Introduction
As mitocôndrias são classicamente descritos como a potência celular, uma vez que eles são os principais lugares de produção de energia em células diferenciadas. Além disso, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no metabolismo, a geração de calor, a modificação lipídica, o cálcio e homeostase redox, a orquestração de processos de sinalização de células, etc 1. As mitocôndrias desempenham também um papel activo na indução de morte celular 2, bem como na regulação do ciclo celular 3. Essa multifuncionalidade levanta as seguintes questões fundamentais: a) como mitocôndrias desempenhar todas estas funções em simultâneo e b) existem piscinas mitocondriais específicos ou subzonas que são especializados para funções distintas? Neste contexto, é importante notar que as mitocôndrias são multifuncionais dinâmica na sua forma, tamanho e estrutura dentro das células individuais e que a forma de estado estacionário de mitocôndrias pode variar entre os tipos de células. Décadas de pesquisa de vários laboratóriooratórios sugerem que a alteração da forma mitocondrial, tamanho e estrutura, chamados coletivamente de dinâmica mitocondrial, é crucial para a manutenção de várias funções mitocondriais 4,5,6. Estes resultados levantam a possibilidade de que mitocôndrias podem cumprir a sua multi-funcionalidade em virtude do seu dinamismo estrutural.
grandes esforços estão em curso para entender a relação estrutura-função mitocondrial. A dinâmica da estrutura mitocondrial é mantida principalmente pela sua capacidade de sofrer eventos de fissão e de fusão com o outro. Fissão de grandes mitocôndrias converte-os em elementos mitocondriais menores, enquanto a fusão entre duas mitocôndrias menores funde-os em um elemento mitocondrial maior 7. Além disso, a fusão de duas mitocôndrias transiente pode ocorrer para permitir a mistura do seu conteúdo. Os eventos de fissão e de fusão das membranas mitocondriais interior e exterior são cuidadosamente regulada pela especificaçãoific conjuntos de proteínas. A maquinaria do núcleo fissão é composto de proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1), que é recrutados a partir do citosol para a mitocôndria pela sua interacção com certos bona proteínas mitocondriais fide (por exemplo, Fis1 ou Mff1), enquanto função Drp1 também pode ser regulado por outras proteínas na superfície mitocondrial 4. Embora Drp1 opera na membrana externa, as suas capacidades de fissão impacto da membrana interior assim. A orquestração da cisão das membranas mitocondriais exteriores e interiores não é bem compreendido. Por outro lado, a fusão da membrana interna é regulada no núcleo pelas actividades de OPA1, enquanto mitofusins governar a fusão da membrana externa 5. O saldo das contrariando fissão e fusão eventos de mitocôndrias ditar a forma mitocondrial steady-state em uma célula. Por exemplo, a repressão da fissão mitocondrial resultaria em fusão completa e sem oposição, enquanto que a sobre-actividade das mitocôndriasl fissão resultaria em fragmentação da mitocôndria 3.
O estudo da relação estrutura-função mitocondrial envolve principalmente duas abordagens complementares: a) análise dos fenótipos celulares e organismais após a manipulação genética de proteínas fissão / fusão mitocondrial e b) as avaliações diretas de estrutura e função mitocondrial. É digno de nota que as análises genéticas podem nem sempre revelar a funcionalidade directa da molécula no lado (neste caso, as proteínas de fissão / fusão mitocondriais), como os fenótipos podem surgir devido a efeitos secundários. Portanto, é de extrema importância para desenvolver e usar ferramentas para estudar a estrutura e função mitocondrial diretamente. Qualquer avaliação da estrutura mitocondrial envolve várias ferramentas de microscopia. Uso de microscopia de fluorescência de células vivas tem avançado muito nos estudos de dinâmica mitocondrial, uma vez que o dinamismo mitocondrial pode ser monitorado de forma qualitativa e Quantitätvamente utilizando as ferramentas e técnicas apropriadas 8 de microscopia de fluorescência. Ferramentas com base em microscopia de fluorescência foram desenvolvidos para estudar a estrutura e a função mitocondrial em tecidos vivos e fixos de Drosophila melanogaster, elucidar a importância de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estes e os métodos relacionados são descritos aqui, com o objectivo de estudar a estrutura e a função mitocondrial no ovário de Drosophila.
O ovário Drosophila consiste em germinativas e somáticas linhagens, que surgem a partir de suas respectivas células-tronco adultas que residem no germário 10,11. Dezesseis células germinativas sincicial (GCs) se encapsulado por células do folículo somáticas (FCS) para formar câmaras de ovos individuais que emergem fora do germário (Figura 1). Um dos 16 GCs se comprometeu a tornar-se um oócito, e os restantes 15 GCs desenvolvem em células enfermeira que suportam o crescimento da câmara de oócito, Facilitando a maturação do ovo, antes de ser colocado. A maioria dos CFs submetidos a 9 ciclos de divisões mitóticas antes de sair do ciclo celular mitótico para diferenciar terminalmente em uma camada de células epiteliais modelado que consiste de células anterior dos folículos (AFCs), células foliculares posterior (PFC), e as células do corpo principal (CBMs) . As câmaras de ovo consecutivos são ligados por células haste, que são células que são também derivados das CFs no início do desenvolvimento diferenciadas. Forma mitocondrial regulado pelo Drp1 proteína fissão mitocondrial está ativamente envolvido no processo de diferenciação durante o desenvolvimento normal da camada FC ovário Drosophila 9,12. Os métodos utilizados nestes estudos para identificar o envolvimento de Drp1 em Drosophila desenvolvimento da camada de células do folículo são descritos aqui.
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Protocol
1. Preparação de Drosophila (as ferramentas necessárias estão representados na Figura 2A)
- Para qualquer uma das experiências descritas, recolher Drosophila (mantido à temperatura ambiente ou 25 ° C) dentro de 5 dias após a eclosão e colocá-los num frasco encheu-se com 5-7 mL de Drosophila alimentos (ver Materiais Tabela), com não mais do que 25 voa em cada frasco; manter uma relação feminino: masculino de 2: 1.
- Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos de Drosophila. Executar a manipulação experimental dentro de 2 - 4 dias.
2. Dissecção de Drosophila ovários (as ferramentas necessárias estão representados na Figura 2A)
- Quente inseto dissecando médio (ver Materiais Tabela) à temperatura ambiente, 25 ° C. Encha três poços de uma de oito poços prato de dissecação de vidro, com 200 uL de meio em cada poço.
