Summary
Abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni a Rosa26 tdtomato (ubiquitariamente espresso in tutte le cellule) / Cre (specificamente indicato nella condrociti) topi: uno con 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e uno con immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano la trasformazione diretta di condrociti in cellule ossee.
Abstract
Il sistema di tracciamento linea cellulare è stata utilizzata prevalentemente negli studi di biologia dello sviluppo. L'uso di Cre ricombinasi consente l'attivazione del reporter in una linea cellulare specifica e tutto progenie. Qui, abbiamo utilizzato la linea cellulare tecnica tracing per dimostrare che condrociti trasformano direttamente in osteoblasti e osteociti durante osso lungo e lo sviluppo del condilo mandibolare utilizzando due tipi di Cre, Col10a1-Cre e Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), incrociati con Rosa26 tdTomato. Sia Col10 e aggrecan sono marcatori ben riconosciuti per condrociti.
Su questa base, abbiamo sviluppato un nuovo metodo di lignaggio cellule tracing in combinazione con fluorescenti immunoistochimica-per definire il destino della cellula, analizzando l'espressione di marcatori cellulari specifici. Runx2 (un marker per le cellule osteogeniche fase iniziale) e dentina matrice protein1 (DMP1, un marker per le cellule in fase avanzata osteogeniche) eranoutilizzato per identificare le cellule ossee chondrocyte-derivati e il loro stato di differenziazione. Questa combinazione non solo amplia l'applicazione della linea cellulare tracing, ma semplifica anche la generazione di topi composti. Ancora più importante, gli stati posizione, il numero e la differenziazione delle progenie cellula madre vengono visualizzati contemporaneamente, fornendo più informazioni rispetto linea cellulare tracciamento solo. In conclusione, la co-applicazione di tecniche tracing linea cellulare e immunofluorescenza è un potente strumento per studiare biologia cellulare in vivo.
Introduction
Durante lo sviluppo, rappresenta la formazione di osso endochondral per oltre l'80% del volume scheletrico. E 'opinione diffusa che inizia con l'apoptosi dei condrociti ipertrofici. Successivamente, le cellule dal midollo osseo sottostante invadono e avviare l'angiogenesi, seguita dalla deposizione di nuovo tessuto osseo da dal midollo osseo e cellule del periostio di derivazione 1,2. Il destino delle cellule di condrociti ipertrofici (HC), tuttavia, è stato un problema di dibattito per decenni 3. Inizialmente, HC sono stati considerati alla fine del percorso di differenziazione dei condrociti, e l'apoptosi è stato generalmente pensato per essere il destino finale di HC. Ora, alcuni ricercatori suggeriscono che almeno alcuni HC potrebbero sopravvivere e contribuire alla formazione di osso endochondral. Anche se hanno proposto che la crescita condrociti piatto aveva la capacità di transdifferenziare in osteoblasti sulla base di ultrastruttura, colorazione immunoistochimica, e studi in vitro 46, nessuno di questi metodi were definitiva a dimostrare il contributo di condrociti alla stirpe degli osteoblasti.
La tecnica di linea cellulare tracciare fornisce un modo più rigoroso per studiare il destino della cellula. Per dirla in breve, un enzima ricombinasi, che viene espresso solo in un tipo specifico di cellula, stimola l'espressione del gene reporter. In questo modo, questo tipo di cellula e loro discendenti sono permanentemente etichettati 7. Il sistema Cre-loxP è comunemente usato in lineage tracing. Cre (l'enzima ricombinasi) sarà asportare la sequenza di STOP tra i due siti loxP e attivare il reporter di una determinata linea cellulare (Figura 1A). In alcuni casi, il ricercatore può scegliere un punto tempo favorevole per attivare Cre utilizzando un farmaco, come il tamoxifene, causando Cre di fondere ad una forma modificata del recettore dell'estrogeno (Cre ERT2) 8. giornalisti fluorescenti sono diventati lo standard in lignaggio tracciare esperimenti perché riducono drasticamente la complessitàe migliorare la precisione e l'efficienza del destino delle cellule tracciamento 8,9. tdTomato sta diventando la scelta migliore tra i reporter fluorescenti poiché ha la proteina fluorescente chiaro e il epifluorescenza forte, che lo rende facilmente visualizzato 7 (Figura 1A).
