak için 37 ° C'lik bir oda içinde slaytlar inkübe edin.
- damıtılmış su ile iki kez slaytlar yıkayın.
- slayt tüm bölümleri daire için hidrofobik bariyer kalem kullanın. Bu adımdan itibaren, tamamen bölümleri kapsayacak şekilde daire içine hazırlanmış çözümün bütün ekleyin.
- 30 dakika boyunca 37 ° C'de nemli bir oda içinde hyalüronidaz bölümleri tedavi edin. (Adım 4.5 - 4.8) çözeltisinin hacmi bölümün boyutuna bağlıdır. Uzun kemik kondilin için çözelti 50 ul ve 100 ul kullanın. (% 0.1 içeren PBS Tween 20) ile PBST ile üç kez yıkanır.
- Hazırlama ve her bölüm için engelleme çözeltisi uygulanır ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle nemli bir oda içinde inkübe.
- Primer ile bölümleri inkübegece boyunca 4 ° C 'de antikor çözeltisi (tavşan anti-fare Runx2 ya tavşan anti-fare DMP1ve). PBS ile üç kez yıkayın.
- Oda sıcaklığında 2 st için ikincil antikor çözeltisinin (keçi anti-tavşan, Alexa Fluor 488) sahip olan kısımlar inkübe edin. PBS ile üç kez yıkayın.
- bölümünde etrafında suyu siliniz ve slayt bölümü kapsayacak şekilde çember içine DAPI bırakın. Dikkatle kapak kayma uzandı.
5. Konfokal Mikroskop
- 488 mikron (yeşil) den 561 um (kırmızı) arasında değişen dalga boylarında bir konfokal mikroskop kullanılarak floresan hücre görüntüleri yakalayabilir. 10X, 20X ve 63X lensler kullanarak 19 200 Hz birden yığılmış görüntü almak (1.024 × 1.024 boyutları).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kondrositler Doğrudan mandibular ve Uzun Kemik Kemik Hücrelerinin (Osteobalstlar ve osteositlerde) içine Transform.
Agrekan, kondrojenez için kritik bir geni, ağırlıklı olarak, erken ve olgun kondrositler 18 olarak ifade edilir. Bunun bir sonucu olarak, Agg-Cre ERT2 bölgesindeki 2 haftalık tamoksifen enjeksiyonu; Rosa26 tdTomato fareler tüm kondrosit ve kızları hücrelerinde kırmızı domates muhabiri aktif. 2.3Col1a1-GFP hattı kemik hücrelerini, özellikle osteoblast ve ön osteosit 1 eksprese eden kolajen bir yeşil floresanlama renge yol açmıştır. Sarı renk (yeşil ile birlikte kırmızı), kolajen 1 genini ifade kondrosit türetilmiş kemik hücrelerinin mevcudiyetine işaret etmiştir. Şekil 2A, kıkırdak altındaki kondiler sürecinde kemik hücrelerinin çoğu kırmızı ya da y edildiellow (COL1A1 yeşil fluoresan iki fluorophores üst üste zaman bu suretle sarı görünen salgılamak başlamıştı bir alyuvar). Bu sonuçlar kemik hücreleri kondrosit elde edilmiştir dair güçlü kanıtlar sunmuştur. Benzer sonuçlar, ayrıca, kemik hücrelerinin çoğunluğunun epifiz (Şekil 2B) ve metafiz (Şekil 2C), hem de kondrositler elde edilmiştir uzun kemik gelişimi sırasında gözlenmemiştir.
Ayrıca bu sonuçları araştırmak için, Rosa26 tdTomato ile Col10al-Cre fareler geçti; 2.3Col1a1-GFP uygulanan farelerden. Col10a1 HCS oldukça spesifik bir işaretleyici sadece HCS ve soyundan gelenler olarak ifade edilir. Ayrıca, Col10a1-Cre (E14.5 at) Col10a1 ifade başından itibaren hücre farklılaşması yansıtan, sigara indüklenebilir. 3 haftalık fareler, kırmızı ve s kıkırdak-kemik arayüzü (üstün seviye) yakın trabeküllerindeyeşil fluoresan hücreler kıt iken ome sarı floresan hücreleri, baskın idi. biraz daha alt alana (orta seviye), hücrelerin çoğunluğu biraz daha az fluoresan kırmızı, sarı fluoresan idi. Yeşil fluoresan hücreler eğilim kondiler büyüme çoğunlukla HCS'den dönüştürülmüş kemik hücreleri tarafından katkıda olduğunu gösterir .Bu sadece kondiler süreci (alt seviye) (Şekil 3) en alt bölgesinde hakim olduğu ortaya çıktı. kondiler işleminde kırmızı ve yeşil floresanlama hücreleri dağılımı da kondiler büyüme alt-to-üstün bir yönü ile tutarlıdır.