- Anestesiar Drosophila com CO
- Ao olhar através da ocular do microscópio de dissecação, separar o tórax do abdômen usando dois pares de fórceps. Usando fórceps, transferir cuidadosamente os abdómens para o segundo poço do prato.
- Utilizar um par de pinças para segurar o abdómen na extremidade posterior, e lentamente empurrar para fora os ovários (juntamente com os outros conteúdos abdominais) com o outro par de fórceps. Se essa tentativa falhar, remova cuidadosamente o exoesqueleto abdominal, inserindo as pinça na extremidade anterior para liberar os ovários.
- Usando a pinça, segure um ovário indivíduo pela extremidade posterior opaca (ou seja, os ovos encheu-gema, em estágio final) e movê-lo com cuidado para o terceiro poço do pratopara provocando a processá-lo por microscopia vivo (passo 3) ou para a fixação de realizar imunocoloração (passo 7).
- Cuidadosamente provocar a bainha protectora em torno dos ovários por varrer uma agulha provocação levemente a partir do posterior à extremidade anterior de cada ovário, mantendo-o pela extremidade posterior com um par de fórceps.
NOTA: Para minimizar os danos durante a provocação, dobre a ponta da agulha e zoom em cada ovário, aumentando a ampliação do microscópio (Figura 2A). Traquina deve ser suficientemente eficaz para romper o invólucro, mas também deve ser feito com cuidado para preservar a integridade dos ovarioles.
3. Preparação para microscopia de tecido vivo
NOTA: As ferramentas necessárias são representadas na Figura 2A.
- Antes de Drosophila dissecção, preparar câmaras revestidas polyl-lisina. Para este fim, colocar duas gotas de 20 ul de polyl-lisina (0,1 mg / mL) na coverglburro (14 mM, n ° 0) de uma placa de Petri com fundo de vidro (35 mm) a uma distância razoável entre si, a fim de evitar a fusão das gotas. Secar as placas durante 1 h a 37 ºC e marcar os bordos da película branca polyl-lisina sobre o lado inferior da placa com um marcador apagável.
NOTA: O polyl-lisina-revestidas câmaras podem ser armazenadas a 4 ° C durante uma semana. Se estiver usando uma câmara previamente revestido, trazê-lo à temperatura ambiente antes de iniciar a dissecção Drosophila. - Definir os parâmetros de verificação no microscópio confocal para se certificar de que a amostra pode ser fotografada imediatamente após a conclusão da dissecção e montagem, como abaixo.
- Coloque um dissecados e provocou ovário (passo 2 e coradas, se necessário, seguindo o passo 5) sobre uma região polyl-lisina-revestidas marcado e espalhar o ovário com a agulha para separar os os ovarioles. Colocar uma gota de 10 ul de meio de dissecação de insectos no topo do ovário, certificando-se de cobrir tele área inteira polyl-lisina-revestido. Cubra o prato de petri.
- executar imediatamente microscopia confocal da amostra montada à temperatura ambiente.
NOTA: Apenas um Drosophila deve ser dissecado, processado, e fotografada de cada vez. Além disso, a microscopia não deve ser realizada a 37 ° C, o que vai imitar um meio de choque de calor para o tecido de Drosophila.
4. Fluorescência perda de Fotodegradação (FLIP) Ensaio para avaliar Mitocondrial Matrix Continuidade
NOTA: a continuidade da matriz mitocondrial numa estrutura mitocondrial fundido é estabelecido após a fusão completa das membranas interna e externa mitocondriais seguintes uma progressão através dos passos intermediários. Cisão da mitocôndria podem seguir os mesmos passos, mas no sentido inverso (Figura 3A). FLIP é um método semi-quantitativo com base em microscopia de lapso de tempo que pode ser usado para avaliar a continuidade da matriz mitocondrial noestado fundido final do ex vivo mitocôndrias (as etapas 3 e 4 na Figura 3A) em vivo ovários Drosophila 9. O ensaio FLIP é realizada como uma pequena região de interesse (ROI) da mitocôndria que expressam uma molécula fluorescente na matriz mitocondrial que está Foto-descoloração em intervalos regulares (ROI FLIP na Figura 3A). Como resultado, qualquer região mitocondrial circundante que é contínua com a ROI FLIP (ROI experimental na Figura 3A) vai perder o sinal devido à permuta de moléculas na matriz mitocondrial contínua. As experiências demonstraram FLIP aqui são realizados em Drosophila transgénico expressando mitoYFP, que contém a sequência de direccionamento mitocondrial do citocromo oxidase subunidade VIII humano marcado com YFP ao alvo para a matriz mitocondrial numa forma livremente difusíveis. Uma experiência semelhante também pode ser realizada com o transgene Mito UPAEP-MITO-GFP, conforme relatado anteriormente <sup> 9. Um protocolo semelhante FLIP pode ser usado com uma sonda de alvo para o espaço inter-membrana mitocondrial para ser capaz de detectar a continuidade resulta da fusão do exterior, mas não a membranas mitocondrial interna (passo 2 na Figura 3A).
- Abra o software de aquisição de imagem no microscópio confocal e definir os parâmetros de digitalização apropriadas na guia "Aquisição" (Tabela 1). Verifique a "série Time", "Branqueamento" e "Regiões" caixas para abrir as guias individuais. Colocar os valores dos parâmetros de aquisição adequadas em cada aba (Tabela 1).
NOTA: O pinhole deve ser deixada em aberto, como esta experiência foi projetado para monitorar sinal geral de toda a população mitocondrial em células individuais. - Use a ocular para localizar rapidamente o campo de interesse no tecido vivo montado.
NOTA: Selecione o ovarioles que estão bem espalhados no vidro-bottomed prato, uma vez que a microscopia confocal não pode ser executada em ovarioles flutuantes. - Clique em "ao vivo" para adquirir uma imagem ao vivo do campo selecionado de interesse. Clique em "stop" para parar a varredura ao vivo.
- Se necessário, ajustar os parâmetros de aquisição de tal forma que o sinal fluorescente detectado é abaixo dos níveis de saturação (indicado pela ausência de pixels vermelhos quando a opção "indicador de faixa" está marcada), com o plano de fundo definida como definido ajustando os valores de deslocamento.
