Summary
פיתחנו שני סטים של התחקות ושילובים tdTomato Rosa26 (הביע בכל מקום בגוף בכל התאים) / Cre (לידי ביטוי במיוחד chondrocytes) עכברים: אחד עם 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ואחד עם immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים ממחישים את השינוי הישיר של כונדרוציטים לתוך תאי עצם.
Abstract
מערכת התחקות שושלת התא נעשתה שימוש בעיקר במחקרים בביולוגיה התפתחותית. שימוש recombinase Cre מאפשר ההפעלה של כתב קו תאים ספציפי וכל הצאצאים. הנה, השתמשנו שושלת תא התחקות טכניקה על מנת להוכיח כי chondrocytes ישירות להפוך אוסטאובלסטים ו osteocytes במהלך עצם ארוך ופיתוח condyle mandibular באמצעות שני סוגי Cre, Col10a1-Cre ו Aggrecan-Cre ERT2 (AGG-Cre ERT2), חצה עם Rosa26 tdTomato. שניהם Col10 ו aggrecan הם מוכרים היטב סמנים עבור chondrocytes.
על בסיס זה, פתחנו שיטת שושלת תאים חדשה התחקות בשיתוף עם גורל תא אימונוהיסטוכימיה אל פלורסנט להגדיר על ידי ניתוח הביטוי של סמני תאים ספציפיים. Runx2 (סמן תאים osteogenic בשלב מוקדם) ו הדנטין מטריקס protein1 (DMP1; כסמן תאים osteogenic בשלב מאוחר) היומשמש לזיהוי תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים ומצב הבידול שלהם. שילוב זה לא רק מרחיב את תחולת עקיבת שושלת תא, אלא גם מפשט את הדור של עכברים מתחמים. יתרה מכך, מספר, מיקום, וסטטוסי הבידול של צאצאים בתא ההורה מוצגים בו זמנית, מתן מידע רב יותר מאשר שושלת תא התחקות לבד. לסיכום, שיתוף היישום של טכניקות התחקות שושלת תא immunofluorescence הוא כלי רב עצמה על חקירת ביולוגיה של תא in vivo.
Introduction
במהלך הפיתוח, היווצרות העצם endochondral חשבונות עבור יותר מ -80% מנפח השלד. הוא האמין נרחב כי הוא מתחיל עם אפופטוזיס של כונדרוציטים היפרטרופית. בהמשך לכך, התאים ממח העצם הבסיסי לפלוש וליזום אנגיוגנזה, ואחריו בתצהיר עצם חדש על ידי העצם מארו ותאי הנגזרות periosteum 1,2. גורל התא של כונדרוציטים היפרטרופית (HCS), לעומת זאת, כבר בעיה של הוויכוח במשך עשרות שנים 3. בתחילה, HCS נחשב סוף מסלול הבידול הכונדרוציטים, אפופטוזיס נחשב בדרך כלל להיות מה עלה בגורלה של HCS. עכשיו, כמה חוקרים מציעים כי לפחות חלק HCS יכול לשרוד ולתרום היווצרות העצם endochondral. למרות שהציעו שהצמיחה chondrocytes צלחת הייתה היכולת transdifferentiate לתוך אוסטאובלסטים מבוסס על ultrastructure, מכתים immunohistochemical, ו במבחנה מחקרים 46, אף אחת מהשיטות הללו were מכריע הוכחת תרומה הכונדרוציטים אל שושלת אוסטאובלסטים.
