Introduction
Onlar farklılaşmış hücrelerin enerji üretiminin ana koltuklar beri Mitokondri klasik, hücresel güç merkezi olarak tarif edilmektedir. Ayrıca, mitokondri metabolizma, ısı üretimi, lipit modifikasyonu, kalsiyum ve redoks homeostazı kritik bir rol, hücre sinyal süreçlerinin orkestrasyon, vb 1 oynarlar. Mitokondri aktif bir hücre ölümü 2 indüklenmesinde rolü hem de hücre döngüsünün düzenlenmesi 3 görüntülemektedir. Böyle çok işlevsellik şu temel soruları gündeme getiriyor: a) nasıl mitokondri aynı anda tüm bu işlevleri yerine ve farklı fonksiyonlar için özel olan belirli mitokondriyal havuzları veya alt bölgeler b) vardır mı? Bu bağlamda, çok fonksiyonlu mitokondri tek tek hücrelerin içindeki şekil, boyut ve yapıda dinamik olduğu ve mitokondri kararlı durum şekil hücre tipleri arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir. Çeşitli laboratuvardan yıllarca araştırmaOratories mitokondriyal şekil, boyut, yapı ve toplu olarak adlandırılan mitokondriyal dinamiklerin değiştirilmesi, çeşitli mitokondriyal fonksiyonları 4,5,6 muhafaza etmek için çok önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgular, mitokondrinin kendi yapısal dinamizm sayesinde onların çok işlevi yerine getirmek ihtimalini yükseltmek.
Kapsamlı çalışmalar mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak için çalışmalar devam etmektedir. mitokondriyal yapının hareketlilik esas olarak birbirleri ile füzyon füzyon olayları geçmesi kabiliyetleri ile muhafaza edilmektedir. Iki küçük mitokondri arasındaki füzyon daha büyük bir mitokondriyal eleman 7 içine birleştirir ise büyük mitokondri Bölünme, küçük mitokondriyal elemanları dönüştürür. Ayrıca, iki mitokondri geçici füzyon içerikleri karışmasını sağlamak için oluşabilir. İç ve dış mitokondriyal membran fizyon ve füzyon olayları dikkatle spec tarafından yönetilirIFIC proteinlerinin ayarlar. Çekirdek fisyon makine Drp1 türünü de kontrol edilebilir olsa da, belirli niyetli mitokondriyal protein (ör Fis1 ya Mff1) ile etkileşim yoluyla mitokondri sitoplazmada katılım olur Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) oluşmaktadır mitokondriyal yüzeyi 4 üzerine diğer proteinler bulunmaktadır. Drp1 dış membran üzerinde çalışmasına rağmen, onun fizyon yetenekleri yanı sıra iç zarı etkiler. dış ve iç mitokondriyal membran fisyon düzenleme tam olarak anlaşılamamıştır. Mitofusins dış zar 5 füzyon yöneten Diğer taraftan, iç membran füzyon, OPA1 faaliyetleri ile özünde yönetilir. mitokondri mücadele fizyon ve füzyon olayları dengesi bir hücrede kararlı durum mitokondriyal şeklini belirler. Örneğin, mitokondriyal fisyon bastırılması, tam ve rakipsiz füzyon neden olur mitokondri aşırı aktivitesi sırasındal fisyon mitokondri 3 parçalanmasına neden olur.
mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin incelenmesi öncelikle iki ücretsiz yaklaşımları içerir: a) mitokondriyal fisyon / füzyon proteinlerinin genetik manipülasyon sonra hücresel ve organizma fenotip analizi ve b) mitokondriyal yapı ve fonksiyonunun doğrudan değerlendirmeler. Fenotipleri ikincil etkileri nedeniyle ortaya çıkabilecek genetik analizler hep, (bu durumda, mitokondriyal fisyon / füzyon proteinleri olarak) eldeki molekülün doğrudan işlevselliğini ortaya olmayabilir dikkat çekicidir. Bu nedenle, geliştirmek ve doğrudan mitokondriyal yapı ve işlevlerini incelemek için araçları kullanmak için büyük önem taşımaktadır. mitokondriyal yapının herhangi bir değerlendirme çeşitli mikroskopi araçları içerir. mitokondriyal dinamizm hem nitel hem Quantität izlenebilir beri canlı hücre floresan mikroskobu kullanımı büyük ölçüde, mitokondriyal dinamikleri çalışmalar ilerlemiştirUygun floresan mikroskopi araçları ve teknikleri 8 kullanarak ively. Floresan mikroskopi tabanlı araç vivo 9 mitokondriyal dinamizm önemini açıklık, canlı ve sabit Drosophila melanogaster dokularında mitokondriyal yapısını ve işlevini incelemek için geliştirilmiştir. Bu ve ilgili yöntemler Drosophila yumurtalık mitokondriyal yapı ve fonksiyona okuyan amacı ile, burada açıklanmıştır.
Drosophila yumurtalık germarium 10,11 bulunan ilgili yetişkin kök hücrelerden ortaya çıkan tohum çizgisi ve somatik soy oluşur. Onaltı sinsityal germ hücreleri (KR) germarium (Şekil 1) ortaya çıktığını bireysel yumurta odaları oluşturmak için somatik folikül hücreleri (FC) tarafından kapsüle olsun. 16 GClerin biri bir oosit olmaya kararlıdır olsun ve kalan 15 GC'ler oosit odasının büyümesini destekleyen hemşire hücrelerine dönüşebilirBu serilir önce yumurtanın olgunlaşmasını kolaylaştırmak. onlar ölümcül ön folikül hücreleri (AFCS), arka folikül hücreleri (PFC) ve ana gövde hücrelerinden oluşan bir desenli epitel hücre katmanı içine ayırt etmek için mitotik hücre döngüsü çıkmadan önce FC'lerin çoğunluğu mitotik bölünmeleri 9 mermi tabi (MBCS) . birbirini takip eden yumurta odaları aynı zamanda erken gelişme FCS türetilen hücreler ayrılır sap hücreleri tarafından bağlanır. Mitokondriyal fisyon protein Drp1 tarafından düzenlenen mitokondriyal şekil aktif Drosophila over FC tabakasının 9,12 normal gelişimi sırasında farklılaşma sürecine dahil edilmektedir. Drosophila folikül hücre katmanı gelişiminde Drp1 katılımını tanımlamak için bu çalışmalarda kullanılan yöntemler burada açıklanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Drosophila 1. Hazırlama (Şekil 2A'da tasvir edilmiştir gerekli araçlar)
- Tarif edilen deneylerin herhangi biri için, Drosophila toplama eclosion 5 gün içinde (oda sıcaklığına ya da 25 ° C 'de muhafaza) ve 5 ile doldurulmuş bir şişeye koyun - en fazla 25 olan 7 mL Drosophila gıda (Malzeme Tablo) her flakon uçar; 2 erkek oranı: bir kadın korumak 1.