- Desenhe um pequeno ROI utilizando a ferramenta de desenho Bezier na guia "Regiões" para demarcar a zona de fotodegradação na imagem adquiridos por varrimento ao vivo.
NOTA: O tamanho da ROI deve ser cerca de 20 - 50% do sinal fluorescente mitocondrial total dentro da célula. - Realizar a aquisição de imagem clicando em "começar a experiência."
- Quantificar a intensidade de fluorescência usando a propriedade ou o software de código aberto (ver MateriaisTabela). Gravar o sinal média do ROI em que o branqueamento repetitivo é direcionado (FLIP); ROIs branqueamento onde não foi realizada na mesma célula (experimental); o ROI de outra célula crus no mesmo campo de visão, para avaliar o branqueamento global durante o período experimental (branqueamento); eo ROI na área de fundo (background). Subtrair o sinal de fundo médio obtido a partir do sinal significativo na outra ROIs. Normalizar o sinal fluorescente com o sinal pré-lixívia inicial para a respectiva célula.
- Plotar os dados normalizados usando qualquer software de plotagem padrão.
5. A coloração vivo com Fluorescente mitocondrial Corantes
NOTA: a estrutura mitocondrial em estado estável e potencial pode ser avaliada utilizando corantes que incorporam especificamente para dentro da mitocôndria em células vivas e tecidos. Ovários ao vivo de Drosophila pode ser manchado ex vivo com mitocondrial fluorescentecorantes para a visualização da mitocôndria, para avaliar as espécies de oxigénio reactivas mitocondriais (MITO-ROS) de produção, e para avaliar o potencial mitocondrial por unidade de massa. Isto pode ser conseguido por co-coloração com o corante éster mitocondrial potenciométrica tetrametilrodamina etilo (TMRE) e uma mancha mitocondrial vivo compatível representando a massa mitocondrial (ver Materiais Tabela para os corantes específicos).
- Diluir o estoque das manchas em inseto quente dissecando meio para as concentrações de trabalho finais: mancha mitocondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; e MITO-ROS mancha, 5 uM.
- Após a dissecção e provocando os ovários seguinte passo 2, colocar os ovários em 200 uL de qualquer de solução de coloração específica em um poço de um prato de dissecação. Incubar durante 10 min los com o prato coberto por uma caixa adequada embrulhado com folha de alumínio para proteger da luz. Lave os ovários manchadas, movendo-os cuidadosamente com uma pinça em 3 poços consecutivos contendg meio sem mancha.
- Para co-coloração com TMRE ea mancha mitocondrial global compatível, siga o protocolo acima para manchar primeiro com TMRE e logo em seguida com a mancha mitocondrial geral (sem quaisquer passos de lavagem entre).
- Monte os ovários em um prato com fundo de vidro polyl-lisina revestido seguinte passo 3 e se preparar para a microscopia confocal com os parâmetros de digitalização apropriadas (Tabela 1), seguindo os passos 4,2-4,4.
NOTA: O sinal a partir dos corantes incorporados não durou quando tentando montar as amostras coradas em meio de montagem. - Marque a caixa-seccionamento Z para abrir a guia. Gire o anel de foco para a parte inferior da amostra enquanto ele está sendo live-digitalizada e clique em "definir em primeiro lugar" para definir o Z-seção da extremidade inferior. Faça o mesmo ao mover a roda de foco para outra direção para definir a seção superior.
- Realizar a aquisição de imagem clicando em "começar a experiência."
- Quantificar a intensidade de fluorescência corrigido-fundo das ROIs para o sinal de fundo e as células individuais (como no passo 4.7) e plotar os dados usando qualquer software de plotagem.
6. Geração de Drp1 Null Mosaicos
NOTA: A estratégia clonal usada aqui introduz proteína fluorescente (GFP) -negative clones nulos Drp1 verdes no fundo de um, fenotipicamente fundo de tipo selvagem GFP-positiva que é heterozigoto genotipicamente para o Drp1 mutação nula 9. -Choque induzido calor alvo reconhecimento flipase-flipase (FLP-FRT) site-specific mediada mitótico recombinação cria clones homozigotos do alelo drpKG03815 funcionalmente nula. O genótipo de Drosophila carregando o mutante Drp1 é drpKG03815 FRT40A / CYO, enquanto o genótipo carregando o FLP induzida por choque térmico (hsFLP) e UbiGFP marcador clonal é hsflp; NLS-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / CYO. O genótipo da SEprole selecionada do cruzamento entre os genótipos acima é hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- Sincronizar a Drosophila para coleta virgem, movendo-os em novos frascos de comida fresca a cada 2 a 3 dias. Monitorar os frascos pupariating diária, a fim de recolher fêmeas virgens emergentes.
- Recolha, encaracolado-asa fêmeas virgens Vermelho-eyed do genótipo mutante Drp1 a cada dia, uma de manhã e outra à noite, e colocá-los em um frasco separado. Em paralelo, colete masculino Drosophila com os olhos vermelhos escuros e asas retas que transportam hsflp e UbiGFP no prazo de 5 dias de eclosão.
- Configurar uma cruz adicionando os machos às fêmeas virgens com uma relação feminino: masculino de 2: 1.
- Polvilhe uma pequena quantidade de levedura granulada para estimular a produção de ovos.
NOTA: mover cuidadosamente a Drosophila para um frasco fresco de meios de comunicação a cada 2 a 3 dias para aumentar a quantidade de descendentes e para reduzir a aglomeração frasco. - Aesthetize, classificar e recolher straight-alados, descendência feminina de olhos vermelhos no prazo de 5 dias de eclosão.
- Para o choque térmico, colocar o Drosophila recolhido em frascos vazios com uma pequena quantidade de levedura granulada e um pequeno, macio limpar (para absorver a humidade durante o choque térmico). Colocar o frasco com a Drosophila num banho de água a 38 ºC durante 1 h, para gerar clones de células, principalmente dos folículos, e a 37 ºC durante 1 h, duas vezes por dia (que permite, pelo menos, 5 h entre os choques 2 de calor) durante 2 dias consecutivos , a fim de gerar clones de células do folículo linha germinal e.
NOTA: Certifique-se de que o frasco é completamente submerso na água até o nível do plugue. - O choque térmico pode tornar o imóvel Drosophila. Permitir que a Drosophila calor chocado a recuperar durante 1 h à temperatura ambiente quando se tornam novamente móvel.