שושלת תא טכניקת ההתחקות מספקת דרך קפדנית יותר ללמוד גורל תא. בקצרה מדבר, אנזים recombinase, אשר באה לידי ביטוי רק סוג מסוים של התא, מגרה את הביטוי של הגן הכתב. בדרך זו, זה סוג של תא וצאצאיהם מסומנים 7 לצמיתות. מערכת Cre-loxP היא נפוצה עקיבת שושלת. Cre (אנזים recombinase) יהיה בלו רצף STOP בין שני אתרי loxP ולהפעיל את הכתב בבית (איור 1 א) שורת תאים ספציפית. במקרים מסוימים, החוקר יכול לבחור נקודת זמן מתאימה כדי להפעיל Cre באמצעות תרופה, כגון טמוקסיפן, גרימת Cre איחוי צורה שונה של קולטן אסטרוגן (Cre ERT2) 8. כתבים פלורסנט הפכו לסטנדרט השושלת התחקות ניסויים כי הם להפחית באופן דרמטי את המורכבותולשפר את הדיוק והיעילות של גורל התא התחקות 8,9. tdTomato הופך את הבחירה הטובה ביותר בין כתבי ניאון שכן יש את חלבון פלואורסצנטי מבריקי epifluorescence החזק, מה שהופך אותו בקלות דמיין 7 (איור 1 א).
באמצעות השושלת Rosa26 tdTomato התחקות המערכת, הקבוצה שלנו וחוקרים אחרים הראו כי HCS יכול לשנות הפנוטיפ שלהם לתוך תאי עצם במהלך ההתפתחות 10-14. כדי להשיג זאת, פיתחנו שתי מערכות של התחקות שילובים עם Rosa26 tdTomato (ביטוי בכל מקום בכל התאים) / Cre (ספציפית chondrocytes) עכברים: 2.3Col1a1-GFP (ספציפית אוסטאובלסטים) ו immunofluorescence (ספציפית תאי עצם). הנתונים מראים כי שתי השיטות דרכים קיימא ללמוד גורל התא in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הפרוטוקולים היו נבדקה ואושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש (IACUC) באוניברסיטת טקסס A & M אוניברסיטת קולג 'של רפואת שיניים.
גידול בעלי חיים 1.
- השתמש שלושה מודלים של בעלי חיים במחקר זה. כדי לחקור את גורלם של chondrocytes עובריים במבנה condyle, השימוש הראשון Col10a1-Cre 15 עכברים ולחצות אותם עם Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor tm9 (CAG-tdTomato) Hze / J) עכברים להשיג Col10a1- עכברים Cre ו Rosa26 tdTomato. לאחר מכן, לחצות עכברים אלה עם עכברים 2.3Col1a1-GFP 16. השתמש Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (איור 1B).
- כדי לחקור את גורלם של chondrocytes לאחר הלידה, לפי אותו נוהל כמו בשלב 1.1, אבל להשתמש ERT2 Aggrecan-cre (AGG-Cre ERT2קו 17,18) ולשמור את ERT2 AGG-Cre; Rosa26 tdTomato; 2.3Col1a1-GFP עכברים לבצע את שושלת תא ניסויי התחקות (תרשים 1C). להזריק טמוקסיפן על יום הלידה 14.
- כדי לשלב את השושלת תא התחקות טכניקה עם immunofluorescence, לחצות AGG-Cre העכברים ERT2 ועכברים Rosa26 tdTomato. משתמשים בעכברים שנושאים שני הגנים בניסוי ולהזריק את טמוקסיפן על יום הלידה 3 (איור 1D).
2. הכנת חומר
- ממיסים את אבקת טמוקסיפן באתנול 10% ו -90% שמן תירס בריכוז של 10 מ"ג / מ"ל. המינון להזרקה הוא 75 מ"ג / ק"ג.
- ממיסים את אבקת paraformaldehyde (PFA) ב PBS לריכוז של 4%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 4% פתרון PFA כדי לתקן את הרקמה (להלן condyle mandibular ורגל האחוריות משמשות כאן) לאחר הקרבה. בגלל שלהרעילות, להתמודד עם PFA בשכונה עם כפפות facemask.
- ממיסים את אבקת EDTA במים מזוקקים לריכוז של 10%, באמצעות 2 M מימה נתרן כדי להתאים את ערך ה- pH ל -7.4. השתמש 10% EDTA כדי decalcify condyle mandibular ורגל אחורית.
- ממיסים אבקת סוכרוז PBS בריכוזים של 15% ו -30%. השתמש תמיסת סוכרוז כדי ליבש הרקמה לאחר decalcification.