- Drosophila yumurta üretimini uyarmak için granül maya az miktarda serpin. 4 gün - 2 içinde deneysel manipülasyon gerçekleştirin.
Drosophila Yumurtalıkların 2. Diseksiyon (Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları)
- Sıcak böcek kesme ortamı oda sıcaklığına 25 ° C (Malzeme Tablo). Sekiz oyuklu cam kesme çanak üç kuyu doldurmak her ortamın 200 uL de.
- CO ile Drosophila uyutmak
- Diseksiyon mikroskop mercek aracılığıyla bakarken, forseps iki çift kullanarak karın göğüs kafesi sever. forseps kullanarak, dikkatli bir çanak ikinci kuyusuna karınlarını aktarın.
- forseps diğer çifti ile (diğer karın içeriği ile birlikte) yumurtalıkların dışarı itmek yavaşça arka sonunda karın tutmak için forseps bir çift kullanın ve. Bu girişim başarısız olursa, dikkatle yumurtalıkların serbest bırakmak için ön ucunu forseps takarak karın dış iskelet kaldırın.
- Forseps kullanarak, (yani, sarısı dolu, ileri evre yumurta) opak arka sonuna kadar tek bir yumurtalığı tutun ve çanak üçüncü kuyunun dikkatle taşımakCanlı mikroskobu (adım 3) için işlemek için alay veya immün (adım 7) gerçekleştirmek sabitlemek için.
- Dikkatle forseps bir çift ile arka sonuna tutarken her yumurtalık ön ucuna posteriorundan hafifçe alay iğne süpürülerek yumurtalıkların etrafında koruyucu kılıfı alay.
NOT: alay sırasında zararı en aza indirmek iğne ucu bükün ve mikroskop (Şekil 2A) büyütme artırarak her yumurtalık yakınlaştırmak için. Alay kılıf kırmak için yeterli etkili olmalıdır, ama aynı zamanda dikkatli ovaryolden bütünlüğünü korumak için gerçekleştirilmelidir.
Canlı doku Mikroskopi 3. Hazırlık
NOT: Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları.
- Drosophila diseksiyonu önce, poli-I-Lizin kaplı odaları hazırlamak. Bu amaçla, covergl ilgili poli-I-lisin (0.1 mg / mL), iki adet 20-uL damla yerleştirmekeşek damla birleştirme önlemek amacıyla birbirinden uygun bir uzaklıkta bulunan bir cam tabanlı bir petri (35 mm) (14 mm, No. 0). 37 ° C'de 1 saat boyunca levhalar hava kuru ve silinebilir marker ile plakanın alt beyaz poli-I-Lizin filmin kenarları işaretleyin.
Not: poli-I-lisin ile kaplanmış oda, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Daha önce kaplanmış odacığı kullanılarak durumunda, Drosophila diseksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığına kadar getir. - Örnek olarak aşağıda, diseksiyon ve montaj tamamlandıktan sonra hemen görüntülü olabilir emin olmak için konfokal mikroskop tarama parametrelerini ayarlayın.
- bir disseke ve yumurtalık alay (aşağıdaki adım 2 ve adım 5 Aşağıdaki gerekirse, lekeli) belirgin bir poli-I-Lizin kaplı bölgeye yerleştirin ve ovaryolden ayırmak için alay iğne ile yumurtalık yayıldı. t karşılamak için emin olun, yumurtalık üstünde böcek diseksiyon orta 10 ul damla yerleştirinO tüm alanı poli-I-Lizin kaplı. petri örtün.
- Hemen oda sıcaklığında monte numunenin konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
Not: Sadece bir Drosophila, parçalara işlenir ve her seferinde görüntülü olmalıdır. Ayrıca, mikroskopi Drosophila doku için bir ısı şoku ortamı taklit eden 37 ° C de yapılan bir işlem değildir.
Photobleaching (FLIP) Tahlili 4. Floresan Kaybı Mitokondriyal Matrix Süreklilik değerlendirin
NOT: kaynaşmış mitokondriyal yapıda Mitokondriyal matriks süreklilik ara adımlarda bir ilerleme aşağıdaki mitokondriyal iç ve dış membran tam füzyon sonra kurulmuştur. Mitokondri fisyon aynı adımları uygulayın ancak ters yönde (Şekil 3A) olabilir. FLIP mitokondriyal matris sürekliliği değerlendirmek için kullanılabilen bir zaman atlamalı mikroskopi-bazlı yarı-kantitatif bir yöntemdirCanlı Drosophila yumurtalıklarda 9 ex vivo mitokondri nihai sigortalı durumu (Şekil 3A 3. ve 4. adımları). FLIP deneyi düzenli aralıklarla (Şekil 3A FLIP ROI) de photobleached mitokondrial matriks bir floresan molekülü ifade mitokondri ilgi alanları (ROI) küçük bir bölge olarak yapılır. Bunun bir sonucu olarak, (Şekil 3A'da deney ROI) FLIP ROI ile süreklidir herhangi bir çevre mitokondriyal bölgesi nedeniyle, sürekli mitokondrial matris moleküllerin değişimi sinyali kaybeder. Burada gösterilen FLIP deneyleri, bir serbest difüze biçimde mitokondrial matris için hedef YFP ile etiketlenmiş, insan sitokrom oksidaz VIII alt biriminin mitokondriyal hedefleme sekansı ihtiva mitoYFP ifade eden Drosophila üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce rapor edildiği gibi benzer bir deney, Mito pUASP-mito-GFP transgen ile gerçekleştirilebilir <sup> 9. Benzer bir FLIP protokolü dış füzyonundan elde edilen süreklilik tespit edebilmek için mitokondriyal arası zar alanı hedefleyen bir prob ile kullanılabilir ancak değil, iç mitokondriyal membranlar (Şekil 3A'da aşama 2) hazırlandı.
- Konfokal mikroskop görüntü elde etme yazılımı açın ve "Toplama" sekmesinde (Tablo 1) uygun tarama parametrelerini ayarlamak. Bireysel sekmeleri açmak için "Zaman serisi", "Bleaching" ve "Bölgeler" kutuları işaretleyin. Her sekmede (Tablo 1) uygun satın alma parametre değerleri koyun.
NOT: Bu deney, tek tek hücrelerin bütün mitokondriyal halktan genel sinyali izlemek için tasarlanmıştır olarak iğne deliği, açık bırakılmalıdır. - Hızlı monte eden canlı dokuda ilgi alanını bulmak için mercek kullanın.
NOT: iyi cam bottome yayılır ovaryolden seçind çanak beri konfokal mikroskopi yüzen ovaryolden üzerinde gerçekleştirilemez. - "Canlı" seçeneğini tıklayın ilgi seçilen alanın canlı bir görüntü elde etmek için. Click canlı taramayı durdurmak için "stop".
- Gerekirse offset değerlerini ayarlayarak tarafından belirlenen, tanımlanan arka plan ile ( "menzil göstergesi" seçenek işaretlendiğinde kırmızı piksel yokluğu ile gösterilir) tespit floresan sinyal doyma seviyelerinin altında olacak şekilde toplama parametreleri, ayarlayın.