- Adicione os homens de volta para as mulheres na mesma proporção que na cruz, e movê-los para frascos frescos com medium aspergido com uma pequena quantidade de levedura granulada. Manter a Drosophila durante pelo menos 5 dias.
- Dissecar os ovários como necessário para uma experiência ao vivo ou fixo.
NOTA: Os ovários isolados do parental de Drosophila que expressam UbiGFP devem ser utilizados como controlos negativos para confirmar a indução eficiente de clones GFP-negativo pelo choque térmico.
7. Co-imunocoloração para ciclina E e mitocôndrias
NOTA: Para detectar Drosophila ciclina E (dCyclinE), utilizou-se um anticorpo obtido comercialmente levantada especificamente contra dCyclinE 9 (ver Materiais Tabela). Como um marcador mitocondrial, utilizou-se um anticorpo contra o ATP-B (uma subunidade do complexo de ATP sintase mitocondrial) 9.
- Quente 4% de paraformaldeído (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. Cuidado! O paraformaldeído é tóxico.
NOTA: Após a aberturaa ampola, PFA deve ser armazenada a 4 ° C e usadas dentro de 7 dias. Isto é porque o armazenamento de PFA podem permitir a oxidação de metanol, o que iria alterar drasticamente membranas mitocondriais durante a fixação, mesmo que presente em quantidades vestigiais. - Imediatamente após a dissecação, corrigir os ovários dissecados, colocando-os em 200 mL de PFA fresco em um poço de um prato de dissecação de vidro (sem provocação). Manter o prato numa hote durante 15 min. Lavar os ovários fixa, movendo-as cuidadosamente com a pinça em 3 poços consecutivos, cada um contendo 200 mL de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS).
NOTA: O experimento pode ser interrompido aqui e as amostras podem ser deixadas a 4 ºC durante 1 dia. - Provocar os ovários mais completamente em PBS (semelhante ao passo 2.6) para remover cuidadosamente a bainha fibrosa protectora que pode dificultar o acesso antigénio pelo anticorpo.
- Permeabilizar as ovários provocado por colocando-os num tubo de microcentrífuga com 500 ul de 0 recém-preparadas.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-Tx) e incubar durante 30 min enquanto a sacudir a 25 rpm.
NOTA: Durante o balanço, colocar os tubos em paralelo ao movimento de balanço; colocando-os perpendicularmente pode permitir que o tecido para furar a tampa dos tubos, resultando em perda de tecido. - Para remover o PBS-TX, colocar os tubos de microcentrífuga de uma cremalheira para permitir que o tecido se estabelecer na parte inferior dos tubos. Inspecioná-los visualmente e toque os tubos, se necessário, para trazer quaisquer tecidos flutuantes até o fundo. Aspirar cuidadosamente a solução a partir do topo, certificando-se de que o tecido na parte inferior dos tubos permanece sem perturbação.
- Bloquear os ovários por adição de 200 ul de 2% de albumina de soro bovino (BSA) em 0,5% PBS-TX, e incubar em que o balancim à temperatura ambiente durante 1 h. Remova o agente de bloqueio seguindo o passo 7.5.
- Adicionar anticorpos primários em 200 ul de agente de bloqueio fresco: anticorpo anti-coelho dCyclinE (1: 100) e anticorpo anti-rato de ATP-B(1: 100). Incubar os tecidos sobre o roqueiro durante 2 h à temperatura ambiente.
- Lavar os ovários com PBS-TX 3 vezes durante 15 minutos cada, a seguir etapa 7.5.
- Adicionar 200 uL de anticorpos secundários apropriados em PBS fresco-TX: anti-murganho CY3 (1: 1000) e anti-coelho-CY5 (1: 500). Incubar no agitador por 1 h à temperatura ambiente.
- Lavar os ovários com PBS-TX 3 vezes durante 15 minutos cada, a seguir etapa 7.5.
- Para manchar o DNA, adicionar Hoechst (diluição 1: 1.000) para a final de lavagem PBS-TX.
- Finalmente, deixar o tecido em 500 ul de 1x PBS.
- Usando uma micropipeta 1 ml, remover os ovários imunocoradas do tubo de microcentrífuga fresco em um poço de um prato de dissecação de vidro contendo 200 uL de PBS.
- Adicionar uma gota de meio de montagem à base de glicerol a uma lâmina de vidro e adicionar o imunologicamente ovários um por um para o meio de montagem.
NOTA: Certifique-se de que os ovários são, de facto transferidos para o meio de montagem. Caso não o faça so levará a perda de tecido. - Enquanto olha através do microscópio de dissecação, gentilmente arrancar as ovarioles transparentes (fases mais jovens) das câmaras de ovos maduros opacos, utilizando a agulha provocações, mantendo a parte opaca do ovário com a pinça. Retirar as câmaras óvulo maduro a partir do meio de montagem.
- Coloque uma lamela (22 mm, N ° 1) na corrediça e pressione ligeiramente para assegurar que o meio de montagem é espalhado uniformemente por baixo.
NOTA: Pressionar na lamela também garante o alinhamento adequado do tecido ao longo da lamela. Caso não o faça de forma otimizada pode permitir que as fases menores para flutuar no meio de montagem, evitando microscopia óptima desses tecidos. - Secar as amostras durante 15 min e selar as bordas da lamela cuidado com unha polonês.
- Realizar microscopia confocal como por necessidade experimental (Tabela 1).
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Representative Results
Os métodos descritos podem ser utilizados para estudar a estrutura e a função mitocondrial em ovários de Drosophila vivas e fixadas (Figura 2B). São fornecidos alguns exemplos de resultados previstos obtidos com os métodos descritos.
A dissecção do ovário Drosophila: Quando dissecados ainda mais, o abdómen cortadas (Figura 3B) a partir do conjunto de Drosophila (Figura 3A) deve libertar o conteúdo abdominal, incluindo 2 ovários de cada indivíduo de Drosophila. Os ovários intactas aparecem como ovais, estruturas branco (setas na Figura 3C e D) que, idealmente, deve manter-se ligados um ao outro através da haste oviductal. Os ovarioles em cada ovário devem ser mantidas juntas pela bainha fibrosa (# na parte ampliada da Figura 3C), o qual é removido bprovocação cuidado y (seta grossa na Figura 3D; * indica um ovário mal brincou com ovarioles destacados) para expor os ovarioles para a coloração e microscopia. Os ovários liberados com hastes oviductal rasgado durante a liberação do conteúdo abdominal também pode ser usado, desde que não sejam danificados. Quaisquer ovários danificados (* na Figura 3C) e outros conteúdos abdominais (ponta de seta na Figura 3C) deve ser descartado.
