Introduction
Longitudinal undersøgelse af hjertet i små dyr bidrager til at forstå en række humane relaterede hjerte-kar-sygdomme, såsom gen relateret medfødt hjertefejl 1,2. I de seneste årtier, forskellige dyremodeller, såsom mus 3,4, Xenopus 5,6, zebrafisk 7,8, aviær 9, og Drosophila 10-16, er blevet anvendt til at udføre det menneskelige hjerte-udvikling forskning. Musemodellen er blevet bredt anvendt til at undersøge normale og unormale hjerte- udvikling og hjertefejl fænotyper på grund af sine ligheder med det menneskelige hjerte 3,4. Xenopus embryo er især nyttig ved undersøgelse af hjertet udvikling på grund af sin nemme håndtering og delvis gennemsigtighed 5,6. Gennemsigtigheden af embryo og tidlig larve af zebrafisk model giver mulighed for nem optisk observation af hjerte-udvikling 7,8. Den aviær model er en fælles genstand for udviklingsmæssige hjerte undersøgelser because hjertet er nemt tilgængelige efter fjernelse af æggeskaller og den morfologiske lighed aviær hjerter til mennesker 9. Drosophila model har nogle unikke funktioner, som gør den ideel til udførelse langsgående studier af hjertet. Først, hjertet tube Drosophila er ~ 200 um under den dorsale overflade, som tilvejebringer bekvemmelighed for optisk adgang og observation af hjertet. Derudover er mange molekylære mekanismer og genetiske pathways konserveret mellem Drosophila og hvirveldyr. De orthologer på over 75% af de menneskelige sygdomsgener blev fundet i Drosophila, som har gjort det meget udbredt i transgene undersøgelser 11,13. Desuden har en kort livscyklus og lave vedligeholdelsesomkostninger, og har været almindeligt anvendt som en model model for udviklingsbiologi forskning 14-16.
Tidligere rapporter beskrev protokoller til overvågning Drosophila hjertefunktion som hanArtbeat. Imidlertid blev dissektion procedurer påkrævet 17,18. Optisk afbildning tilvejebringer en effektiv måde at visualisere kardial udvikling hos dyr på grund af sin ikke-invasiv art. Forskellige optiske billeddiagnostiske metoder er blevet anvendt ved udførelse af dyr cardiac undersøgelse, såsom to-foton mikroskopi 19, konfokal mikroskopi 20,21, lys ark mikroskopi 22, og optisk kohærens tomografi (OCT) 16,23-26. Forholdsvis, OCT kan levere store billedbehandling dybde i små dyr hjerter uden at bruge kontrastmidler, og samtidig holde en høj opløsning og et ultrahøjt billeddannelseshastighed, som er vigtige for billeddannelse levende dyr. Derudover har de lave omkostninger ved at udvikle et OLT-system populariseret denne teknik til optisk billeddannelse af prøver. Oktober er med succes blevet anvendt til forløbsundersøgelse af Drosophila. Brug af OLT hjerte- morfologisk og funktionel billeddannelse er blevet udført for at undersøge hjertet strukturer, den funcnelle roller gener og mekanismerne for kardiovaskulære defekter i mutant modeller i hjerte-udvikling. For eksempel blev aldersafhængig hjertefunktion tilbagegang bekræftet med nedreguleret angiotensin-konverterende enzym-relateret (ACER) gen i Drosophila med 27 oktober. Fænotypebestemmelse af gen-relateret kardiomyopati blev påvist i Drosophila hjælp oktober 28-33. Forskning ved hjælp oktober afslørede også den funktionelle rolle af den menneskelige SOX5 gen i hjertet af Drosophila 34. Sammenlignet med OLT OCM bruger et objektiv med en højere numerisk apertur at give bedre tværgående opløsning. I fortiden, har hjertet dysfunktion forårsaget af silencing en ortholog human circadian gen dCry / dClock undersøgt under anvendelse af et brugerdefineret OCM-system 15,16, samt virkningen af højt fedtindhold-kost på kardiomyopati i Drosophila at forstå fedme induceret human hjertesygdomme. 15
Her, the forsøgsprotokol er sammenfattet til langsgående undersøgelse af de hjerte-morfologiske og funktionelle ændringer i Drosophila på andet stadium (L2), tredje stadie (L3), puppe dag 1 (PD1), puppe dag 2 (PD2), puppe dag 3 (PD3) , puppe dag 4 (PD4), puppe dag 5 (PD5), og voksne (figur 1) ved hjælp af OCM at lette undersøgelse af menneskelige relaterede medfødte hjertesygdomme. Hjerte funktionelle parametre, såsom HR og CAP blev kvantitativt analyseret på forskellige udviklingsstadier at afsløre hjertets udviklingstræk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Udarbejdelse af OCM System for Optical Imaging af Drosophila 16
- Vælg et spektrometer og en high-speed line scan kamera, der giver en ramme på mindst 80 frame / sek, så OCM-systemet vil være i stand til at løse hjerteslag Drosophila.