- canlı tarama ile elde edilen görüntü üzerinde photobleaching bölgesini ayırmak için "Bölgeler" sekmesinden Bezier çizim aracını kullanarak küçük bir ROI çizin.
NOT: ROI boyutu yaklaşık 20 olmalıdır - hücre içinde toplam floresan mitokondriyal sinyal% 50. - üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin "deney başlar."
- Malzemeler (bkz floresan özel veya açık kaynak yazılımı kullanarak ölçmekTablo). tekrarlayan ağartma hedeflenen ROI ortalama sinyalini (FLIP) kaydedin; ağartma aynı hücrede gerçekleştirilmemiş ROI (Deneysel); aynı görüş alanında başka ağartılmamış hücreden YG, deney süresi (Bleaching) sırasında genel beyazlatma değerlendirmek için; ve arka plan alanı (arka) üzerine YG. Diğer ROI ortalama sinyalinden elde edilen ortalama arka plan sinyalini çıkartın. İlgili hücre için ilk ön-ağartma sinyali ile flüoresan sinyal normalize.
- herhangi bir standart çizim yazılımı kullanarak normalleştirilmiş verileri çizilir.
Floresan Mitokondriyal Boyalar 5. Canlı Boyama
NOT: Kararlı durum mitokondriyal yapı ve potansiyel özellikle canlı hücrelerde ve dokularda mitokondri içine dahil boyalar kullanılarak değerlendirilebilir. Canlı Drosophila yumurtalıklar floresan mitokondriyal ile ex vivo olarak boyanabilirlekeleri (mito-ROS) üretimi mitokondriyal reaktif oksijen türlerini değerlendirmek için, mitokondri görselleştirmek için, ve birim kütle başına mitokondriyal potansiyelini değerlendirmek için. Bu mitokondriyal potansiyometrik boya tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve mitokondriyal kütle temsil uyumlu canlı mitokondriyal leke ile birlikte boyama ile gerçekleştirilebilir (spesifik boyalar için malzemeler Tablo).
- son çalışma konsantrasyonları orta diseksiyon sıcak böcek lekeleri stokunu: mitokondriyal leke, 250 nM; TMRE, 50 nM; ve mito-ROS leke, 5 mcM.
- diseksiyon ve Aşama 2'ye göre yumurtalık alay sonra, diseksiyon kabına herhangi bir özel boyama çözeltisi 200 uL olarak yumurtalıkların yerleştirin. ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarılmış uygun bir kutu ile kapalı bir çanak ile 10 dakika boyunca inkübe edin. containin 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatlice taşıyarak lekeli yumurtalık yıkayınleke olmadan gr orta.
- TMRE ve uyumlu genel mitokondriyal leke ile birlikte boyama için, (aralarında herhangi bir yıkama adımları olmadan) genel mitokondriyal leke hemen ilk TMRE ile ve daha sonra leke için yukarıdaki protokol izleyin.
- Aşağıdaki, bir poli-I-Lizin kaplı cam tabanlı çanak aşağıdaki adımı 3 yumurtalıkların monte edin ve uygun tarama parametreleri (Tablo 1) ile konfokal mikroskopi için hazırlık 4.2-4.4 adımları tekrarlayın.
NOT: montaj orta lekeli örnekleri monte çalışırken dahil boyalar sinyal sürmedi. - sekmesini açmak için Z-kesit kutuyu işaretleyin. canlı-taranırken numunenin altına doğru odak tekerleğini döndürün ve en alttaki Z-bölüm tanımlamak için "İlk seti" üzerine tıklayın. üstteki bölümü tanımlamak için diğer yönünde odak tekerleğini hareket ederken aynı işlemi uygulayın.
- üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin "deney başlar."
- (Adım 4.7 gibi) Arka plan sinyali ROI ve tek tek hücreler artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ölçme ve bir çizim yazılımı kullanılarak veri arsa.
Drp1 Boş Mozaik 6. Nesil
Not: Burada kullanılan klonal stratejisi Drp1 hiçbir mütasyon 9 genotipik heterozigotik olan bir GFP pozitif, fenotipik olarak yabanıl-tip arkaplan ve arka yeşil floresan protein (GFP) negatif Drp1 boş klonlar getirmektedir. Isı şoku kaynaklı flippase-flippase tanıma hedefi (FLP-FRT) aracılı site-spesifik mitotik rekombinasyon fonksiyonel boş drpKG03815 alleli homozigot klonlar oluşturur. Drp1 mutantını taşıyan Drosophila genotip drpKG03815 FRT40A / CYO olan ısı şoku kaynaklı FLP (hsFLP) ve UbiGFP klonal markör hsflp olan taşıyan genotip ise; ubikitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. se genotipYukarıdaki genotipleri arasında çapraz seçilir ve yavrular hsFLP / + ise; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.
- Taze gıda yeni şişeleri her 2 ila 3 gün taşıyarak bakire koleksiyonu için Drosophila eşitleyin. Gelişmekte olan bakire kadın toplamak için günlük pupariating şişeleri izleyin.
- akşam bir kez sabah ve bir kez, her gün Drp1 mutant genotip gelen kırmızı gözlü, kıvırcık kanat bakire kadın toplamak ve ayrı bir şişenin içine koyun. Buna paralel olarak, erkek Drosophila koyu kırmızı gözleri ve eclosion 5 gün içinde hsflp ve UbiGFP taşıyan düz kanatları ile toplamak.
- 2 erkek oranı: Bir kadın ile bakire kadın için erkek ekleyerek bir haç kurmak 1.
- yumurta üretimi uyarmak için granül maya az miktarda serpin.
NOT: Dikkatle döl miktarını artırmak için her 2 ila 3 gün medyanın taze flakon için Drosophila taşımak ve flakon kalabalık azaltmak için. - biresthetize, sıralama ve toplamak düz kanatlı, eclosion 5 gün içinde kırmızı gözlü kadın döl.
- Isı şoku için, (ısı şoku sırasında nemi emmek için) silin, yumuşak, granül maya az miktarda ve küçük boş şişelere toplandı Drosophila yerleştirin. Esas olarak folikül hücresi klonlarını elde etmek için, 1 saat boyunca 38 ° C'de bir su banyosunda Drosophila ile flakon yerleştirin ve iki kez 1 saat boyunca 37 ° C, günde 2 ardışık gün boyunca (2 ısı şoku arasında en az 5 saat sağlayan) , germline ve folikül hücre klonları hem üretmek için.
NOT: Flakon tamamen fiş seviyesine kadar su batık olduğundan emin olun. - Isı şoku Drosophila hareketsiz hale getirebilir. Yine mobil olduğunda ısı ile şoklanmış Drosophila oda sıcaklığında 1 saat süre ile geri izin verin.