Hücre soyu izleme tekniği açıkça apoptoz HCS sadece kader olmadığını göstermektedir. Hem Agg-Cre ERT2 ve Col10a1-Cre hatları kondrosit kaynaklı kemik hücreleri kondiler sürecinde kemik gelişimi için ve epifiz önemli bir kaynak olduğunu göstermektedirve uzun kemikte metafiz.
Immunofluorescent Boyama ve Hücre Lineage Takip Eş-başvuru Hücre Farklılaşma Takip sağlar.
Hücre soyu takip teknik, hücreye özel markörün saptanması hücre tipini belirlemek için flüoresan immünohistokimya ile kombine edilebilir. Bu yöntem, hücre kaderin çalışma için birçok avantajı vardır. İlk olarak, araştırmacı dahi tekniği izleme hücre soyu için uygulamayı genişleten özel GFP fare hattı olmadan, uygun belirteçler seçerek hücre özelliklerini tanımlayabilirsiniz. İkinci olarak, bu bileşik, farelerin oluşturulması kolaylaştırır. Örneğin, sadece Agg-Cre ERT2 üretmek gerekiyor; Rosa26 tdTomato bileşik fareler yerine Agg-Cre oluşturma, (doğum sonrası 3. günde) Cre etkinleştirdikten sonra kırmızı renk elde etmekERT2; 2.3Col1a1-GFP; Daha fazla haç gerektirir Rosa26 tdTomato fareler.
Bu çalışmada, immünofloresan boyama için iki antikor seçtik. Bir Runx2, osteoblast olgunlaşması sırasında kritik bir transkripsiyon faktörü (osteojenik hücrelerin erken evre) karşıydı; Diğer, DMP1ve karşı olduğunu olgun osteositleri (osteojenik hücrelerin geç evrede) olarak ifade edilmiştir. Şekil 4'te, yeşil floresan 2 haftalık kondil işlemde Runx2 ya DMP1ve antikor ekspresyonunu temsil eder. Şekil 4A'da, subkondral kemiğe renkli üç hücre tipi mevcuttur. çekirdeğinde san renkli (kırmızı ve yeşil flöresan üst üste binmesi) kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini, Runx2 eksprese Bu hücreler kemik yüzeyi üzerinde, olgunlaşmamış osteoblastlar olduğunu gösteren temsil eder. Buna ek olarak, kırmızı-floresanlama Runx2 ifade vermedi kemik hücreleri (kırmızı f vardıüst üste yeşil olmadan luorescence). Bu hücreler kemik matriks içinde olgun kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil etmektedir. En yaygın hücreler Runx2 ifadesi veya Cre aktivasyon önce meydana gelen bir dönüşüm olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini gösteren sadece yeşil-fluoresan çekirdekleri olanlar vardı. görüntü kırmızı kemik hücreleri ve sarı çekirdekleri olan kondil subkondral kemik oluşumuna katkıda çoğunluk hücre popülasyonları olduğunu göstermektedir.
Öte yandan, kemik matriks içinde hemen hemen her kırmızı, kondrosit türetilmiş kemik hücresi kendi hücre gövdeleri etrafında DMP1ve boyama vardı. Birkaç osteositlerde DMP1ve pozitifti ancak kırmızı hücre gövdeleri (Şekil 4B) yoktu. Orada, bu hücreler için iki olası açıklama, aynı zamanda: ya da olmayan, kondrosit türetilmiş kemik hücreleri, ya da tamoksifen enjeksiyondan önce dönüştürülmüş kondrosit türetilmiş kemik hücrelerdir. Buna ek olarak, hiç bir kırmızı kemik hücrelerikemik yüzeyi üzerinde de osteosit olgun olmayan belirten, DMP1ve ifade edilmiştir.
Birlikte ele alındığında, her iki başları (Runx2) ve geç evre belirteçleri (DMP1ve) osteojenik hücre için ekspresyon modelleri veri 2.3Col1a1-GFP ile birlikte Cre kullanarak önceki sonuçlarla uyumluydu. Bu veriler immunfloresan ve Rosa26 tdTomato izleme kombinasyonu hücre kaderi incelemek için iyi bir yol olduğunu göstermektedir. Daha da önemlisi, araştırmacılar, hücre tipini ayırt farklılaşma aşamasını tanımlamak ve Rosa26 tdTomato yalnız izleme daha fazla bilgi sağlar farklı belirteçleri ile immünofloresan kullanarak aynı anda dönüştürülmüş hücre sayıları gözlemleyebilirsiniz.