Microscopia vivo do ovário Drosophila: Aqui, nós demonstramos a técnica FLIP eo carregamento de corantes estruturais e funcionais mitocondriais em ovários de Drosophila.
A técnica FLIP, anteriormente aplicado para avaliar a continuidade mitocondrial nas células do folículo Drosophila 9, foi demonstrado aqui nas células enfermeira ovarianos de Drosophila transgênico (Figura 4A). FLIP-alvo para uma das nuvens mitocondriais associadas com as células enfermeira leva a uma perda superior a 50% do sinal de fluorescência a partir de ROIs azuis e brancas que cercam o ROI FLIP vermelho dentro de 200 s (Figura 4B e C); o sinal do ROI verde é usado para correcção de fundo. O sinal fluorescente a partir do ROI amarelo nas outras células não-alvo enfermeira permanece constante ao longo deste período de tempo, o que significa o mínimo de branqueamento global durante o curso do tempo da experiência (Figura 4B e C). Além disso, ver vídeo 1. Este resultado indica que a mitocôndriaem enfermeira células se fundiram suas membranas externas e internas, exemplificadas nas etapas 3 e 4 (Figura 4A), enquanto mitocôndrias nas etapas 1 e 2 não são esperados para mostrar qualquer perda de fluorescência neste período de tempo.
Foi previamente demonstrado que uma medida semi-quantitativa de potencial mitocondrial por unidade de massa mitocondrial pode ser avaliada por co-coloração com o corante potenciométrica TMRE e a mancha mitocondrial geral que reflecte massa mitocondrial 13. Aqui, a mesma técnica foi utilizada para demonstrar a avaliação do potencial mitocondrial por unidade de massa de tecido do ovário de Drosophila vivo. A microscopia confocal de ovários de Drosophila vivas corados com TMRE demonstra uma diminuição do sinal com a profundidade do tecido (Figura 5A). Esta perda de sinal fluorescente devido ao aumento da dispersão em maior profundidade o tecido está prevista para ocorrer com qualquer tipo de fluorophore com uma dada distância de trabalho da objetiva em uso. Portanto, é importante distinguir a profundidade máxima do tecido dentro do qual o fluoróforo pode ser detectado durante a imagiologia do tecido vivo. Por exemplo, ao vivo ovários Drosophila coradas com o corante mitocondrial geral (Mito) podem ser visualizados utilizando a configuração do microscópio descrito (Tabela 1) dentro de uma gama de 20 um a partir da lamela, ao passo que a profundidade de geração de imagem máxima diminui com o aumento do tamanho da câmara de ovo (Figura 5B). As configurações microscópio otimizadas para as manchas mitocondriais detectar sinais positivos nos canais de detecção adequados, enquanto as configurações de examinar qualquer sinal de cross-talk indevida ou fluoróforo cross-excitação expectedly detectado mínimo ou nenhum sinal (Figura 6A). Co-coloração de TMRE com o corante mitocondrial geral pode ser usado tanto para qualitativo (Figura 6B) e quantitativa (Figura 6C e D </ strong>) avaliações do potencial mitocondrial por unidade de massa nos ovários de Drosophila vivas. Por exemplo, a) uma análise qualitativa demonstra que o germário Drosophila apresenta maior potencial mitocondrial por unidade de massa em 2b fase em que as células do folículo somático que surgiram para encapsular as células da linha germinal (cabeças de seta na Figura 6B) e b) análise semi-quantitativa demonstrar a diferença de potencial mitocondrial por unidade de massa entre (estiramento) AFCs e os MBCs, como analisado a partir de uma câmara de ovo fase 9 (Figura 6C). Note-se que a quantificação foi realizada a partir de 2 fatias ópticas diferentes para AFCs e CBMs, dependendo do seu plano de foco. O uso da sonda MITO-ROS que tem sido utilizado com sucesso em Drosophila 14 é demonstrado nas camadas vivas Drosophila epiteliais do ovário, células do folículo onde nulos clones funcionais da proteína mitocondrial de fissão Drp1were introduzidas. A maioria, but não todos, dos clones de células do folículo nula vivo GFP-negativo Drp1 exibem coloração elevada para MITO-ROS (Figura 7A e B). Note-se que apesar de um sinal mitocondrial distinta não pode ser detectada neste tecido, a concentração da mancha MITO-ROS poderia ser detectado na região nuclear nas células do folículo pós-mitóticas avançados, que são significativamente maiores do que as células foliculares mitóticas (* na Figura 7C). Isto pode ocorrer devido à interacção de ADN nuclear e o produto de oxidação do corante fluorescente MITO-ROS, que é um derivado de etídio 15.