Usando il lignaggio Rosa26 tdTomato sistema di rintracciamento, il nostro gruppo e altri ricercatori hanno dimostrato che l'HC può cambiare il loro fenotipo in cellule ossee durante lo sviluppo 10-14. Per fare questo, abbiamo sviluppato due serie di tracciare combinazioni con Rosa26 tdtomato (espressione ubiquitaria in tutte le cellule) / Cre (specifico per condrociti) topo: 2.3Col1a1-GFP (specifico per osteoblasti) e immunofluorescenza (specifico per le cellule ossee). I dati dimostrano che i due metodi sono modi vitali per studiare il destino della cellula in vivo.
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Protocol
Tutti i protocolli sono stati esaminati e approvati dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) presso la Texas A & M University College of Dentistry.
Allevamento 1. Animal
- Utilizzare tre modelli animali in questo studio. Per studiare il destino dei condrociti embrionali in formazione condilo, primo utilizzo Col10a1-Cre 15 topi ed attraversarle con Rosa26 tdTomato (B6; 129S6- Gt (ROSA) 26Sor TM9 (CAG-tdTomato) HZE / J) topi per ottenere Col10a1- topi Cre e Rosa26 tdTomato. Successivamente, attraversare questi topi con topi 2.3Col1a1-GFP 16. Utilizzare Col10a1-Cre; Rosa26 tdTomato; Topi 2.3Col1a1-GFP per eseguire gli esperimenti linea cellulare di tracciamento (Figura 1B).
- Per studiare il destino dei condrociti postnatali, seguire la stessa procedura al punto 1.1, ma utilizzare il ERT2 Aggrecan-cre (Agg-Cre ERT2) 17,18 line e mantenere la Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato; Topi 2.3Col1a1-GFP per eseguire gli esperimenti linea cellulare Tracing (Figura 1C). Iniettare tamoxifene su postnatale giorno 14.
- Per combinare la linea cellulare tecnica con immunofluorescenza rintracciamento, attraversare topi Agg-Cre ERT2 e topi Rosa26 tdTomato. Utilizzare i topi che portano entrambi i geni nell'esperimento e iniettare il tamoxifene in postnatale giorno 3 (Figura 1D).
2. Preparazione Materiale
- Sciogliere la polvere tamoxifen in 10% di etanolo e olio di mais al 90% ad una concentrazione di 10 mg / ml. Il dosaggio iniettabile è 75 mg / kg.
- Sciogliere la polvere paraformaldeide (PFA) in PBS ad una concentrazione di 4%, utilizzando 2 M di sodio idrato per regolare il pH a 7,4. Utilizzare 4% soluzione PFA per riparare il tessuto (il condilo mandibolare e gamba posteriore sono utilizzati qui) dopo il sacrificio. A causa del suotossicità, maniglia PFA nella cappa con guanti e una maschera facciale.
- Sciogliere la polvere EDTA in acqua distillata ad una concentrazione del 10%, utilizzando 2 M di sodio idrato per regolare il pH a 7,4. Utilizzare il 10% EDTA per decalcificazione del condilo mandibolare e gamba posteriore.
- Sciogliere in polvere di saccarosio in PBS a concentrazioni di 15% e 30%. Utilizzare la soluzione di saccarosio per disidratare i tessuti dopo la decalcificazione.
- Sciogliere la polvere ialuronidasi in PBS ad una concentrazione di 2 mg / ml, pH 5,0. Questa soluzione è per il recupero immunofluorescenza antigene.
- Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione di saturazione contenente 3% di albumina sierica bovina (BSA) e 20% siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza.
- Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione anticorpo primario che contiene 2% di siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza colorazione. La concentrazione dell'anticorpo primario è 1: 400 per Runx2 e 1: 100 per DMP1.
- Utilizzare un tubo da 1,5 ml per prepararela soluzione rabbit IgG come controllo per immunofluorescenza per evitare falsi risultati positivi. La soluzione contiene 2% siero di capra in PBS. La concentrazione di IgG di coniglio per il controllo Runx2 è 1: 400; per DMP1, 1: 100. Eseguire l'esperimento e di controllo colorazione contemporaneamente.
- Utilizzare una provetta da 1,5 ml per preparare una soluzione di anticorpo secondario che contiene 2% di siero di capra in PBS per Runx2 o DMP1 immunofluorescenza colorazione. Utilizzare l'anticorpo secondario ad una diluizione di 1: 500.