- Brug en bredbåndsforbindelse lyskilde til at sikre den aksiale opløsning på 2 um for at identificere hjertet struktur Drosophila.
- Brug en 10X mål at opnå en høj tværgående opløsning.
- Brug en 45 ° stang spejl at afspejle referencearmen lysstråle og til at generere en ringformet prøve arm lysstråle til at udvide dybden af fokus på enhederne.
- Udvikle en brugerdefineret computerprogram til at styre OCM-systemet og udføre målinger.
2. Drosophila Kultur
- Standard Fly Food Preparation
- Sætte ~ 5 ml øjeblikkelig Drosophila formel i en polystyren hætteglasrør med bistand fra et papir sliske.
- Hæld ~ 8 ml vand i formlen til korrekt mætning af fødevarer.
- Føj forskellige supplementer til standarden flyve mad til forskellige eksperimenter. Under forberedelsen af alle-trans -retinal (ATR) mad til optogenetic pacing eksperiment 35, brug en pipette til at udtrække 100 mM ATR og opløses i ~ 8 ml vand for at få ATR koncentration på 1 mM i fødevarer. Efter blanding af opløsningen ensartet, hældes opløsningen i formlen, og rør det i tilstrækkelig grad.
- Til fremstilling af en fedtrig-diæt for at studere fedmerelaterede hjertedysfunktioner i Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formel med 15 ml vand i en kop og varme i 30 sekunder i en mikrobølgeovn. Sæt nogle økologisk ekstra jomfru kokosolie i en anden kop og varme det i 90 sekunder i mikrobølgeovnen.
- Uddrag 7,5 ml kokosolie og blandes med det fremstillede formel tilstrækkeligt til at vægt / volumen-forhold på kokosolie til fødevarer ~ 30/100, og then ekstrakt ~ 2 ml blandet mad og sætte det i bunden af et rør.
- Vent i 1 min, indtil mediet er grundigt mættet. Komprimere mad forsigtigt med en flad overflade for at optimere levevilkårene for Drosophila. Tilføj 6 - 8 kerner af gær til den forberedte formel, og sæt røret med en klynge af bomuld.
- Bananfluen kors og kultur
- Tag et rør med forberedt standard flue mad, og fjern sluttet bomuld. overføre forsigtigt voksne fluer (mandlige og kvindelige) til røret, og sæt røret med bomuld med det samme. Kontroller bomuld for at sikre, at der ikke er mellemrum mellem bomuld og rørvæggen at forhindre fluer fra at flygte fra røret.
- Hold Bananfluer i inkubatoren ved 25 ° C i krydsning. De fleste af generne er aktive, og de cellulære proteiner syntetiseret ved 25 ° C 36-39.
- Tag røret ud fra inkubatoren efter 8 hånd overføre enDult flyver ud af røret for at opnå de æg ved tilsvarende alder for eksperimentel kontrol.
- Fortsæt dyrkning af æg i inkubatoren ved 25 ° C, hvilket er standard temperatur i Drosophila udvikling med udviklingen periode på 8,5 dage 40,41.
BEMÆRK: Temperatur påvirker udviklingsperiode (æg til voksen) og ekspressionsniveauet af forskellige gener.