Detecção de mitocondrial ciclina E em células do folículo do ovário de Drosophila fixadas: Foi recentemente demonstrado que as mitocôndrias pode regular a molécula do ciclo celular ciclina E, recrutando-o para a superfície mitocondrial em células de mamífero e a camada de células de Drosophila folículo
Figura 1. Desenvolvimento das Drosophila ovo Chambers. Dos desenhos que descreve um ovaríolo Drosophila que consiste de uma cadeia de desenvolvimento do ovo câmaras, cada uma composta de um oócito e as células da linha germinal (enfermeira) encapsulados por a camada de células do folículo (somática). As câmaras de ovos se desenvolvem a partir do germário e desenvolver através de estágios em que as células foliculares mitóticas se tornar pós-mitótico. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Plano Experimental e Preparação. Ferramentas (A) utilizados nos métodos descritos: A. frasco mosca; B. Insect dissecando médio; C. paraformaldeído; escova D. Fly; E. Dissecando prato; vidro F. tampa; tubo de G. Microcentrifugue. prato H. vidro de fundo; slides I. Vidro; J. 1000-micropipeta uL; K.-200 uL micropipeta; L. 2,5 mL micropipeta; M. Traquina agulha com uma ponta curvada (dica é ampliada); forceps N. de espessura; forceps O. fina. (B) Um fluxograma esquemático, que representa os métodos descritos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Dissecção de Drosophila ovários. (A) anestesiado inteiro de Drosophila. (B) Severed Drosophila abdomens com ou sem (*) o conteúdo abdominal. (C) Lançado Drosophila conteúdo abdominal, incluindo os ovários (setas e *) e outros conteúdos(setas); ampliação da região em caixa à direita destacando a anterior (Ant) e posterior (Post) termina do par de ovários detidos pelo talo oviductal, onde os ovarioles são realizadas pela bainha fibrosa (#). (D) Teased Drosophila ovário (seta grossa marcação adequadamente provocado e * marcação mal provocava) em comparação com ovário unteased (seta fina). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4.-tecido vivo Ensaio FLIP. (A) Representação esquemática que representa os passos de mitocondrial fissão / fusão, que pode ser ensaiada por um ensaio de continuidade mitocondrial apropriado utilizando o método FLIP; Neste caso, uma sonda de MITO-YFP na matriz mitocondrial permite a assessment de continuidade matriz mitocondrial. (B) Time-lapse ex vivo microscopia de uma câmara de ovo vivo transgênicos Drosophila expressando mito-YFP; apenas momentos selecione (t) são mostrados. Ver Vídeo 1 para todos os pontos de tempo. (C) A quantificação do sinal fluorescente a partir do respectivo ROIs colorido em (B) são expressas após a correcção de fundo e normalização. As setas indicam os momentos fotodegradação reiterativa, ao passo que o intervalo de tempo entre dois eventos de branqueamento consecutivos é o tempo de recuperação. Barra de escala: 10 ^ m. As imagens foram adquiridas com os parâmetros descritos na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Ao vivo mitocôndriasl Coloração e Microscopia da Drosophila ovaríolo. (A) fatias ópticos individuais de um ovaríolo Drosophila ao vivo coradas com TMRE; a imagem foi obtida com os parâmetros descritos na Tabela 1. Z indica a distância a partir da lamela em um. (B) Um Drosophila vivo ovaríolo carregados com o corante mitocondrial geral (Mito). A imagem da linha XZ vermelho na imagem XY é mostrado, em que B é a parte inferior e T é a parte superior da imagem adquirida. A distância a partir do fundo para a linha azul é de 20 uM. Barra de escala: 20 ^ m. As imagens confocais foram adquiridas com os parâmetros descritos na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6. Co-coloração de viver Drosophila ovarioles com TMRE eo mitocondrial Stain geral. (A) slice óptico único de um ovaríolo Drosophila ao vivo co-coradas com TMRE ea mancha mitocondrial geral (Mito); * Indica um artefacto experimental descrito na secção Discussão. (B) de projecção de intensidade máxima de 3 fatias ópticos consecutivas do germário em (A); As setas indicam a região onde a fluorescência TMRE é aumentada. (C) slice óptico único de pós-mitótico câmara de ovo co-coradas com TMRE ea mancha mitocondrial geral. Os painéis superior e inferior mostra o plano de foco para AFCs e CBMs, respectivamente. Parcela (D) da caixa mostrando a intensidade de fluorescência média de TMRE e a mancha mitocondrial total quantificado a partir AFCs e MBCs individuais nas regiões enquadradas em (C). Os bigodes do gráfico de caixa indicam os valores máximos e mínimos para cada grupo, excluindo os valores extremos.
Figura 7. Coloração de Vivo Drp1 Null Mosaic Drosophila ovarioles com o corante Mito-ROS. (A) fatia óptica Único de ovarioles coradas com o corante mito-ROS. (B) a projeção de intensidade máxima de 2 fatias ópticas consecutivas de uma câmara de ovo indivíduo com células do folículo do mitoestágio tic coradas com o corante mito-ROS. (C) fatia óptica Único de uma câmara de ovo indivíduo com células do folículo em fase de pós-mitótico corado com o corante mito-ROS; * Indica um sinal nuclear. A falta de UbiGFP marca os clones Drp1 nulos. Barra de escala: 20 ^ m. As imagens confocais foram adquiridas com os parâmetros descritos na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8. Co-imunocoramento fixo Drp1 Null Mosaic Drosophila ovarioles com dCyclinE e anticorpos ATP-B. (A) de projecção de intensidade máxima de 3 fatias ópticos consecutivos de germário co-histoquímica. (B) de projecção de intensidade máxima de 3 fatias ópticos consecutivos de co-immunostained MBCs pós-mitóticas. Os contornos demarcar os clones nulos Drp1 UbiGFP-negativos. Barra de escala: 10 ^ m. As imagens confocais foram adquiridas com os parâmetros descritos na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9. Exemplos de possíveis danos e Artefatos. (A) germário de UbiGFP-expressando ovaríolo fixadas e coradas com o corante de ADN Hoechst mostrando lacunas indevidos (*). (B) da câmara do ovo de UbiGFP-expressando ovaríolo fixadas e coradas com o corante de ADN Hoechst mostrando nicks / lágrimas (*). (C) Live ovaríolo com clones de nulos Drp1 UbiGFP-negativas coradas com o corante MITO-ROS que mostra uma câmara deformado (*) e uma câmara de ovo danificado, permitindo parcial coloração da linha germinal (**); # Denota uma mancha possivelmente real de uma câmara de ovo sem danos na mesma ovaríolo. (D) vivem ovaríolo manchadas com o mito-ROS tingir mostrando uma câmara danificado geral com intensa fluorescência artificial da linha germinal. * Indica-dano induzido achatada ovarioles com uma perda de sinal UbiGFP, dando assim origem a clones GFP-negativos artifactual. Barra de escala: 20 ^ m. As imagens confocais foram adquiridas com os parâmetros descritos na Tabela 1. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Vídeo 1.-tecido vivo FLIP Ensaio. O curso de tempo completo do ensaio FLIP à base de fotobranqueamento descrito na Figura 5..com / files / ftp_upload / 54989 / video1.avi "target =" _ blank "> Clique aqui para ver este vídeo. (botão direito do mouse para baixar).
Tabela 1: Configurações de microscópio confocal para a aquisição das imagens representativas apresentadas. Por favor clique aqui para ver Tabela 1. (botão direito do mouse para baixar).
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Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
Fotodegradação: Prevenção de fotodegradação indevida de amostras fluorescentes é absolutamente necessário para a realização de microscopia confocal eficiente. Portanto, o tempo usado para localizar amostras através da ocular ou para definir os parâmetros de aquisição de imagem através do modo de varredura ao vivo deve ser minimizado para minimizar a fotodegradação.