3. Far scorrere Preparazione per la microscopia confocale (cellulare Lineage Tracing Solo, nessuna combinazione con immunofluorescenza)
- Iniettare tamoxifene nel Agg-cre ERT2 topi in un punto di tempo favorevole.
- In primo luogo, rimuovere un mouse dalla sua gabbia. Quindi, utilizzare il pollice e l'indice sinistro per afferrare la pelle del dorso del mouse e capovolgerlo, esponendo l'addome. Usare la mano destra per tenere la siringa. Il punto di ingresso ottimale per l'iniezione è sul lEFT o sul lato destro della all'ipogastrio, evitando il fegato e vescica.
- Tenere la siringa parallelo alle zampe posteriori del mouse e iniettare per via intraperitoneale. Il dosaggio iniettabile è 75 mg / kg. I pesi dei topi all'età di 2 settimane, 3 settimane e 4 settimane di vita sono circa 7-9 g, 11 - 13 g, e 16 - 18 g, rispettivamente.
- Anestetizzare i topi con una combinazione Xilazina / Ketaset.
- Per preparare la soluzione di lavoro, prima diluire la xylazina e Ketaset con acqua distillata alla concentrazione di 1 mg / ml e 5 mg / ml, rispettivamente. Avanti, mescolare il Xilazina e Ketaset in un rapporto 1: 2. Il dosaggio per iniezione è di 30 ml / g.
- Iniettare come al punto 3.1. Confermare l'anestesia pizzicando caviglia del mouse. Il mouse è incosciente se non ha alcuna reazione.
- Perfusione i topi con 4% PFA dopo anestesia.
- Dopo il mouse perde conoscenza, fissare le quattro gambe del mouse su una scheda per entirely esporre l'addome.
- Saturare l'addome con il 70% di etanolo ed effettuare una escissione dal basso addome al collo lungo la linea mediana. Pinch e contemporaneamente tirare la pelle ai fianchi laterali per rivelare la membrana peritoneale. Usare le forbici dissezione per fare un escissione longitudinale.
- Tagliare e rimuovere le costole anteriori per esporre il cuore. Forare il cuore dal ventricolo sinistro con una siringa da 22 G, tenere la siringa, e contemporaneamente tagliare una fessura nel padiglione auricolare destro.
- Iniettare lentamente il 4% PFA, che viene perfuso lungo il sistema cardiovascolare, mentre le vampate sangue dal taglio dal atrio destro. Il volume della PFA per perfusione è 1 ml / grammo. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza di classe I che è difficile-canalizzato per il sistema di scarico dell'edificio.
- Rimuovere la pelle del topo e si inserisce il corpo intero in una provetta da centrifuga in polipropilene da 50 ml contenente 40 ml di 4% PFA fissare notte a 4 ° C.
- Utilizzare forbici dissezione e # 3 e # 5 pinze per rimuovere accuratamente la mandibola e gamba posteriore dal corpo e per rimuovere i muscoli e tendini sulla superficie. Eseguire questo passaggio in un armadio biosicurezza di classe I che è difficile-canalizzato per il sistema di scarico dell'edificio.
- Tagliare la mandibola in due parti in corrispondenza della zona distale del terzo molare. Analogamente, tagliare il femore e la tibia in mediopeniene per esporre la cavità del midollo osseo al fine di accelerare la decalcificazione. Mettere la parte che comprende il processo condilo e condilare e con la zampa posteriore in 40 ml di 10% EDTA decalcificare a 4 ° C per 2 - 4 giorni in una provetta di polipropilene da centrifuga da 50 ml.
- Utilizzare 50 ml di 15% di saccarosio per disidratare il condilo e zampa posteriore notte a 4 ° C in una provetta di polipropilene da centrifuga da 50 ml.
- Utilizzare 30% di saccarosio per disidratare il condilo e zampa posteriore notte a 4 ° C in un 50-ml tubo di polipropilene centrifuga.
- Lungo il piano sagittale, incorporare il campione conOttobre sul piatto di taglio nella macchina cryosection.
- Orizzontalmente gettare le condilo o la zampa posteriore nello stampo di montaggio. Immergere il tessuto in OCT e lasciarlo in macchina cryosection fino personalizzazione di Office si blocca.
- Montare il blocco di ottobre sulla piastra di taglio. Attendere circa 15 minuti prima del taglio per garantire che i PTOM è completamente congelato.