3. Udførelse Optisk Imaging med OCM
- Mount Fly Larve for Optical Imaging
BEMÆRK: æg ifølge Drosophila luger hos 22 - 24 timer ved 25 ° C til den første stadiums larver (L1). Det andet stadium larve opstår efter yderligere 24 timer. Den største larveformen er den tredje stadiums larve, der molts efter ca. 24 timer. Strukturelle karakteristika i larve kan anvendes til at adskille deres forskellige udviklingsstadier. Størrelsen af munddele mellem første stadiums og andet stadium er anderledes. Mundenkroge af det første stadiums larve er meget små og ligner to par små sorte pletter, mens munden krogene på andet stadium larve er større og strukturen er klarere. Spirakler anvendes sædvanligvis til at identificere det andet instar og den tredje stadium. Det andet stadium larve har slået forreste Spirakler, mens for tredje stadie, er de forreste Spirakler forgrenede. En mørk orange ring vil begynde at blive vist på spidsen af de bageste Spirakler i tredje stadium larve.- Sæt et stykke dobbeltklæbende tape til en ren mikroskop objektglas. Pres luftboblerne under båndet for at undgå de reflekser forårsaget af luftbobler under billedbehandling.
- Tag et af rørene med de dyrkede flyver ud fra inkubatoren ved larvestadiet.
- Identificer larve i medierne, fjerne det fra medierne med en blød børste og sted på en ren væv. Tag fødevarerne fast til larve med en våd blød børste og tør den på vævet.
- Flyt cleaned flyve til et væv under objektivlinsen af et bredt felt mikroskop.
- Justere fokus af mikroskopet for at finde et klart overblik over flue. Identificere den rette udviklingsstadium larve af dets strukturelle karakteristika med mikroskopet.
- Placer flue hjælp af blød børste. Sørg kroppen er lige med den dorsale side vender opad for at forberede sig til montering på objektglasset ved strækkes. Udfør dette trin under mikroskopet.
- Sørg larve er helt tør inden montering på båndet. Ellers vil larven ikke klæbe til båndet.
- Stick den dorsale side af positioneret flyve til dobbelt side tape på objektglasset med moderat tryk. Bemærk, at for meget pres kan dræbe flyve og for lidt kraft vil føre til at flyve bevægelse under billedbehandling.
- Optisk Imaging af Drosophila på larvestadier (L2 og L3) med OCM
BEMÆRK: En bred lumen af hjertet røret kan være found beliggende i segmenter mellem A5 til A8 larvestadierne (figur 1). De tværgående OCM M-mode billeder (2D + tid) blev erhvervet ved A7 segment af hjertet rør til hver larve til at lette det systoliske og diastoliske analyse.- Placer monteret larve på den justerbare prøve fase af OCM-systemet langs y-tværgående retning med den dorsale side vendende opad under objektivlinsen. Et lille hul i prøven fase er nødvendig for at placere larven at undgå dens kontakt med den fase flyet.
- Juster prøven tidspunkt at flytte hjertet rør af frugten flyve til brændplan imagografistrålen. Til nemt at finde A7 segment, finde posteriore område af hjertet røret med den tidstro tværsnitsarealet OCM billeder i billede erhvervelse software. Flyt derefter scenen fremad, indtil A7-segmentet er synlig.
- Indstil parametre for købet billedet software til 100 A-scanninger pr B-scan (frame), 100 B-scanninger, og scanneR spænding til dækning ~ 0,28 mm i X-tværretningen og 0 V i y-tværretningen. Klik på knappen "start" i softwaren for at erhverve de baggrund støjdata for baggrund subtraktion ved at blokere prøven stråle vej med en mørk klud.
BEMÆRK: 3 af de 100 frames kan bruges til baggrunden subtraktion. - Indstil parametre for datafangst software til 128 A-scanninger pr B-scan, 4096 B-scanninger, og scanneren spænding til at dække ~ 0,28 mm i x-tværgående retning, og 0 V i y-tværgående retning. Klik på knappen "start" i softwaren for at erhverve de tværgående M-mode billeder på tværs A7 segment af fluen hjerte rør over et område, der dækker 0,28 x 0,57 mm 2 for omkring 30 sek.