O dano tecidual: Uma vez que as mitocôndrias são considerados como sendo os sensores de saúde celular, é extremamente importante assegurar que os dados obtidos utilizando os métodos descritos são fisiologicamente relevante e não reflectem a danos indevidos causada pela dissecção processual dos ovários de Drosophila. A dissecção deve ser realizado tão rapidamente quanto possível, mas também com extrema precaução para minimizar danos nos tecidos. O tempo médio para a dissecção e provocação de 5 Drosophila ovários é de 5 a 7 min (em nossa mãos). Os esforços devem ser tomadas para identificar câmaras de ovo mostrando tecido danificado que serão excluídos das análises. Danos nos tecidos devido à dissecção pode incluir lacunas indevidas (* na Figura 9A, conforme identificado pela falta de sinal), nicks / lágrimas (* na Figura 9B, conforme identificado pela falta de sinal), ou deformação das câmaras de ovos (* na Figura 9C). No entanto, qualquer deformação câmara significativa decorrente da manipulação experimental devem ser cuidadosamente avaliados. Embora não lamela é usada na parte superior do tecido vivo no protocolo descrito, achatamento das ovarioles pode ocorrer com uma pressão excessiva aplicada ao tecido provocando ao mesmo tempo ou de montagem (* na Figura 9D). O achatamento do ovarioles não foi observado com amostras fixadas, uma vez que o protocolo descrito envolve a fixação de tecidos imediatamente após a dissecação, com provocação ocorrendo posteriormente. Qualquer câmara de ovo isolado sem quaisquer assinaturas do aforementioned danos podem ser considerados normais. Os danos mecânicos potencialmente resultante da dissecção, também pode levar à perda de GFP, obtendo-se os clones GFP-negativas falsas 16, e também pode dar origem a incorporação de corante melhorada. Dado que as células da linha germinativa que residem no interior das câmaras de ovos não são normalmente permeável aos corantes mitocondriais vivo (Figuras 6 e 7), a coloração mitocondrial aumentada das células da linha germinal de Drosophila podem resultar de um aumento na permeabilidade do tecido danificado / morrer; um artefacto tal ocorre com o corante MITO-ROS (** na Figura 9C e toda a ovaríolo na Figura 9D), bem como com outras manchas mitocondriais vivo (não mostrado). A perda de UbiGFP na Figura 9D (*) também pode resultar de danos causados que o achatamento das câmaras de ovo. Embora outras câmaras de ovos no ovaríolo danificado pode permanecer autêntica e artefato livre (# na Figura 9C
Sensibilidade Tempo: No caso da microscopia vivo ex vivo, os dados devem ser obtida dentro de 15 min de montagem de tecidos; Caso contrário, os resultados experimentais podem ser afectados por alterações da fisiologia devido à morte resultante do tecido. Algumas vezes, dependendo da potência do laser e outros parâmetros de verificação, os 10 mL de meio de montagem pode evaporar-se mais cedo do que 15 min. A detecção da piscina mitocondrial Ciclina E por co-imunocoloração requer a minimização do tempo de dissecção (provavelmente devido à natureza transiente da mitochondrial ciclina E piscina que é mantido pela respiração mitocondrial ativa 12). Um mitocondrial ciclina E piscina apreciável também não foi observado com tempos de permeabilização com menos de 30 min.
FLIP: O movimento de qualquer câmara de ovo em análise durante o curso de tempo FLIP pode conduzir a análises de artefatos e, portanto, deve ser excluída. A utilização de quaisquer corantes mitocondriais ao vivo ou TMRE não é recomendado em um experimento FLIP, desde a incorporação do corante estrangeiro pode afectar a continuidade mitocondrial e, assim, levar a resultados de artefatos.
Drosophila estratégia de cruzamento: O recíproco transversal ao descrito aqui (onde os machos portadores do alelo mutante Drp1 são usados) não produz muitos descendentes, provavelmente devido a um impacto não identificado de Drp1 repressão nos progenitores macho heterozigóticos.
Interpretação dos dados clonal: Quaisquer clones GF-negativos detectados nos ovários de controleisolado da Drosophila parental expressar UbiGFP indicaria artifactual clones falso-negativos, provavelmente geradas devido à perda de GFP causada por danos durante a dissecção 16. No entanto, o número de clones GFP-negativo na progenitura de calor em estado de choque da cruz deve ser significativamente maior do que quaisquer clones falsos-negativos observados nos controlos. Os clones gerados na camada de células de Drosophila por folículo a estratégia baseada em recombinação mitótico descrito pode surgir a partir de células estaminais do folículo mitóticas (clones de células-tronco) ou a partir de células foliculares mitóticas não estaminais (clones transientes). Para os clones de células-tronco, as análises experimentais deve ser realizada apenas 10 dias após o choque térmico, quando as câmaras de ovo com os clones transitória que já foi estabelecida. Para os clones transientes, as análises deverão ser realizadas dentro de 6 dias após o choque térmico, com os clones de células de folículo os ovarioles sem qualquer clone de células do folículo na germário.
Modificações e resolução de problemas
Ao avaliar o potencial mitocondrial por unidade de massa utilizando o método descrito, a pessoa tem que estar ciente de artefatos potenciais decorrentes da óptica microscópio ou combinações de corantes mitocondriais. Qualquer região que mostra um sinal de largar a mancha mitocondrial total e um sinal TMRE comparativamente elevada (Figura 5A, *) podem surgir devido à fluorescência de transferência de energia de ressonância (FRET) entre os corantes 8 ou devido a diferentes propriedades ópticas do vermelho (TMRE) e verde (corante mitocondrial global) luzes fluorescentes, dado o tamanho pinhole fixo na configuração de aquisição. O artefacto relacionada-FRET pode ser evitado através da redução das concentrações de corantes, se possível, enquanto análises quantitativas podem ser realizadas sobre as projecções de 2 - 3 fatias ópticos consecutivos para evitar o artefacto óptico. Além disso, se um sinal fluorescente é detectada no diafonia e transversal excitaçãocanais, as regulações de laser e o detector deve ser reajustada para minimizar o sinal nestes canais, o que é esperado para reduzir o sinal de fluorescência nos canais óptimas bem.
danificado da fotodegradação reiterative induzida por laser pode causar fragmentação mitocondrial e, assim, causar descontinuidade mitocondrial, impedindo a FLIP bem sucedido. Suspeita de fragmentação das mitocôndrias durante a execução do protocolo de FLIP podem ser identificados através da aquisição de imagens de alta resolução com um orifício reduzido (e aumentando o ganho do detector). Se a fragmentação das mitocôndrias é visivelmente notado durante a execução do protocolo de aleta, a potência do laser de branqueamento deve ser reduzida e / ou o intervalo entre branqueadores consecutivas deve ser aumentada. Se houver branqueamento global durante o curso de tempo da experiência FLIP (sinal do ROI amarelo na Figura 3B e C), o laser de varredura deve ser reajustada para um nívelque permite pouca ou nenhuma fotobranqueamento global.