- ממיסים את אבקת hyaluronidase ב PBS בריכוז של 2 מ"ג / מ"ל, pH 5.0. פתרון זה לאחזור אנטיגן immunofluorescence.
- השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון חסימת המכיל אלבומין בסרום שור 3% (BSA) ו -20% סרום עיזים ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1.
- השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון נוגדן ראשוני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. הריכוז של הנוגדן הראשוני הוא 1: 400 עבור Runx2 ו 1: 100 עבור DMP1.
- השתמש צינור 1.5 מ"ל להכיןפתרון IgG הארנב כמו השליטה מכתימה immunofluorescent כדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות. הפתרון מכיל 2% נסיוב עז ב PBS. הריכוז של IgG הארנב לבקרת Runx2 הוא 1: 400; עבור DMP1, 1: 100. בצע את המכתים לניסוי ובקרה בעת ובעונה אחת.
- השתמש צינור 1.5 מ"ל להכין פתרון נוגדנים משני המכיל סרום עיזים 2% ב PBS עבור מכתים immunofluorescent Runx2 או DMP1. השתמש נוגדנים משני בדילול של 1: 500.
.3 סט הכנה המיקרוסקופית Confocal (Cell Lineage איתור בלבד, ללא שילוב עם Immunofluorescence)
- להזריק טמוקסיפן בעכברי AGG-cre ERT2 בנקודת זמן מתאימה.
- ראשית, להסיר עכבר מהכלוב שלה. לאחר מכן, השתמשו באגודל ובאצבע המורה השמאלית כדי לתפוס את העור בצד האחורי של העכבר והפוך אותו, לחשוף את הבטן. השתמש ביד ימין להחזיק את המזרק. נקודת הכניסה האופטימלית עבור זריקה היא על lEFT או בצד ימין של hypogastrium, הימנעות הכבד וכיס.
- שמור את המזרק במקביל הרגליים האחוריות של העכבר להזריק intraperitoneally. המינון להזרקה הוא 75 מ"ג / ק"ג. המשקלים של עכברים בכל הגילאים 2 שבועות, 3 שבועות, ו -4 שבועות כ 7 - 9 גרם, 11 - 13 גרם, ו 16 - 18 גרם, בהתאמה.
- להרדים את העכברים עם שילוב Xylazine / Ketaset.
- כדי להכין הפתרון עובד, הראשון לדלל את Xylazine ו Ketaset עם מים מזוקקים כדי בריכוז של 1 מ"ג / מ"ל ו -5 מ"ג / מ"ל, בהתאמה. לאחר מכן, לערבב את Xylazine ו Ketaset ב יחס של 1: 2. המינון להזרקה הוא 30 μl / g.
- להזריק כמו בשלב 3.1. אשר את ההרדמה על ידי צובט את קרסול העכבר. העכבר הוא לא מודע אם הוא לא מגיב.
- Perfuse העכברים עם 4% PFA לאחר הרדמה.
- לאחר העכבר מאבד את הכרתו, לתקן את ארבע רגליו של העכבר על גבי הלוח כדי entirely לחשוף את הבטן.
- להרוות את הבטן עם אתנול 70% ולעשות כריתה מהבטן התחתונה לצוואר לאורך הקו האמצעי. לצבוט ובמקביל למשוך את העור לצדדים לרוחב כדי לחשוף את קרום הצפק. השתמש במספריים לנתיחה כדי לבצע כריתה אורכת.
- חותך ולהסיר את הצלעות הקדמיות כדי לחשוף את הלב. לנקב את הלב מן החדר השמאלי עם מזרק 22 G, להחזיק את המזרק, ובמקביל לחתוך את משבצת את אפרכסת ימין.
- לאט לאט להזריק את PFA 4%, אשר perfused לאורך מערכת הלב וכלי הדם בעוד גלי הדם מתוך חתך את אפרכסת ימין. היקף PFA עבור זלוף הוא 1 מ"ל / גרם. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין.