Şekil 1. Hücre Lineage İzleme ve inci için MekanizmasıBileşik Fare e Üretimi. A) Cre-loxP sistemi yaygın soy izleme kullanılır. Cre, iki loxP siteleri arasında DUR sekansı ve kalıcı belirli bir hücre hattı içinde ilave edilir tdTomato proteini (kırmızı fluoresan) özel Tüketim vergisi. B) Üç hayvan modelleri bu yazıda belirtilmiştir. Biz 2.3 COL1A1-GFP kullanılan; Rosa26 tdTomato fareler ve Col10a1-Cre fare ile onları geçti. Col10a1-Cre (E14.5 at) Col10a1 ifade başından itibaren hücre farklılaşması yansıtan, sigara indüklenebilir. C)-Agrekanın Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) da 2.3Col1a1-GFP ile geçti başka Cre çizgidir; Rosa26 tdTomato fareler. (: Tamoksifen Tm) Cre bir tamoksifen enjeksiyon ile 2 haftalık aktive edildi. Hücre soyu izleme ile immünofloresan birleştirmek amacıyla D), biz Agg-Cre ERT2 oluşturulan; <em> Rosa26 tdTomato fareler, doğum sonrası 3. günde Cre aktive ve Runx2 ve DMP1ve immünofloresan gerçekleştirilen (Tm: tamoksifen). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Agg-Cre ERT2 kullanma Mandibular Kondilin ve Uzun Kemik Kemik Hücrelerinin (Osteobalstlar ve osteositlerde) için kondrosit dan Dönüşüm; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) Cre doğum sonrası 14. günde, tamoksifen ile aktive edildi ve fareler 4 haftalıkken kurban edildi. Üç renkli hücreler vardı kondiler süreci: saf kırmızı (kondrosit kaynaklı kemik hücreleri), sarı (yeşil ile kombine kırmızı, kollajen 1 genini ifade kondrosit türetilmiş kemik hücrelerini gösteren) ve saf yeşil (kolajen 1 geni olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücreleri) . Birkaç kemik hücreleri yeşil (mavi oklar) iken kıkırdak altındaki kondiler sürecinde kemik hücrelerinin çoğu, sarı ya da saf kırmızı (beyaz oklar) idi. (:; C tamoksifen: kıkırdak, B: Kemik Tm) Bu veriler, güçlü doğrudan gelişimi sırasında kondil sürecin oluşmasında kemik hücrelerine dönüştürmek ve katkı kondrositler kanıt sağlar. B, C) epifiz ve metafiz kemik hücrelerinin çoğunluğu (beyaz ok kondrosit-elde edildi: sarı veya kırmızı saf kondrosit-dönüştürülmüş kemik hücreleri, mavi ok: yeşil saf olmayan kondrosit kökenli kemik hücreleri; AC: artiküler kıkırdak; GP: büyüme plağı)."Blank> Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Col10al-Cre kullanarak mandibular kemik hücreler için kondrosit dan Dönüşüm 3. Şekil; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) 3 haftalık farelerden alınan kondiler sürecinde, yeşil kemik hücreleri ayrı bir kıkırdak-kemik arayüzü yakın trabeküllerinde azınlık (üstün seviye, a1), kırmızı ve bazı sarı hücreler baskın oysa idi. Orta düzeyde (a2) 'de, sarı hücreler hafifçe daha az kırmızı hücreleri ile, çoğunluk vardı. Yeşil hücreler sadece en alt bölgede çoğunluk olduğu ortaya çıktı (a3). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. 2 haftalık Agg-Cre ERT2 kullanma Kondiler Sürecinde Lineage-tracing arka plan ile osteojenik hücreler için iki belirteçlerinin Eş-lokalizasyonu; Rosa26 tdTomato Bileşik fareler. A) çekirdeklerinde san renkli kondil kıkırdak altındaki trabeküler kemik yüzeyindeki Runx2 (beyaz oklar) ifade kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil eder. Runx2 ifade olmadan saf kırmızı kemik hücreleri kemik matriksi (sarı oklar) olgun kondrosit türetilmiş kemik hücreleri temsil etmektedir. fewest hücreleri Cre aktivasyonu (: tamoksifen Tm) önce kondrosit gelen ya non-kondrosit türetilmiş kemik hücreleri ya da dönüştürülmüş kemik hücrelerini temsil eden tek yeşil çekirdekleri taşıyan olanlar vardı. B) kondil kıkırdağının