Para evitar o artefacto potencial devido à perda induzida por dano de GFP, os clones GFP-positiva pode ser introduzido utilizando a estratégia marcm, seguindo o protocolo de choque térmico descrito. Aqui, a Drosophila adequado a ser utilizado para a cruz é fêmea virgem drpKG03815 FRT40A / CYO X masculino Gal80 FRT 40A / CYO; tub-Gal4, UAS-CD8GFP / TM6 9. A progenitura de asa recta deve ser usado para a geração de clones usando o choque de calor (tal como descrito na etapa 6).
Limitações da técnica
A) enquanto as células foliculares que residem na superfície das câmaras vivos de ovos de Drosophila incorporar os corantes de coloração mitocondrial, as células da linha germinativa no interior da câmara de ovo não conseguem fazê-lo; linha germinal das etapas mais jovens manchar fracamente (Figuras 5 e 6). B) O show ex vivo tissue microscopia deve ser realizada dentro de 15 min de conclusão da coloração em ovários isolados a partir de Drosophila individuais, uma de cada vez. Uma vez que os grupos experimentais devem ser processados e visualizados no mesmo dia, o tempo total necessário para obter dados estatisticamente significativa de microscopia de tecido vivo ex vivo a partir de vários grupos experimentais é razoavelmente mais tempo do que os obtidos a partir de tecidos fixos. C) Notou-se que a mancha MITO-ROS não era muito estável no tecido ex vivo de Drosophila, provavelmente devido à natureza transiente da ROS analito que detecta 17,15, que pode estar subjacente a falta de detecção de sinal de todos os Drp1 clones nulos. No entanto, qualquer relevância biológica da variabilidade na coloração mito-ROS nas células nulas Drp1 / clones não pode ser descartada e deve ser investigada. Note-se que o sinal positivo da mancha mito-ROS podem não apenas reflectir reforçada superóxido mas também o mitocondrial ou Cellul reforçadaambiente oxidativo ar 15. D) A coloração mitocondrial em geral não podem ser utilizados para os GFP-negativas ou positivas para GFP clonais experiências, uma vez que o espectro de fluorescência da mancha este mitocondrial e GFP são indistinguíveis. E) O experimento FLIP concebido para ensaiar a continuidade da matriz mitocondrial exigiria aquisição de imagem com um orifício aberto que compreende a resolução das estruturas mitocondriais.
Importância da Técnica em Matéria de Existentes / Métodos Alternativos
Estudar a relação estrutura-função mitocondrial é crucial para uma compreensão completa dos mecanismos de regulação da funcionalidade mitocondrial. Uma vez que os defeitos mitocondriais contribuir significativamente para várias doenças, incluindo a diabetes, câncer, doença de Parkinson, uma compreensão detalhada do modus operandi mitocondrial mantém a promessa de Facilidades Condiçõesng o desenvolvimento de estratégias terapêuticas dirigidas-mitocôndrias. microscopia de células vivas é uma ferramenta indispensável para o estudo da relação estrutura-função mitocondrial. No entanto, a maioria desses estudos tem sido restrita a células isoladas. O estudo da estrutura e função mitocondrial foi estendido para viver tecido Drosophila em uma configuração ex vivo 9. O protocolo descrito desta e de estudos relacionados vai levar a uma compreensão da estrutura e da função mitocondrial em ovários de Drosophila vivas, ex vivo, permitindo uma compreensão das mitocôndrias num contexto fisiológico. Esta abordagem ex vivo tem vantagens significativas sobre estudos in vitro, uma vez que a regulação do metabolismo e propriedades energéticas de mitocôndrias em uma dada célula é em grande parte dependente da disponibilidade de nutrientes e de sinalização adequada no contexto fisiológico das células.
manipulação genética de miestrutura tochondrial reprimindo a Drp1 proteína mitocondrial fissão desregula a modulador do ciclo celular da ciclina E e afecta o desenvolvimento da camada de células de Drosophila folículo ovárico 9,12. Aqui, o protocolo inclui uma descrição de como a introdução de clones funcionalmente nulas de Drp1 nos ovários de Drosophila para estudar a relação estrutura-função mitocondrial. Uma associação de novo mitocondrial ciclina E em células de mamífero, bem como a camada de células de Drosophila folículo 12, foi detectado com sucesso, o que provavelmente está subjacente à regulação Ciclina E relatada por mitocôndrias 18. Aqui, o manuscrito demonstra um método para a detecção da novela mitocondrial piscina Ciclina E por co-imunocoloração fixo ovários de Drosophila para dCyclinE e um marcador mitocondrial (ATP-B).
Aplicações futuras ou chegar depois de dominar esta técnica
dada tchapéu Drosophila melanogaster é um poderoso sistema modelo genético, os métodos descritos são antecipados para contribuir significativamente para o entendimento da base genética da relação estrutura-função mitocondrial na saúde e na doença. Drosophila tem sido amplamente utilizada para trazer à tona as interações genéticas que levam a tumorigênese 19. A capacidade de geração de clones na camada de células epiteliais do folículo Drosophila permite o estudo da interacção de mitocôndrias e oncogenes ou supressores de tumor em clones individuais em tumorigénicas in vivo e ex vivo de configuração. Os métodos descritos podem ser usadas para estudar a regulação da relação estrutura-função mitocondrial em ovários isolados a partir de mutante de Drosophila apropriado. Os métodos descritos podem ainda ser estendido para estudar o impacto direto de vários fatores de nutrientes e crescimento sinalização sobre a estrutura e função mitocondrial através do exogAlém indí- dos nutrientes adequados e / ou factores de crescimento no meio de imagiologia ex vivo. Os métodos descritos podem ser adequadamente modificado e utilizado em outros tecidos de Drosophila isolados, como os discos imaginais das larvas, que têm sido amplamente utilizados para estudar vias de transdução de sinal em doenças como o cancro 20,21.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
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