- קלף את העור העכבר ולשים את כל הגוף לתוך צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של 4% PFA לתקן לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
- השתמש במספריים לנתיחה # 3 ו # 5 מלקחיים כדי להסיר את הלסת התחתונה בזהירות רגל אחורית מהגוף וכדי להסיר את השרירים והגידים על פני השטח. בצע פעולה זו בתוך ארון בטיחות ביולוגית אני בכיתה שקשה-ducted למערכת הפליטה הבניין.
- חותך את הלסת התחתונה לתוך שתי חתיכות באזור הדיסטלי של הטוחנת השלישית. באופן דומה, לחתוך את עצם הירך לבין השוקה ב midshaft לחשוף את חלל מח עצם על מנת להאיץ decalcification. מכניסים את החלק הכולל את תהליך condyle ו condylar ויחד עם הרגל האחורית לתוך 40 מ"ל של EDTA 10% עד decalcify ב 4 מעלות צלזיוס למשך 2 - 4 ימים בתוך שפופרת צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מ"ל.
- השתמש 50 מיליליטר של סוכרוז 15% כדי לייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר.
- השתמש 30% סוכרוז מייבש את condyle ורגל אחורית הלילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פוליפרופילן 50 מיליליטר.
- במישור sagittal, להטביע את המדגם עםאוקטובר על צלחת חיתוך במכונה cryosection.
- אופקי להניח את condyle או הרגל האחורית העובש הגובר. להטביע את הרקמה ב אוקטובר ולהשאיר אותה במכונה cryosection עד ב- OCT קופא.
- הר לחסום אוקטובר על צלחת חיתוך. מתן כ 15 דקות לפני החיתוך, כדי להבטיח כי ב- OCT הוא קפוא לחלוטין.
- חותך את condyle ורגל אחורית למקטעים של 10 מיקרומטר. אסוף בסעיפים בשקופיות ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- דגירה שקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים.
- שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים במשך 5 דקות.
- תמחק את המים סביב כל קטע. השתמשו בעט מחסום הידרופובי להקיף את הסעיפים ושחרר DAPI או שאינם fluorescing פתרון גובר אנטי לדעוך לתוך המעגל. בזהירות להניח את התלוש לכסות.
4. מכתים immunohistochemical עבור Runx2 ו DMP1
הערה: con IgGtrol הכרחי מכתים immunohistochemical להימנע אותות חיוביים שגויים. המכתים עבור הקבוצות מלאות הניסיוניות לבצעו בעת ובעונה אחת.
- דגירה השקופיות בתא 37 ° C כדי להסיר את המים לפני מכתים.
- שטפו את השקופיות פעמיים עם מים מזוקקים.
- השתמש עט מחסום הידרופובי להקיף את כל החלקים בשקופית. משלב זה, להוסיף את כל הפתרון המוכן למעגל לכיסוי החלק לחלוטין.
- פנקו את החלקים עם hyaluronidase בתא לח על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. היקף הפתרון (בצעדים 4.5 - 4.8) תלוי בגודל של הסעיף. השתמש 50 μl של פתרון עבור condyle ו 100 μl של העצם הארוך. לשטוף עם PBST (PBS המכיל 0.1% Tween 20) שלוש פעמים.
- כן וליישם את הפתרון החוסם כל מקטע דגירה אותם בתא לח במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר.
- דגירה החלקה עם עיקריהפתרון נוגדן (Runx2 אנטי עכבר ארנב, או ארנבת אנטי עכבר DMP1) בשעה 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה. לשטוף עם שלוש פעמים PBS.
- דגירה החלקה עם פתרון נוגדנים משני (ארנב נגד עז, Alexa פלואוריד 488) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. לשטוף עם שלוש פעמים PBS.
- נגב את המים סביב סעיף ושחרר DAPI למעגל כדי לכסות את החלק בשקופית. בזהירות להניח את התלוש לכסות.