- ortada aynı oranda kadın geri erkek ekleyin ve Mediu ile taze şişelere taşıyabilirsinizm granül maya küçük bir miktar ile serpilir. En az 5 gün süreyle Drosophila koruyun.
- Canlı veya sabit deney için gerekli yumurtalıklar teşrih.
Not: Ebeveyn Drosophila ifade UbiGFP izole Yumurtalık ısı şoku ile GFP-negatif klonlannın etkin indüksiyonunu teyit etmek için negatif kontroller olarak kullanılır.
7. Siklin E ve mitokondri için Co-immün
Not: Drosophila siklin E (dCyclinE) tespit etmek için, özel olarak dCyclinE 9 karşı ortaya çıkartılan bir ticari olarak elde antikor kullanmıştır (Malzeme Tablo). Mitokondriyal işaretleyici olarak, ATP-B'ye karşı bir antikor (mitokondrial ATP sintaz kompleksinin alt-birimi) 9 kullanılır.
- Sıcak% 4 paraformaldehid, oda sıcaklığına kadar (PFA), 25 ° C. Dikkat! Paraformaldehit toksiktir.
NOT: Açılıştan sonraampul, PFA, 4 ° C'de saklandı ve 7 gün içinde kullanılmalıdır. PFA depolama önemli ölçüde tespit sırasında mitokondrial membranlar değiştirecek metanol oksidasyonu izin verebilir, bu da, eser miktarlarda mevcuttur. - Hemen diseksiyonu sonrası, (alay olmadan) bir cam diseksiyon çanağı bir kuyunun taze PFA 200 uL onları yerleştirerek disseke yumurtalıklar düzeltin. 15 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde bir çanak tutun. 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatli bir şekilde hareket 1x fosfat tamponlu tuzlu su, her biri 200 uL (PBS) ile tespit yumurtalık yıkayın.
NOT: Deney burada durdurulabilir ve numuneler için 1 gün 4 ° C'de bırakılabilir. - dikkatle antikor ile antijen erişimini engelleyebilir koruyucu fibröz kılıfı çıkarmak için (benzer 2.6 adıma) PBS içinde daha iyice yumurtalıkların Tease.
- 0 yaptı taze 500 ul bir mikrofuge'de tüp yerleştirerek alay yumurtalıklar geçirgenliği.25 rpm'de sallanan ise% 5 PBS-Triton-X100 (PBS-TX) ve 30 dakika için inkübe edilir.
NOT: sallanan sırasında tüpler sallanan harekete paralel yerleştirin; böylece doku kaybı ile sonuçlanan, doku tüpler kapağı sopa izin verebilir dik yerleştirerek. - PBS-TX kaldırmak için, doku tüplerin dibinde yerleşmek için izin rafa mikrofuge'de tüpleri yerleştirin. Gerekirse dibine herhangi bir kayan dokuları getirmek, görsel olarak kontrol edin ve tüpler dokunun. tüplerin alt kısmında doku bozulmamış kalır emin, üstten dikkatlice çözüm aspire.
- % 0.5 PBS-TX içinde eritildi,% 2 sığır serum albümininin 200 uL (BSA) ilave edilerek yumurtalıklar bloke edildi ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında rocker üzerinde inkübe edin. adım 7.5 izleyerek engelleme ajanı çıkarın.
- Taze bloke edici madde, 200 uL primer antikor ekleyin: anti-tavşan dCyclinE antikoru (1: 100) ve anti-fare ATP-B antikoru(1: 100). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca rocker dokuları inkübe edin.
- Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın.
- Taze PBS TX uygun ikincil antikor 200 uL ekleyin: anti-fare-Cy3 (1: 1000) ve anti-tavşan-Cy5 (1: 500). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker üzerinde inkübe edin.
- Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın.
- Nihai PBS-TX yıkama: (1000 seyreltme 1) DNA leke, Hoechst ekleyin.
- Son olarak, 1 x 500 ul PBS doku bırakın.
- 1 ml mikropipet kullanılarak, 200 ul PBS içeren bir cam kesme çanak taze kuyuya mikrofüj tüpü immüno yumurtalıkların alınması.
- Bir cam slayt gliserol tabanlı montaj orta bir damla ekleme montaj ortamına tek immüno yumurtalıklar bir ekleyin.
NOT: yumurtalıklar gerçekten montaj ortamına aktarılır emin olun. s yapamadığımızo doku kaybına yol açacaktır. - Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, hafifçe forseps ile yumurtalık opak kısmını tutarken alay iğne kullanılarak opak olgun yumurta odalarından şeffaf ovaryolden (genç aşamaları) koparmak. montaj orta olgun yumurta odaları çıkarın.
- montaj orta üniform altında yayılır emin olmak için slayt ve hafifçe basın üzerinde coverglass (22 mm, No. 1) yerleştirin.
NOT: coverglass basılması da coverglass boyunca doku düzgün hizalama sağlar. bu yüzden en iyi şekilde yapmak, başarısız olan dokuların optimal mikroskopi önlenmesi, küçük aşamaları montaj orta float izin verebilir. - 15 dakika boyunca örnekleri Hava kurutun ve dikkatle oje ile coverglass kenarları mühür.
- Deneysel ihtiyacı (Tablo 1) göre konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tarif edilen yöntemler, canlı ve sabit Drosophila yumurtalık (Şekil 2B) mitokondriyal yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. tarif edilen yöntemlerle elde edilen beklenen sonuçları bazı örnekler sunulmuştur.
Drosophila over diseksiyonu: Daha fazla disseke zaman bütün Drosophila (Şekil 3A) kopmuş karnı (Şekil 3B) her Drosophila 2 yumurtalıklar dahil olmak üzere, karın içeriğini serbest olmalıdır. Sağlam yumurtalıklar ideal oviductal sap üzerinden birbirine bağlı kalmalıdır oval şekilli, beyaz bir yapı (Şekil 3C ve D oklar) olarak gösterilir. Her bir yumurtalık ovaryolden B çıkarılır (Şekil 3C büyütülmüş kısmının içerisinde) fibröz bir kılıf ile bir arada tutulabilir olmalıdıry dikkatli alay (Şekil 3D kalın ok; müstakil ovaryolden ile kötü alay yumurtalığın gösteren *) boyama ve mikroskopi için ovaryolden ortaya çıkarmak. Karın içeriğinin serbest bırakılması sırasında yırtılmış oviductal sapları ile yayımlanan yumurtalıklar da, kullanılan aksi takdirde zarar görmezler sağlanabilir. Hasarlı yumurtalık (* Şekil 3C olarak) ve diğer abdominal içeriğin (Şekil 3C ok ucu) atılmalıdır.
Drosophila yumurtalık Canlı mikroskopisi: Burada, FLIP tekniği ve Drosophila yumurtalıklarda mitokondriyal yapısal ve işlevsel boyaların yükleme göstermektedir.