altındaki trabeküler kemik kemik matrisinde hemen hemen her kırmızı kondrosit türetilmiş kemik hücresi hücre gövdeleri (beyaz oklar) etrafında DMP1ve boyama taşıdı. osteositleri Sadece birkaç DMP1ve için pozitif ama onların hücre gövdeleri (sarı oklar) kırmızı renk yoktu. Tamoksifen enjeksiyonundan önce ortaya çıkan olmayan kondrosit türetilmiş kemik hücreleri veya kondrosit kökenli kemik hücreleri: Bu hücreler için iki olasılık vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Teknolojik sınırlamalar nedeniyle, in vivo hücre davranışlarını araştırmak için her zaman zordur. Ancak, hücre soyu izleme tekniği hücre biyolojisi 7-9 çalışmak için güçlü bir araç olduğunu gösteriyor. Bu çalışmada, biz daha fazla immünofloresan ile birleştirerek bu protokolü geliştirmek. Bu şekilde, hücre kaderi soyu izleme uygulaması genişletmektedir birden çok ilişkili markörler tarafından tanımlanabilir. Ayrıca, immünofloresan ve domates sinyalinin bu co-lokalizasyon aynı anda yalnız izleme hücre soyu daha fazla bilgi sağlayan, kurucu hücresi, konumlarını ve onların farklılaşma durumunu döl sayısını gösterir. Buna ek olarak, hücreye özel markörlerin kullanımı araştırma hızlandırılması bileşik farelerin oluşturulması basitleştirebilir.
Cre özgünlüğü soyunun kesin atıf ve sonuçları 20,21 doğruluğu için çok önemlidir. Çok imHücre kaderi doğrulamak için uygun Cre satırları seçmek için nem li. Ayrıca, kondrositler 18 için iyi bilinen markör olduğu için, hipertrofik kondrosit 10,11 ve agrekan için spesifik bir işaretçi olduğu düşünülür, bu çalışmada, Col10a1 seçtik. diğer alanlarda kullanılan iyi Cre modelleri de vardır. Scleraxis tendon ve bağ hücre soyu 22 için bir gösterge olan bir temel Heliks-halka-helis transkripsiyon faktörü olduğu Scleraxis-Cre (SCX-Cre) hattı, örneğin, tendon ve bağ araştırmaları faydalıdır. Başka Cre DMP1ve yüksek odontoblast ifade ve 23,24 osteositlerde çünkü DMP1ve-Cre yaygın skeleton- ve diş ile ilgili çalışmalarda kullanılan çağırdı.
Olmayan uyarılabilir Cre sistemlerle karşılaştırıldığında, uyarılabilir Cre aktivasyonu mekansal ve zamansal 20 kısıtlanabilir. sonuçlarını deney tasarımı ve yorumlama Ancak, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdıruyarılabilir Cre modelleri. İlk olarak, tamoksifen dozu Cre aktivasyon verimliliği ve işaretli hücrelerin sayısı değişebilir. Düşük dozlar klonal yoğunlukta 25 de ilgi nüfusu etiketleyecektir; yüksek dozlarda tüm progenitör havuzu 7,26 etiket olabilir. Bu durumda, doz deneyinin amacına bağlı olarak seçilmelidir. İkinci olarak, tamoksifen, özellikle yüksek dozlarda 27,28 potansiyel toksisitesi vardır. Bu nedenle, gebelikte 29 sırasında enjekte ederken geç dönem kürtaj önlemek için doz azaltmak için daha iyidir.
Sonuç olarak, hücre soyu takip teknikleri ve immünofloresan birlikte uygulamaya in vivo olarak, hücre biyolojisi araştırmak için güçlü bir araçtır. Gelecekte, araştırmacılar aynı anda domates sinyal arka plan üzerinde iki farklı antikorları ile immünofloresan gerçekleştirmek için deneyebilirsiniz. Bu yöntem daha kolay hale bir bölümünde iki belirteçleri için ifade desenini gösterebilirAraştırmacı karşılaştırmak ve sonuçlarını analiz etmek. Ayrıca, bu yardımcı uygulaması daha geleneksel immüno-floresan yoluyla bulunabilir özel olmayan renklenme azaltmak için in situ imünofloresansta iyileştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M.
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P.
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al.
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