5. מיקרוסקופי Confocal
- צלמו תמונות תא ניאון באמצעות מיקרוסקופ confocal באורכי גל הנעים בין 488 מיקרומטר (ירוק) 561 מיקרומטר (אדום). קח תמונות מוערמים מרובים ב 200 הרץ (מידות של 1,024 × 1,024) 19 באמצעות 10X, 20X, ו 63X עדשות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Chondrocytes ישירות להפוך תאי עצם (אוסטאובלסטים ו Osteocytes) ב mandibular condyle ולונג עצם.
Aggrecan, גן קריטי chondrogenesis, בא לידי ביטוי בעיקר chondrocytes מוקדם ובוגרת 18. כתוצאה מכך, הזרקה של טמוקסיפן 2 שבועות של גיל AGG-Cre ERT2; עכברים Rosa26 tdTomato מופעל הכתב באדום-עגבנייה בכל chondrocytes ותאי הבת שלהם. שורת 2.3Col1a1-GFP הולידה בצבע ירוק-קורן קולגן 1-לבטא בתאי עצם, אוסטאובלסטים במיוחד מראש osteocytes. הצבע הצהוב (אדום בשילוב עם ירוק) הצביע על הנוכחות של תאי עצם נגזרות הכונדרוציטים כי הביעו את גן קולגן 1. באיור 2 א, רוב תאי העצם בתהליך condylar מתחת הסחוס היו אדומים או yellow (תא אדום שהחל להפריש ירוק-קורן Col1a1, ובכך המופיע צהוב כאשר שני fluorophores הוטבעו). תוצאות אלה סיפקו ראיות חזקות כי תאי עצם אלה נגזרו chondrocytes. תוצאות דומות נצפו גם במהלך התפתחות עצם ארוכה, שבה רוב תאי עצם נגזרו chondrocytes היא epiphysis (תרשים 2B) ואת metaphysis (איור 2 ג).
כדי להמשיך לחקור את התוצאות הללו, חצינו עכברים Col10al-Cre עם Rosa26 tdTomato; עכברי 2.3Col1a1-GFP. Col10a1 הוא סמן ספציפי ביותר עבור HCS, מתבטא רק HCS וצאצאיהם. יתר על כן, Col10a1-Cre הוא הלא מושרה, המשקף התמיינות תאים מההתחלה הביטוי Col10a1 (ב E14.5). בשנות ה trabeculae ליד ממשק העצם הסחוס (ברמה מעולה) של 3 שבועות בן עכברים, אדום יםתאי fluorescing צהובים שתו היו שולטים, בעוד תאים קורנים ירוקים היו נדירים. באזור נח מעט יותר (ברמת ביניים), רוב התאים היו קורנים צהובים, עם אדום fluorescing פחות מעט. תאים קורנים גרין הופיעו לשלוט רק באזור הנח ביותר של תהליך condylar (רמה נחה) (איור 3) .זה מגמה עולה כי צמיחת condylar בעיקר הוא תרמה ידי תאי עצם טרנספורמציה מן HCS. חלוקת תאי fluorescing האדומים וירוקים בתהליך condylar היא גם עולה בקנה אחד עם הכיוון הנח אל מעולה של צמיחת condylar.
שושלת תא טכניקת ההתחקות מראה בבירור כי אפופטוזיס אינו רק הגורל עבור HCS. שני הקווים AGG-Cre ERT2 ו Col10a1-Cre עולה כי תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים הם המקור העיקרי עבור התפתחות העצם בתהליך condylar וב epiphysisו metaphysis ב עצם ארוך.
Co-יישום של Immunofluorescent מכתים איתור שושלת התא מאפשר המעקב של התמיינות תאים.
טכניקת התחקות השושלת הסלולרית יכולה גם להיות משולבת עם אימונוהיסטוכימיה ניאון כדי לקבוע את סוג התא על ידי זיהוי של סמן תא ספציפי. לשיטה זו מספר יתרונות לחקר גורל התא. ראשית, החוקר יכול עדיין להגדיר את מאפייני תא על ידי בחירת סמנים מתאימים, גם ללא קו העכבר הספציפי GFP, אשר מרחיב את היישום עבור שושלת תא התחקות טכניקה. שנית, זה מפשט את הדור של עכברים מתחמים. לדוגמה, אנחנו רק צריכים ליצור AGG-Cre ERT2; עכברים מתחמים Rosa26 tdTomato להפקת הצבע האדום לאחר הפעלת Cre (ב היום לאחר לידת 3), במקום ליצור AGG-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato עכברים, אשר דורש יותר צלבים.