FLIP tekniği, daha önce Drosophila folikül hücreleri 9 mitokondriyal sürekliliği değerlendirmek için uygulanan, transgenik Drosophila yumurtalık hemşire hücrelerinde burada ortaya konmuştur (Şekil 4A) ile süreklilik ise FLIP ROI iteratif photobleaching ve aralıklı toparlanma süreleri kapsayan FLIP protokol çevreleyen bölgelerde yanı sıra, FLIP ROI sinyal kaybı sağlar. FLIP hemşire hücrelerle ilişkili mitokondriyal bulutları bir 200 s (Şekil 4B ve C) olan kırmızı FLIP ROI çevreleyen, mavi ve beyaz ROI'ler floresan sinyalin% 50'den daha fazla kayba neden hedeflenmiş; Yeşil ROI sinyal arka plan düzeltilmesi için kullanılır. Diğer hedefsiz hemşire hücrelerinde sarı ROI floresan sinyal deney (Şekil 4B ve C) zamanı sırasında en az genel ağartma simgeleyen, bu süre boyunca sabit kalır. Ayrıca, Bu sonuç mitokondri belirten Videoyu 1. bkzAdım 1 ve 2'de, mitokondrilerin bu süre içinde floresan kaybı gösteren beklenmemektedir ise hemşire hücreler, adımlar 3 ve 4 (Şekil 4A) gösterilen, dış ve iç membranlar, kaynaşmış.
Birim başına mitokondriyal potansiyel mitokondriyal kitle bir yarı-nicel ölçü potansiyometrik boya TMRE ve mitokondriyal kitle 13 yansıtan genel mitokondriyal leke ile birlikte boyama ile tespit edilebilir olduğunu daha önce ortaya konmuştur. Burada, aynı teknik canlı Drosophila yumurtalık dokusunda birim kütlesi başına mitokondriyal potansiyelinin değerlendirilmesi göstermek için kullanılmıştır. TMRE ile boyanmış canlı Drosophila yumurtalıkların Konfokal mikroskopi doku (Şekil 5A) derinliği ile sinyal bir azalma göstermektedir. nedeniyle yüksek doku derinliği içinde dağılmanın arttırılması için flüoresan sinyal kaybı, fluorop herhangi bir türde ortaya çıkması beklenmektedirKullanılan amacın belirli bir çalışma mesafesi ile hore. Nedenle, florofor canlı doku görüntüleme sırasında tespit edilebilir dokuda maksimum derinliği ayırt edilmesi önemlidir. Maksimum görüntülenebilir derinlik (yumurta odası boyutunu artırarak ile Şekil azalırken Örneğin, lamel 20 um aralığında açıklanan mikroskop kurulumu (Tablo 1) kullanarak görüntülü olabilir genel mitokondriyal leke (Mito) ile boyandı Drosophila yumurtalıklar canlı 5B). Ayarlar herhangi bir yersiz bir sinyal çapraz konuşma ya da fluorofor çapraz uyarım expectedly az tespit veya hiç sinyal (Şekil 6A) incelemek için ise mitokondriyal lekeler için optimize edilmiş mikroskop ayarları, uygun algılama kanallarında olumlu sinyaller algılar. Genel olarak mitokondriyal leke ile TMRE Eş boyama niteliksel (Şekil 6B) ve kantitatif (Şekil 6C ve D <her ikisi için de kullanılabilir/ Canlı Drosophila yumurtalıklarda birim kütle başına mitokondriyal potansiyel strong>) değerlendirmeler. Örneğin, a) nitel analiz Drosophila germarium somatik folikül hücreleri Şekil 6B germ hücreleri (ok başları saklanması için ortaya çıkan evre 2b birim kütle başına yüksek mitokondriyal potansiyeli sergileyen) ve b) yarı-kantitatif analizler göstermektedir ki gösteriyor bir sahne 9 yumurta odasının (Şekil 6C) analiz olarak (streç) AFCS ve MBCS arasındaki birim kütle başına mitokondriyal potansiyel farkı. miktar odak kendi düzlemi bağlı AFCS ve MBCS 2 farklı optik kesitlerden gerçekleştirildiğini not edin. Başarılı bir şekilde Drosophila 14 kullanılmıştır mito-ROS prob kullanımı mitokondriyal füzyon proteinin fonksiyonel boş klonlar Drp1were kişiye canlı Drosophila over epitelyal folikül hücresi tabakaları gösterilmiştir. Çoğu but tüm canlı GFP-negatif Drp1 boş folikül hücresi klonlarının mito-Ros (Şekil 7A ve B) için, yüksek lekelenme gösterdi. * (Ayrı bir mitokondriyal sinyal bu dokuda tespit edilememiştir rağmen, mito-ROS leke konsantrasyonu mitotik folikül hücreleri önemli ölçüde daha büyük olan gelişmiş post-mitotik folikül hücreleri, nükleer bölgede tespit edilebileceğini unutmayın Şekil 7C'de). Bu, nükleer DNA ve etidyum 15 bir türevidir mito-ROS boya, floresan oksidasyon ürünü etkileşimi oluşabilir.