- Tagliare il condilo e gamba posteriore in sezioni di 10 micron. Raccogliere le sezioni su diapositive e conservare a -20 ° C.
- Incubare il vetrino in una camera 37 ° C per rimuovere l'acqua prima della colorazione.
- Lavare i vetrini due volte con acqua distillata per 5 min.
- Rimuovere l'acqua intorno ogni sezione. Utilizzare una penna barriera idrofobica a fare il giro delle sezioni e rilasciare DAPI o non-fluorescenti soluzione di montaggio anti-sbiadimento nel cerchio. adagiarvi la polizza di copertura.
4. la colorazione immunoistochimica per Runx2 e DMP1
NOTA: L'aria IgGcontrollo è necessario per la colorazione immunoistochimica per evitare segnali falsi-positivi. La colorazione per i gruppi trattati e di controllo deve essere eseguita simultaneamente.
- Incubare i vetrini in una camera 37 ° C per rimuovere l'acqua prima della colorazione.
- Lavare i vetrini due volte con acqua distillata.
- Utilizzare la penna barriera idrofobica a cerchio tutte le sezioni sul vetrino. Da questo punto, aggiungere tutta la soluzione preparata nel cerchio per coprire completamente le sezioni.
- Trattare le sezioni con ialuronidasi in una camera umida a 37 ° C per 30 min. Il volume della soluzione (a passi di 4,5 - 4,8) dipende dalle dimensioni della sezione. Utilizzare 50 ml di soluzione per il condilo e 100 ml per il lungo osso. Lavare con PBST (PBS contenente 0,1% di Tween 20) tre volte.
- Preparare e applicare la soluzione di blocco per ogni sezione e incubare in una camera umida per 1 ora a temperatura ambiente.
- Incubare le sezioni con primariesoluzione di anticorpi (Runx2 coniglio anti-topo o di coniglio anti-topo DMP1) a 4 ° C durante la notte. Lavare con PBS per tre volte.
- Incubare le sezioni con soluzione di anticorpo secondario (goat anti-rabbit, Alexa Fluor 488) per 2 ore a temperatura ambiente. Lavare con PBS per tre volte.
- Pulire l'acqua intorno alla sezione e rilasciare DAPI nel cerchio per coprire la sezione sulla diapositiva. adagiarvi la polizza di copertura.
5. Microscopia confocale
- Catturare immagini di cellule fluorescenti usando un microscopio confocale a lunghezze d'onda che vanno da 488 micron (verde) a 561 micron (rosso). Una serie di immagini sovrapposte a 200 Hz (dimensioni di 1.024 × 1.024) 19 utilizzando 10X, 20X, 63X e lenti.
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Representative Results
I condrociti Direttamente trasformarsi in cellule ossee (osteoblasti e osteociti) nel mandibolare Condilo e delle ossa lunghe.
Aggrecan, un gene critico per condrogenesi, si esprime soprattutto nelle prime e mature condrociti 18. Come risultato, l'iniezione di tamoxifene a 2 settimane di età in AGG-Cre ERT2; Topi Rosa26 tdTomato attivati il giornalista rosso-pomodoro in tutti i condrociti e le loro cellule figlie. La linea 2.3Col1a1-GFP ha dato luogo a un colore verde-fluorescenti in collagene 1-esprimendo cellule ossee, in particolare osteoblasti e pre-osteociti. Il colore giallo (rosso combinato con verde) indica la presenza di cellule ossee chondrocyte derivate che esprimevano il gene collagene 1. In figura 2A, la maggior parte delle cellule ossee nel processo condilare sotto la cartilagine erano rosso o yellow (una cellula rossa che aveva cominciato a secernere verde fluorescente COL1A1, così che appare giallo quando i due fluorofori sono stati sovrapposti). Questi risultati fornirono forte prova che queste cellule ossee sono stati ottenuti da condrociti. Risultati simili sono stati osservati anche durante lo sviluppo dell'osso lungo, dove la maggior parte delle cellule ossee derivavano da condrociti sia l'epifisi (Figura 2B) e la metafisi (Figura 2C).