במחקר זה, בחרנו שני נוגדנים מכתימים immunofluorescent. אחד מהם היה נגד Runx2, גורם תעתיק קריטי במהלך ההבשלה אוסטאובלסטים (בשלב מוקדם של תאים osteogenic); השני היה נגד DMP1, המתבטא osteocytes הבוגרת (בשלב מאוחר של תאי osteogenic). באיור 4, פלואורסצנטי ירוק מייצג את הביטוי נוגדנים Runx2 או DMP1 בתהליך condylar שבועות בן 2. באיור 4 א, שלושה סוגים של תאים בצבע עצם subchondral נוכחים. הצבע הצהוב (אימפוזיציה של קרינה אדומה וירוקה) בגרעין מייצג את תאי עצם נגזר-הכונדרוציטים להביע Runx2, המציין כי התאים האלה היו אוסטאובלסטים בשלה על פני העצם. בנוסף, היו תאי עצם אדומים-קורן שלא להביע Runx2 (ו אדוםluorescence ללא ירוק גבי). תאים אלה מייצגים תאי עצם בוגרים נגזרות הכונדרוציטים במטריצת העצם. התאים הפחות הנפוצים היו אלה עם גרעינים ירוקים-קורן רק המציין שתאי עצם הלא הכונדרוציטים נגזרים עם ביטוי Runx2 או טרנספורמציה שהתרחש לפני הפעלת Cre. התמונה עולה כי תאי העצם האדומים ואלה עם גרעינים צהובים היו אוכלוסיות תאים רוב התורמים להיווצרות עצם subchondral condylar.
מצד השני, כמעט כל תא עצם אדום, נגזר-הכונדרוציטים במטריצת העצם היה מכתים DMP1 סביב גופי התא שלהם. Osteocytes מעטים היו חיובי עבור DMP1 אבל חסר גופי תא אדומים (האיור 4B). ישנם גם שני הסברים אפשריים תאים אלה: או שהם תאי עצם בלתי נגזר הכונדרוציטים, או שהם נגזרים הכונדרוציטים תאים עצם ששינו לפני הזרקת טמוקסיפן. בנוסף, אין תאי עצם אדומיםעל פני השטח של העצם הביע DMP1, המעיד על כך שהם לא היו בשלים osteocytes.
יחדיו, נתוני דפוסי הביטוי הוא early- (Runx2) וסמנים בשלב מאוחר (DMP1) של תאי osteogenic תאמו את התוצאה הקודמת באמצעות Cre בשילוב עם 2.3Col1a1-GFP. נתונים אלה מראים כי שילוב של immunofluorescence התחקות Rosa26 tdTomato היא דרך טובה ללמוד גורל התא. יתרה מכך, חוקרים יכולים להבחין בסוג התא, לזהות את שלב הבידול, ולבחון את מספרי תא טרנספורמציה בו זמנית באמצעות immunofluorescence עם סמנים שונים, המספק מידע יותר Rosa26 tdTomato התחקות לבד.