Sabit Drosophila yumurtalık folikül hücrelerin mitokondrial Siklin E tespiti: en son mitokondri, memeli hücrelerde mitokondrial yüzey ve Drosophila folikül hücresi katmana alımı ile hücre döngüsü molekülü Siklin E düzenler ortaya konmuştur
Drosophila Yumurta Chambers Şekil 1. geliştirilmesi. Karikatür gelişmekte olan yumurta odaları zinciri, bir oosit ve folikül hücre tabakası (somatik) tarafından kapsüllü hemşire hücreleri (germ) oluşan her oluşan bir Drosophila ovaryol tasvir. Yumurta odaları germarium gelişir ve mitotik folikül hücreleri post-mitotik haline aşamalardan gelişir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2. Deneysel Planı ve hazırlanması. Yöntemlerde kullanılan (A) Araçlar tarif: A. Fly şişeyi; B. Böcek orta diseksiyon; C. Paraformaldehit; D. Fly fırça; E. çanak Diseksiyon; F. Kapak cam; G. Microfuge tüp. H. çanak Cam tabanlı; I. Cam slayt; J. 1000-ul mikropipet; K. 200 uL mikropipet; L. 2.5-ul mikropipet; (M. ucu büyütülür) bükülmüş ucu ile iğne alay; N. Kalın forseps; O. İnce forseps. (B) bir akış şeması şematik açıklanan yöntemleri temsil etmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Drosophila Yumurtalıkların Şekil 3. diseksiyonu. (A) Anestezi Bütün Drosophila. (B) Severed Drosophila veya karın içindekiler (*) olmadan karınlarının. (C) yumurtalıklar (oklar ve *) ve diğer içerikleri de dahil olmak üzere, Drosophila karın içeriğini Çıkış(Ok başları); anterior (Ant) ve posterior (Post) vurgulayarak sağda kutulu bölgenin büyütme ovaryolden fibröz kılıf (#) tarafından düzenlenen oviductal sap tarafından düzenlenen yumurtalıkların çiftinin sona erer. (D) unteased yumurtalık (ince ok) ile karşılaştırıldığında alay Drosophila yumurtalık (kalın ok uygun işaretleme alay ve * kötü alay işaretleme). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4. Canlı doku FLIP Deneyi. (A) FLIP yöntemi kullanılarak uygun bir mitokondriyal süreklilik testi ile analiz edilebilir mitokondriyal fisyon / füzyon, aşağıdaki aşamaları temsil şematik; Bu durumda, mitokondrial matris bir mito YFP prob assessm sağlarmitokondrial matriks süreklilik ent. (B) fabrika mito-YFP ifade canlı transgenik Drosophila yumurta odasının vivo mikroskopi Time-lapse; yalnızca seçkin zaman noktalarında (t) gösterilmektedir. tüm zaman noktalarında için video 1'e bakınız. (B) 'de ilgili renkli ROI'ler floresan sinyalinin (C) kantitasyonu arka düzeltme ve normale döndükten sonra ifade edilmiştir. iki ardışık ağartma olaylar arasındaki zaman aralığı iyileşme süresi ise ok ucu, tekrarlayan photobleaching zaman noktalarını belirtir. Ölçek çubuğu: 10 mikron. Görüntüler Tablo 1'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. Canlı Mitokondril Boyama ve Drosophila ovaryol Mikroskopi. (A) TMRE ile boyanmış canlı Drosophila ovaryol Bireysel optik dilim; Resim Tablo 1 'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Z mikron lamel mesafeyi ifade eder. (B) canlı Drosophila ovaryol genel mitokondriyal leke (Mito) ile yüklendi. XY resimdeki kırmızı çizgi XZ görüntü B alt ve T edinilen görüntünün üst olduğu gösterilir. mavi çizgi alttan mesafe 20 mm. Ölçek çubuğu: 20 mikron. Konfokal görüntüleri Tablo 1'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
FCanlı TMRE ile Drosophila ovaryolden ve Genel Mitokondriyal Leke ŞEKIL 6. Eş-boyama. (A), canlı bir Drosophila ovaryol TMRE ve genel olarak mitokondriyal leke (Mito) ile birlikte lekeli bir tekli optik kesit; * Tartışma bölümünde açıklanan deney obje gösterir. (B) (A) 'daki germarium 3 ardışık optik dilim maksimum yoğunluk projeksiyon; ok uçları TMRE floresan artar bölgeyi gösterir. (C) post-mitotik yumurta odası Tek optik dilim TMRE ve genel mitokondriyal boyası ile işbirliği boyandı. Üst ve alt paneller sırasıyla AFCS ve MBCS için odak düzlemi gösterir. TMRE ortalama floresan yoğunluğu ve (C) kutulu bölgelerde bireysel AFCS ve MBCS gelen miktarı genel mitokondriyal leke gösteren (D) Kutu arsa. kutu arsa bıyık aykırı değerler hariç, her bir grup için maksimum ve minimum değerler göstermektedir.
Mito-ROS boya ile canlı Drp1 Boş Mozaik Drosophila ovaryolden Şekil 7. boyanması. (A) mito-ROS boya ile boyanmış ovaryolden Tek optik dilim. (B) mito follikül hücreleri ile bireysel yumurta odasının 2 ardışık optik dilim maksimum yoğunluk projeksiyonutic sahne mito-ROS boya ile boyandı. (C) mito-ROS boyası ile boyanmış post-mitotik aşamada folikül hücreleri ile bireysel yumurta odasının Tek optik dilim; * Nükleer sinyal. UbiGFP olmaması Drp1 boş klonlar işaretler. Ölçek çubuğu: 20 mikron. Konfokal görüntüleri Tablo 1'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
DCyclinE ve ATP-B antikorları ile Sabit Drp1 Boş Mozaik Drosophila ovaryolden Şekil 8. Eş-immün. (A) eş-immunohistokimyasal germarium 3 ardışık optik dilim maksimum yoğunluk projeksiyonu. (B) eş-Bağışıklık lekelenmesi 3 ardışık optik dilim maksimum yoğunluk projeksiyonupost-mitotik MBCS tained. ana hatlarıyla UbiGFP-negatif Drp1 boş klonlar ayırmak. Ölçek çubuğu: 10 mikron. Konfokal görüntüleri Tablo 1'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Hasar Tehlikesi ve Eserleri 9. örnekleri Şekil. (A) Germarium ovaryol sabit ve gereksiz boşluklar (*) gösterilen DNA boyası ile boyandı Hoechst UbiGFP eksprese eden. Ovaryol sabit ve çentik / gözyaşı (*) gösteren DNA boyası Hoechst ile boyandı UbiGFP ifade eden (B) Yumurta odası. (C) deforme olmuş odasını (*) gösteren mito-ROS boyası ile boyandı UbiGFP-negatif Drp1 boş klonları ile ovaryol Canlı ve hasarlı yumurta odası, kısmi izin germline (**) boyanması; # Aynı ovaryol bir hasar görmemiş yumurta odasının bir olasılıkla gerçek leke gösterir. (D) ovaryol germline yoğun artefakt boyama ile genel hasarlı bölmesini gösteren boya mito-ROS ile boyandı Canlı. * Hasar kaynaklı bu şekilde suni GFP-negatif klonlarına son artışı verecek, UbiGFP sinyal kaybı ile ovaryolden düzleştirilmiş gösterir. Ölçek çubuğu: 20 mikron. Konfokal görüntüleri Tablo 1'de tarif edilen parametrelerle elde edildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Video 1 Canlı doku FLIP Deneyi. Işıkla ağartma bazlı FLIP tahlilinde tam zaman süreci, Şekil 5'te tarif edilen..com / files / ftp_upload / 54989 / Video1.avi "target =" _ blank "> Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (indirmek için sağ tıklatın.)
Tablo 1: Sunan Temsilcisi Görüntüler Edinme Konfokal Mikroskop Ayarları. Tablo 1. görmek için buraya tıklayınız (indirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Photobleaching: floresan numunelerin aşırı photobleaching önlenmesi verimli konfokal mikroskopi gerçekleştirmek için kesinlikle gereklidir. Bu nedenle, mercek aracılığıyla numune bulmak için ya da canlı tarama modu ile görüntü elde etme parametrelerini ayarlamak için kullanılan zaman photobleaching en aza indirmek için minimize edilmelidir.