Per indagare ulteriormente questi risultati, abbiamo attraversato topi Col10al-Cre con Rosa26 tdTomato; Topi 2.3Col1a1-GFP. Col10a1 è un marker altamente specifico per HC, espresso solo in HC e dei loro discendenti. Inoltre, Col10a1-Cre è non-inducibile, che riflette la differenziazione delle cellule fin dall'inizio di espressione Col10a1 (a E14.5). Nel trabecole vicino all'interfaccia cartilagine ossea (livello superiore) di 3 settimane di età topi, rosso e some cellule fluorescenti gialli erano predominanti, mentre le cellule fluorescenti verdi erano scarse. In una zona leggermente più inferiore (livello medio), la maggior parte delle cellule sono state giallo fluorescenti, con poco meno fluorescente rossa. Le cellule fluorescenti verdi sembravano dominare solo nella zona più inferiore del processo condilare (livello inferiore) (Figura 3) .Questo tendenza indica che la crescita del condilo è in gran parte contribuito a dalle cellule ossee trasformate da HC. La distribuzione delle cellule fluorescenti rossi e verdi nel processo condilare è anche coerente con la direzione inferiore a superiore della crescita del condilo.
La tecnica di linea cellulare tracciando dimostra chiaramente che l'apoptosi non è l'unico destino per HC. Entrambe le linee Agg-Cre ERT2 e Col10a1-Cre indicano che le cellule ossee chondrocyte di derivazione sono la fonte principale per lo sviluppo delle ossa nel processo condilare e nella epifisie metafisi in ossa lunghe.
Co-applicazione di colorazione di immunofluorescenza e Cell Lineage Tracing Consente l'inseguimento di Cell Differentiation.
La tecnica di tracciamento linea cellulare può anche essere combinato con immunoistochimica fluorescente per determinare il tipo di cellula dal rilevamento di un marcatore specifico-cellula. Questo metodo presenta diversi vantaggi per lo studio del destino cellulare. Innanzitutto, il ricercatore può ancora definire le caratteristiche cellulari selezionando marcatori appropriati, anche senza la specifica linea di GFP mouse, che allarga la domanda di linea cellulare tecnica tracciamento. In secondo luogo, semplifica la generazione di topi composti. Per esempio, abbiamo solo bisogno di generare Agg-Cre ERT2; Topi composti Rosa26 tdTomato per produrre il colore rosso dopo l'attivazione di Cre (a postnatale giorno 3), invece di creare Agg-CreERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato topi, che richiede più croci.
In questo studio, abbiamo scelto due anticorpi per immunofluorescenza colorazione. Uno era contro Runx2, un fattore trascrizionale critico durante la maturazione degli osteoblasti (fase iniziale di cellule osteogeniche); l'altro era contro DMP1, espresso in osteociti matura (fase avanzata di cellule osteogeniche). Nella Figura 4, la fluorescenza verde rappresenta il Runx2 o DMP1 anticorpo espressione nel 2 settimane di età processo condilare. In Figura 4A, tre tipi di cellule colorate nell'osso subcondrale sono presenti. Il colore giallo (sovrapposizione di fluorescenza rossa e verde) nel nucleo rappresenta le cellule ossee chondrocyte derivate esprimono Runx2, indicando che queste cellule erano osteoblasti immaturi sulla superficie dell'osso. In aggiunta, ci sono stati rossi fluorescenti le cellule ossee che non hanno espresso Runx2 (F rossoluorescence senza verde sovrapposto). Queste cellule rappresentano cellule ossee chondrocyte di derivazione maturi nella matrice ossea. Le cellule meno comuni sono stati quelli con solo nuclei verdi fluorescenti, indicando cellule ossee non condrociti-derivati con l'espressione Runx2 o una trasformazione che si è verificato prima dell'attivazione Cre. L'immagine suggerisce che le cellule ossee rossi e quelli con nuclei gialli erano le popolazioni cellulari maggioranza contribuiscono alla formazione di osso subcondrale condilare.
D'altra parte, quasi ogni rosso, condrociti derivati da cellule ossee nella matrice ossea aveva DMP1 colorazione intorno ai loro corpi cellulari. Pochi osteociti sono stati positivi per DMP1 ma mancava corpi cellulari rossi (Figura 4B). Ci sono anche due possibili spiegazioni per queste cellule: o sono cellule ossee non condrociti-derivato, o sono cellule ossee chondrocyte di derivazione che hanno trasformato prima dell'iniezione tamoxifene. Inoltre, non le cellule ossee rossisulla superficie dell'osso espressa DMP1, indicando che non erano maturi osteociti.