איור 1. מנגנון Lineage סלולרי איתור הדור דואר של עכברים במגרש. א) מערכת Cre-loxP היא נפוצה עקיבת שושלת. Cre בלו רצף STOP בין שני אתרי loxP, ואת חלבון tdTomato (קורן אדום) באה לידי ביטוי באופן קבוע בקו התאים הספציפי. B) שלושה מודלים של בעלי חיים המוזכרים במאמר זה. השתמשנו 2.3 Col1a1-GFP; עכברי Rosa26 tdTomato וחצו אותם עם עכברי Col10a1-Cre. Col10a1-Cre הוא הלא מושרה, המשקף את התמיינות תאים מההתחלה הביטוי Col10a1 (ב E14.5). C) Aggrecan-Cre ERT2 (AGG-Cre ERT2) הוא עוד קו Cre חצה גם עם 2.3Col1a1-GFP; עכברי Rosa26 tdTomato. Cre הופעל 2 שבועות של גיל על ידי הזרקת טמוקסיפן (TM: טמוקסיפן). D) על מנת לשלב את immunofluorescence עם עקיבת שושלת תא, שעוררנו AGG-Cre ERT2; <em> עכברים Rosa26 tdTomato, מופעל Cre ב יום לאחר הלידה 3, וכן ביצע את immunofluorescence Runx2 ו DMP1 (TM: טמוקסיפן). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. טרנספורמציה מן chondrocytes לתאי עצם (אוסטאובלסטים ו Osteocytes) ב mandibular condyle ולונג העצם באמצעות AGG-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato עכברים במגרש. א) Cre הופעלה על ידי טמוקסיפן על יום הלידה 14, והעכברים הוקרבו בגיל 4 שבועות. היו שלושה תאים צבעוניים תהליך condylar: אדום טהור (תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים), צהוב (אדום בשילוב עם ירוק, המציין שתאי העצם הנגזרות הכונדרוציטים כי הביע את הגן קולגן 1), וירוק טהור (תאי עצם נגזר שאינו הכונדרוציטים עם הגן קולגן 1) . רוב תאי העצם בתהליך condylar מתחת הסחוס היו אדום צהובים או טהור (חצים לבנים), ואילו תאי עצם מעטים היו ירוקים (חיצים כחולים). נתונים אלה מספקים ראיות חזקות כי chondrocytes להפוך ישירות לתאי עצם לתרום להיווצרות של תהליך condylar במהלך פיתוח (TM: טמוקסיפן; C: סחוס; B: עצם). B, C) רוב תאי עצם epiphysis ו metaphysis היו הכונדרוציטים נגזרים (חץ לבן: תאי עצם משתנה לגמרי הכונדרוציטים באדום צהוב או הטהור; החץ כחול: תאי עצם שאינם נגזר-הכונדרוציטים בירוקים הטהור; AC: במפרק סחוס; GP: צמיחת צלחת).blank "> לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3. טרנספורמציה מן chondrocytes לתאי עצם בלסת התחתונה, condyle שימוש Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato עכברים במגרש. א) תהליך condylar מעכברים בן 3 שבועות, תאי עצם ירוקים היו מיעוט מובחן trabeculae ליד ממשק עצם סחוס (ברמה מעולה, A1), ואילו אדום וכמה תאים שצהובים הוא צבע שולטים. ברמה האמצעית (A2), תאים צהובים היו הרוב, עם תאים אדומים פחות מעט. תאים ירוקים שנראים ברוב היחיד באזור הנח ביותר (A3). אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4. שיתוף לוקליזציה של שני מרקר תאים osteogenic עם רקע של עקיבת Lineage בתהליך Condylar שימוש 2 שבועות בן AGG-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato עכברים במגרש. א) צבע צהוב גרעינים מייצג תאי עצם נגזר-הכונדרוציטים להביע Runx2 (חצים לבנים) על פני השטח של העצם trabecular מתחת סחוס condyle. תאי העצם האדומים הטהורים ללא ביטוי Runx2 מייצגים תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים בוגרים במטריצת העצם (חיצים צהובים). feweתאי רח היו אלה שנשאו גרעינים ירוקים בלבד, המייצגים תאי עצם לא-נגזר-הכונדרוציטים