Doku hasarı: mitokondri hücresel sağlık sensörleri olarak kabul edilir olduğundan, açıklanan yöntemler kullanılarak elde edilen veriler fizyolojik ilgili ve Drosophila yumurtalıkların usul diseksiyon nedeniyle aşırı zarar yansıtmamaktadır sağlamak için son derece önemlidir. diseksiyon mümkün olduğunca çabuk gerçekleştirilen, aynı zamanda doku hasarı en aza indirmek için aşırı tedbir ile yapılmalıdır. 5 Drosophila yumurtalıkların diseksiyon ve alay için ortalama süre elimizde (7 dk 5'tirs). Çaba analizler dışında tutulacaktır hasarlı doku gösteren yumurta odaları tanımlamak için alınmalıdır. Diseksiyon bağlı doku hasarı, aşırı boşluklar içerebilir (* Şekil 9A'da, sinyal eksikliği ile tanımlanan), çentik / yırtıklar (* Şekil 9B'de, sinyal eksikliği ile tanımlanan), yumurta odaları ya da deformasyona (* Şekil 9C'de). Ancak, deneysel manipülasyon kaynaklanan herhangi bir anlamlı odası deformasyon dikkatle değerlendirilmelidir. Resim lamel ovaryolden düzleşmesi anlatılan protokolde, canlı doku üzerine kullanılır, ancak alay ya da (Şekil 9D'de *) monte ederken, dokuya tatbik aşırı basınç ile de oluşabilir. açıklanan protokol alay sonra meydana gelen, hemen diseksiyonu sonrası dokuların sabitlenmesini içerdiğinden ovaryolden düzleşme, sabit numuneler ile gözlenmemiştir. aforementione herhangi bir imza olmadan herhangi izole yumurta haznesid hasarı normal kabul edilebilir. Potansiyel diseksiyon kaynaklanan mekanik hasarlara da yanlış GFP-negatif klonları 16, sonuçta GFP kaybına yol açabilir ve ayrıca geliştirilmiş boya dahil ortaya çıkmasına neden olabilir. Yumurta odası içinde bulunan tohum çizgisi hücreleri canlı mitokondriyal boyalar (Şekiller 6 ve 7), Drosophila tohum çizgisi hücrelerinin gelişmiş mitokondriyal boyama hasarlı / boyama doku geçirgenliğindeki bir artış kaynaklanabilir normal geçirmeyen olduğu göz önüne alınırsa, Bu tür bir artefakt (Şekil 9C'de ** Şekil 9D bütün ovaryol) mito-ROS boya ile oluşur, hem de diğer canlı mitokondriyal lekeleri gibi (gösterilmemiştir). Şekil 9D (*) 'de UbiGFP kaybı da yumurta odaları yassılaşmasını neden olduğu hasardan neden olabilir. Hasarlı ovaryol diğer yumurta odaları otantik kalır ve Şekil 9C ücretsiz (# Dışlayıcı rağmen
Zaman hassasiyeti: Canlı ex vivo mikroskopi durumunda, veri doku montaj 15 dakika içinde alınmalıdır; aksi halde, deneysel sonuçlar nedeniyle doku takip eden ölüm fizyolojisi değişimlerden etkilenebilir. Bazı durumlarda, lazer gücü ve diğer tarama parametrelerine bağlı olarak, montaj orta 10 uL, 15 dakika daha çabuk buharlaşabilir. ko-immün tarafından mitokondrial Siklin E havuz tespiti nedeniyle mitochond geçici doğası diseksiyon zaman (muhtemelen en aza indirilmesi gerekmektedirAktif mitokondriyal solunum 12 tarafından yapılmaktadır riyali Siklin E havuz). Kayda değer bir mitokondriyal Siklin E havuzu da 30 dakika daha az Permeabilization süreleri ile gözlenmedi.
FLIP zaman süresince inceleme altında herhangi bir yumurta odasının hareketi artefakt analizler yol açabilir ve dolayısıyla dışlanması gerekir: FLIP. yabancı boya birleştirilmesi mitokondriyal sürekliliğini değiştirebilir ve böylece artefakt sonuçlara yol açabilir çünkü herhangi bir canlı mitokondriyal boyalar veya TMRE kullanımı bir FLIP deneyde tavsiye edilmez.
Drosophila geçiş stratejisi: nedeniyle heterozigot erkek ebeveynlerde Drp1 baskı tanımlanamayan bir etkisi muhtemelen çok yavrular, verim vermez (Drp1 mutant alel taşıyan erkekler kullanılır) burada açıklanan birine çapraz karşılıklı.
Klonal verilerin yorumlanması: Kontrol yumurtalıklarda tespit edilen GF-negatif klonlarmuhtemelen diseksiyon 16 sırasında hasar nedeniyle GFP kaybı nedeniyle oluşan suni yanlış negatif klonları, işaret eder UbiGFP ifade ebeveyn Drosophila izole. Bununla birlikte, haç ısı şok döl GFP-negatif klonların sayısı kontrollerde görülen herhangi bir yanlış-negatif klonları anlamlı olarak daha yüksek olmalıdır. Açıklanan mitotik rekombinasyon bazlı bir strateji ile Drosophila folikül hücre tabakasında oluşturulan klon (hücre klonları kök) mitotik folikülü kök hücrelerden köken ya da yapabilirsiniz mitotik olmayan kök folikül hücreleri (geçici klonları) dan. Geçici klonları ile yumurta odaları zaten atılmıştır zaman kök hücre klonları için, deneysel analizler, sadece 10 gün ısı şokundan sonra yapılmalıdır. Geçici klonlar yönelik olarak, germarium herhangi folikül hücresi klonunun olmayan ovaryolden folikül hücresi klonları ile, ısı şokundan sonra 6 gün içinde yapılmalıdır.
Değişiklikler ve Sorun Giderme
açıklanan yöntemi kullanarak birim kütle başına mitokondriyal potansiyelini değerlendirirken, bir mikroskop optik ya da mitokondriyal boya kombinasyonları ortaya çıkan potansiyel eserler farkında olmak zorundadır. Genel olarak mitokondriyal leke bir zayıflatılmış sinyali ve nispeten yüksek bir TMRE sinyali (Şekil 5A, *) gösteren bir bölgesi nedeniyle 8 veya bağlı kırmızı farklı optik özelliklere boyalar arasındaki flüoresan rezonans enerji transferi (FRET) ortaya çıkabilecek (TMRE) edinim kurulumunda sabit bir iğne deliği boyutu göz önüne alındığında ve yeşil (genel mitokondriyal boya) floresan ışıkları. Optik artifakı önlemek için 3 ardışık optik dilim - kantitatif analizleri 2 projeksiyonlar yapılabilir ise FRET ilgili eser, eğer mümkünse, boya konsantrasyonları azaltarak önlenebilir. Ayrıca, bir flüoresan sinyal karışma ve çapraz uyarım tespit edilirsekanalları, lazer ve dedektör ayarları da optimum kanallarda floresan sinyal azaltması beklenen bu kanallar, sinyal aza indirmek için yeniden ayarlanmalıdır.