Nel loro insieme, i dati dei pattern di espressione sia per la precoce (Runx2) e marcatori in fase avanzata (DMP1) di cellule osteogeniche sono stati coerenti con il risultato precedente usando Cre combinato con 2.3Col1a1-GFP. Questi dati dimostrano che la combinazione di immunofluorescenza e Rosa26 tdTomato tracing è un buon modo per studiare il destino della cellula. Ancora più importante, gli investigatori possono distinguere il tipo di cellula, identificare la fase di differenziazione, e osservare il numero di cellule trasformate simultaneamente utilizzando immunofluorescenza con diversi marcatori, che fornisce più informazioni rispetto Rosa26 tdTomato tracciamento da solo.
Figura 1. Il meccanismo per cellulare Lineage Tracing e THe Generazione dei topi Compound. A) Il sistema Cre-loxP è comunemente usato in lineage tracing. Cre accise la sequenza di stop tra i due siti loxP, e la proteina tdTomato (fluorescente rosso) si esprime in modo permanente nella linea cellulare specifica. B) Tre modelli animali sono menzionati in questo documento. Abbiamo usato 2.3 COL1A1-GFP; Topi Rosa26 tdTomato e le hanno incrociate con i topi Col10a1-Cre. Col10a1-Cre è non-inducibile, che riflette la differenziazione cellulare fin dall'inizio di espressione Col10a1 (a E14.5). C) Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2) è un'altra linea Cre anche incrociati con 2.3Col1a1-GFP; Topi Rosa26 tdTomato. Cre è stato attivato a 2 settimane di età da una iniezione di tamoxifene (Tm: tamoxifene). D) Al fine di combinare la immunofluorescenza con linea cellulare tracciato, abbiamo generato Agg-Cre ERT2; <em> topi Rosa26 tdTomato, attivati Cre a postnatale giorno 3, ed eseguito il Runx2 e DMP1 immunofluorescenza (Tm: tamoxifene). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2. La trasformazione da condrociti a cellule ossee (osteoblasti e osteociti) nel mandibolare Condilo e delle ossa lunghe Uso Agg-Cre ERT2; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Mice composti. A) Cre è stato attivato da tamoxifene il giorno postnatale 14, ed i topi sono stati sacrificati a 4 settimane. C'erano tre celle colorate nella processo condilare: rosso puro (cellule ossee chondrocyte-derivato), giallo (rosso combinato con il verde, che indica cellule ossee chondrocyte di derivazione che esprimevano il gene del collagene 1), e verde puro (cellule ossee non chondrocyte derivato con il collagene 1 gene) . La maggior parte delle cellule ossee nel processo condilare sotto la cartilagine erano rosso giallo o puro (frecce bianche), mentre poche cellule ossee erano verdi (frecce blu). Questi dati forniscono una forte evidenza che condrociti trasformano direttamente in cellule ossee e contribuiscono alla formazione del processo condilare durante lo sviluppo (Tm: tamoxifen; C: cartilagine; B: osso). B, C) La maggior parte delle cellule ossee in epifisi e metafisi sono stati condrociti-derivato (freccia bianca: le cellule ossee chondrocyte-trasformato in giallo o rosso puro; blu freccia: cellule ossee non chondrocyte-derivati in puro verde; AC: articolare cartilagine; GP: la crescita piatto).blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3. La trasformazione da condrociti alle cellule ossee nel mandibolare Condilo Utilizzando Col10al-Cre; 2.3Col1a1-GFP; Rosa26 tdTomato Mice composti. A) Nel processo condilo da 3 settimane di età topi, cellule ossee verdi erano una minoranza distinta nel trabecole vicino all'interfaccia cartilagine-osso (livello superiore, A1), mentre il rosso e alcune cellule gialle erano predominanti. Nel livello medio (A2), le cellule gialle erano la maggioranza, con un po 'meno globuli rossi. Cellule verdi sembravano essere nella maggioranza solo nella zona più inferiore (a3). Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4. La co-localizzazione dei due marcatori per cellule osteogeniche con lo sfondo lineage tracing nel processo Condylar Uso 2 settimane di età Agg-Cre ERT2; Rosa26 tdTomato Topi composti. A) Il colore giallo nei nuclei rappresenta cellule ossee chondrocyte derivate esprimono Runx2 (frecce bianche) sulla superficie dell'osso trabecolare sotto la cartilagine condilo. Le cellule ossee rossi puri senza espressione Runx2 rappresentano cellule ossee chondrocyte di derivazione mature nella matrice ossea (frecce gialle). il fewecellule st erano quelli che trasportano solo nuclei verdi, che rappresentano cellule ossee o non chondrocyte di derivazione o cellule ossee trasformate da condrociti prima dell'attivazione Cre (Tm: tamoxifene). B) In dell'osso trabecolare sotto la cartilagine del condilo, quasi tutti i condrociti di derivazione delle cellule ossee rosso nella matrice ossea effettuata DMP1 colorazione intorno ai loro corpi cellulari (frecce bianche). Solo alcuni degli osteociti sono risultati positivi per DMP1 ma mancava colore rosso nei loro corpi cellulari (frecce gialle). Ci sono due possibilità per queste cellule: cellule ossee non chondrocyte di derivazione o cellule ossee chondrocyte di derivazione derivanti prima dell'iniezione tamoxifene. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
A causa di limitazioni tecnologiche, è sempre difficile studiare il comportamento delle cellule in vivo. Tuttavia, la tecnica linea cellulare tracciamento sta dimostrando di essere un potente strumento per lo studio della biologia delle cellule 7-9. In questo studio, abbiamo migliorare ulteriormente questo protocollo attraverso la combinazione con immunofluorescenza. In questo modo, il destino della cellula può essere definita da più marcatori correlate, che estende l'applicazione di lineage tracing. Inoltre, questa co-localizzazione dei segnali immunofluorescenza e pomodoro visualizza contemporaneamente il numero della progenie della cellula fondatore, la loro posizione e il loro stato di differenziazione, fornendo più informazioni rispetto linea cellulare tracciamento solo. Inoltre, l'uso di marcatori specifici delle cellule può semplificare la generazione di topi composti, accelerando l'indagine.
La specificità di Cre è di fondamentale importanza per l'attribuzione inequivocabile della stirpe e la precisione dei risultati 20,21. È molto important per selezionare le linee Cre opportune per verificare il destino delle cellule. In questo studio, abbiamo scelto Col10a1, perché è considerato un marcatore specifico per condrociti ipertrofici 10,11, e aggrecano, perché è anche un indicatore ben noto per i condrociti 18. Ci sono anche modelli buoni Cre utilizzati in altri campi. La linea Scleraxis-Cre (SCX-Cre), per esempio, è utile in tendini e legamenti ricerca dal scleraxis è un fattore di trascrizione helix-loop-helix base che è un marcatore per il tendine e legamento cellule lineage 22. Un altro Cre chiamato DMP1-Cre è comunemente utilizzato negli studi skeleton- e denti legati perché DMP1 è altamente espresso in odontoblasts e osteociti 23,24.
Rispetto ai sistemi Cre non inducibili, l'attivazione di inducibile Cre può essere limitato spazialmente e temporalmente 20. Tuttavia, alcune limitazioni dovrebbero essere considerati quando si progetta l'esperimento e interpretazione dei risultati dimodelli Cre inducibile. Innanzitutto, la dose di tamoxifene può cambiare l'efficienza dell'attivazione Cre e il numero di cellule marcate. Basse dosi saranno etichettare la popolazione di interesse ad una densità clonale 25; dosi elevate possono etichettare l'intera piscina progenitore 7,26. Pertanto, la dose deve essere scelto a seconda dello scopo dell'esperimento. In secondo luogo, tamoxifene ha potenziale tossicità, specialmente in dosi elevate 27,28. Per questo motivo, è preferibile ridurre la dose per evitare aborti tardo termine l'iniezione durante la gravidanza 29.
In conclusione, la co-applicazione di tecniche tracing linea cellulare e immunofluorescenza è un potente strumento per studiare biologia cellulare in vivo. In futuro, gli investigatori possono tentare di eseguire contemporaneamente immunofluorescenza con due anticorpi differenti sopra i precedenti segnali di pomodoro. Questo metodo può mostrare il pattern di espressione per due marcatori in una sezione, rendendo più facile per ilinvestigatore per confrontare e analizzare i risultati. Inoltre, questa co-applicazione può essere ulteriormente migliorata in situ immunofluorescenza per diminuire colorazione non specifica che può esistere attraverso immunofluorescenza convenzionale.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
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