או תאי עצם טרנספורמציה מן chondrocytes לפני הפעלת Cre (TM: טמוקסיפן). ב) עצם trabecular מתחת סחוס condyle, כמעט כל תא עצם אדום נגזרות הכונדרוציטים במטריצת העצם נשא מכתים DMP1 סביב גופי התא שלהם (חצים לבנים). רק כמה מן osteocytes היו חיוביים עבור DMP1 אבל לא היה צבע אדום גופי התא שלהם (חיצים צהובים). קיימות שתי אפשרויות עבור תאים אלה: תאי עצם שאינו נגזר-הכונדרוציטים או תאי עצם שמקורם הכונדרוציטים הנובעים לפני הזרקת טמוקסיפן. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בשל מגבלות טכנולוגיות, זה תמיד קשה כדי לחקור את התנהגותם של תאים in vivo. עם זאת, הטכניקה התחקות תא השושלת היא להוכיח להיות כלי רב עוצמה ללימוד ביולוגיה של התא 7-9. במחקר זה, אנו עוד יותר לשפר בפרוטוקול זה על ידי שילוב עם immunofluorescence. בדרך זו, גורל תא יכול להיות מוגדר על ידי סמנים משויכים מרובים, אשר מרחיב את תחולת עקיבת שושלת. יתר על כן, שיתוף לוקליזציה זה של אות immunofluorescence ועגבנייה זמנית מציגה את מספר הצאצאים של התא המייסד, מיקומם, ומצב הבידול שלהם, מתן מידע רב יותר מאשר שושלת תא התחקות לבד. בנוסף, שימוש סמני תא ספציפי יכול לפשט את הדור של עכברים מתחמים, מאיץ את החקירה.
הספציפיות של Cre הוא חיוני עבור ייחוס חד-משמעית של השושלת ואת הדיוק של 20,21 תוצאות. זה im מאודportant לבחירת קווי Cre המתאימה כדי לוודא את גורל התא. במחקר זה, בחרנו Col10a1, משום שהוא נחשב סמן ספציפי עבור chondrocytes היפרטרופית 10,11, ו aggrecan, כי זה גם סמן מוכר היטב עבור chondrocytes 18. ישנם גם דגמי Cre טובים לשמש בתחומים אחרים. Scleraxis-Cre (SCX-Cre) הקו, למשל, הוא שימוש גיד ומחקר רצועה מאז scleraxis הוא גורם שעתוק בסיס סליל לולאה בצורת סליל כי הוא סמן שושלת תא הגיד ו רצועת 22. עוד Cre שנקרא DMP1-Cre הוא נפוץ במחקרי skeleton- ושן הקשורות כי DMP1 מבוטא בכמות גבוהה ב odontoblasts ו osteocytes 23,24.
לעומת מערכות Cre הלא מושרה, הפעלת מושרה Cre ניתן להגביל במרחב ובזמן 20. עם זאת, כמה מגבלות צריכות לקחת בחשבון בעת תכנון הניסוי לפרש את התוצאות שלמודלי Cre מושרים. ראשית, את המינון של טמוקסיפן יכול לשנות את היעילות של הפעלת Cre ואת מספר התאים שכותרתו. מינונים נמוכים יתייגו את אוכלוסיית העניין בצפיפות משובטת 25; במינונים גבוהים יכולים לתייג את הברכה ובתאים כולו 7,26. לכן, המינון צריך להיבחר בהתאם לצורך הניסוי. שנית, טמוקסיפן רעילות אפשרית, במיוחד במינונים גבוהים 27,28. מסיבה זו, עדיף להקטין את המינון כדי למנוע הפלות מאוחר לטווח כאשר ההזרקה במהלך ההריון 29.
לסיכום, שיתוף היישום של טכניקות התחקות שושלת תא immunofluorescence הוא כלי רב עצמה על חקירת ביולוגיה של תא in vivo. בעתיד, החוקרים יכולים לנסות לבצע immunofluorescence בו זמנית עם שני נוגדנים שונים על רקע האות עגבניות. שיטה זו יכולה להראות את דפוס הביטוי עבור שני סמנים בסעיף אחד, מה שמקל עלהחוקר להשוות ולנתח את התוצאות. יתר על כן, שיתוף יישום זה ניתן לשפר עוד יותר על ידי ב immunofluorescence באתרו להפחית מכתים הלא ספציפי שעשויים להתקיים באמצעות immunofluorescence הקונבנציונלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse? Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension? Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