Lazer kaynaklı tekrarlayan photobleaching hasarlı mitokondriyal parçalanma neden olur ve böylece başarılı bir FLIP önlenmesi, mitokondriyal süreksizlik neden olabilir. FLIP protokol yürütülmesi sırasında mitokondri şüphelenilen parçalanma azaltılmış iğne deliği ile yüksek çözünürlüklü görüntüleri elde (ve dedektör kazanç artırıcı) tarafından tespit edilebilir. mitokondri parçalanması görünür FLIP protokolü yürütülmesi sırasında tespit edilirse, ağartıcı lazerin güç azaltılması ve / veya üst üste ağartıcılar arasındaki aralık arttırılmalıdır. Genel olarak ağartıcı FLIP deneyi (Şekil 3B ve C sarı ROI gelen sinyal) zaman süreci sırasında, tarama lazer seviyesine yeniden ayarlanmalıdırBu minimal veya hiç genel photobleaching sağlar.
bağlı GFP hasar kaynaklı kaybına yol açacak dışlayıcı önlemek için, GFP pozitif klon tarif edilen ısı-şok protokol izlenerek MARCM stratejisi kullanılarak bileşiğe dahil edilebilir. Burada, uygun Drosophila çapraz için kullanılacak bakire kadın drpKG03815 FRT40A / CYO X erkek GAL80 FRT 40A / CYO ise; küvet-Gal4, UAS-CD8GFP / tm6 9. (Aşama 6'da tarif edilen gibi), düz kanat soyu ısı şoku kullanarak, klon üretimi için kullanılır.
Tekniğin Sınırlamalar
Canlı Drosophila yumurta odaları yüzeyinde bulunan folikül hücreleri mitokondriyal boyama boyaları dahil ederken A), yumurta odasının içine germ hücreleri bunu başarısız; daha küçük olan aşamaların tohum çizgisi (Şekil 5 ve 6) zayıf leke. B) Canlı ex vivo olarak tissue mikroskopi seferinde bağımsız Drosophila, bir izole edilmiş yumurtalık boyama tamamlanmasından 15 dakika içinde uygulanmalıdır. Deney grubu işlenmiş ve aynı gün görüntülü olmalıdır beri toplam süre çeşitli deney gruplarında canlı ex vivo doku mikroskopisi istatistiksel olarak anlamlı veri elde etmek için alınan makul artık sabit dokulardan elde edilenlere nazaran olduğunu. C) Biz mito-ROS leke nedeniyle tüm Drp1 gelen sinyal tespiti yokluğunu açıklayabilir ROS geçici doğası bu 17,15 algılar analit, büyük olasılıkla, ex vivo Drosophila dokuda çok kararlı olmadığını kaydetti boş klonlar. Ancak, Drp1 boş hücrelerde mito-ROS boyama değişkenlik herhangi bir biyolojik alaka / klonlar göz ardı edilemez ve daha fazla araştırılması gerekmektedir. mito-ROS leke pozitif sinyal sadece gelişmiş süperoksit değil, aynı zamanda geliştirilmiş mitokondriyal veya cellul yansıtmıyor olabilir unutmayınar oksidatif ortam 15. Bu mitokondriyal leke ve GFP floresan spektrumu ayırt edilemez çünkü D) genel mitokondriyal leke GFP-negatif veya GFP-pozitif klonal deneyler için kullanılamaz. E) mitokondriyal yapıların çözünürlüğü kapsayan bir açık iğne deliğine ile görüntü elde etme gerektirecek mitokondriyal matris devamlılığı tahlil için tasarlanmış FLIP deneyi.
Mevcut / Alternatif Yöntemler Göre Tekniği Önemi
mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini incelenmesi mitokondriyal işlevsellik düzenleyici mekanizmaların tam bir anlayış için çok önemlidir. Mitokondriyal kusurlar anlamlı diyabet, kanser, Parkinson hastalığı dahil olmak üzere, çeşitli hastalıklara katkıda için mitokondriyal çalışma yönteminin detaylı bir anlayış facilitati umudumitokondri yönettiği tedavi stratejilerinin geliştirilmesi ng. Canlı hücre mikroskopi mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Bununla birlikte, bu çalışmaların çoğu izole edilmiş hücrelere sınırlı olmuştur. Mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu çalışma bir ex vivo kurulum 9 Drosophila doku yaşamak için uzatıldı. Bu ve benzeri çalışmalar açıklanan protokol fizyolojik bağlamda mitokondri bir anlayış sağlayan, ex vivo canlı Drosophila yumurtalıklarda, mitokondriyal yapı ve fonksiyonunun bir anlayış yol açacaktır. Belirli bir hücre içinde metabolik ve mitokondri enerji özelliklerinin ayarı hücrelerin fizyolojik bağlamında beslenme mevcudiyeti ve uygun sinyal sistemine bağlıdır, çünkü bu ex vivo yaklaşımı in vitro çalışmalar göre önemli avantajlara sahiptir.
mi Genetik manipülasyonmitokondriyal fisyon protein Drp1 bastırmak tarafından tochondrial yapı hücre döngüsü modülatör Siklin E deregulates ve Drosophila over folikül hücre tabakasının 9,12 gelişimini etkiler. Burada, protokol mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini incelemek için Drosophila yumurtalıklarda Drp1 işlevsel boş klonları tanıtmak için nasıl bir açıklamasını içerir. Memeli hücrelerde mitokondriyal Siklin E'nin bir roman havuzu, hem de Drosophila folikül hücresi tabakası 12, başarılı bir olasılıkla mitokondri 18 tarafından rapor Siklin E düzenleme altında yatan olan tespit edilmiştir. Burada, Eser dCyclinE ve mitokondriyal işaretleyici (ATP-B) ko-immün sabit Drosophila yumurtalıklar tarafından yeni bir mitokondriyal Siklin E havuz tespit edilmesi için bir yöntemi gösterir.
Bu Tekniği Mastering sonra gelecek Uygulamalar veya Tarifi
Verilen tşapka Drosophila melanogaster güçlü bir genetik model sistem, bizim açıklanan yöntemler, sağlık ve hastalık mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin genetik temelini anlayabilmek için önemli ölçüde katkı beklenmektedir. Drosophila yaygın Tümörgenez 19 yol açan genetik etkileşimleri didiklemek için kullanılır olmuştur. Drosophila epitel folikül hücre tabakası klonlann yaratma kabiliyeti, in vivo ve ex vivo ayarında bir bireysel tümörijenik klonlarında mitokondri ve onkogenler veya tümör bastırıcı arasındaki etkileşim sağlar. Açıklanan yöntemler, uygun mutant Drosophila izole yumurtalıklar üzerinde mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin düzenlenmesi incelemek için kullanılabilir. tarif edilen metotlar ayrıca exog ile mitokondriyal yapısı ve fonksiyonu ile ilgili sinyal çeşitli besleyici, büyüme faktörü doğrudan etkisi incelemek için uzatılabilirex vivo ortamda uygun besinleri ve / veya büyüme faktörlerinin enous ek. Tarif edilen yöntemler uygun bir şekilde modifiye edilmiş ve yaygın olarak kanser 20,21 gibi hastalıklarda sinyal transdüksiyon yollar çalışma için kullanılmıştır larva hayali diskler gibi diğer izole Drosophila dokularda kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A.
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C.
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S.
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