- Bloker imaging stråle ved hjælp af en mørk klud under data besparelse proces for at undgå langvarig udsættelse af fluen hjerte til den billeddannende lys.
- Gentag målingen for 5 gange for at få pålidelige målinger af hjertet sjovtktion.
- Indstil parametre for købet billedet software til 400 A-scanninger pr B-scan, 800 B-scanninger, og scanneren spænding til at dække ~ 1,7 mm i x-tværgående retning, og ~ 4 mm i y-tværgående retning. Flyt fase i begge retninger for at sikre, at hele frugtflue kan afbildes. Klik på knappen "start" i softwaren til at erhverve et datasæt for at få billeder af bananfluen i 3 dimensioner. Bemærk: 3D-flue struktur kan gengives ved hjælp af Amira 3D-software
- Brug en våd blød børste til at fugte den målte flue og forsigtigt fjerne det fra objektglasset. Flyt den til et separat rør til kontinuerlig udvikling. Mærk rør til langsgående undersøgelse gennem de næste udviklingsstadier.
- Billede Drosophila på puppe Stages
BEMÆRK: Alle bananfluer blev taget ud til billeddannelse fra PD1 til PD5. Som vist i larven skematiske i figur 1b, en bred lumen forbliver i A5-A8 segmenter af the heart rør, indtil PD1. Fra PD2, en konisk kammer begynder at udvikle mellem A1 til A4 segmenter. At erhverve ensartede billeder og lette hjerte analyse blev tværgående M-mode billeder opnået fra A7-segmentet ved PD1, og fra A1-segmentet efter PD2, som markeret i figur 1b.- Billede Drosophila på PD1
BEMÆRK: Drosophila vil have en hvid puparium for en kort tidsvindue (0 - 1 time) under PD1. Denne gang vindue er ideel til at udføre optisk billeddannelse af tidlig puppe, da den høje gennemsigtighed fører til højere lysgennemtrængning for OCM billeddannelse.- Da bananfluer findes på rørvæggen, når de bliver puppe, fjern puppe fra enkelte rør til billeddannelse ved PD1 med en våd blød børste, og rengør puppe med børsten, hvis der er fødevarer sidder fast til kroppen.
- Monter bananfluen på en lille glasplade direkte med den våde børste og holde den dorsale side, der vender opad (fig 1a
- Fjerne overskydende vand fra siden af fluen krop.
- Sæt objektglasset på prøven fase af OCM-systemet, holder bananfluen på toppen. Find klart tidstro billede af A7 segment af fluen hjerte anvendelse af den samme strategi, der er beskrevet i larven måling.
- Sæt de samme parametre for datafangst software som i afsnit 3.2, og image de hjerteslag på A7-segmentet at erhverve tværgående M-mode og 3D-billeder.
- Efter billeddannelse, bruge en pincet til at placere objektglasset med puppe tilbage ind i røret for kontinuerlig kultur.
- Billede Drosophila ved PD2 til PD5 Stages
BEMÆRK: Da prøven bliver mere og mere uigennemsigtig i de puppe stadier, vil indtrængningsdybde billeddannende system reduceres.- Brug en pincet til forsigtigt at fjerne glasset sLiDE monteret med fluen på PD2 fra røret til billeddannelse. På PD2, prøven skallen bliver gullig og kroppen bliver mindre transparent sammenlignet med PD1 (figur 1).
- Sæt dias på prøven etape af OCM-systemet.
- Juster prøven tidspunkt at flytte flyve ind i brændplanet af imagografistrålen af OCM-systemet. Find den forreste ende af hjertet rør med realtid tværsnit OCM billede. Flyt ~ 50 um tilbage i den bageste retning for at finde A1 segment af hjertet røret.
BEMÆRK: På dette tidspunkt af hjerte udvikling (PD2), vil det koniske kammer være meget lille og kan ikke slå. - Saml tværgående M-mode datasæt fra segmentet A1 samt 3D-data ved hjælp af den samme metode som tidligere udviklingsstadier.
- Sæt dias tilbage til røret omhyggeligt for kontinuerlig kultur.
BEMÆRK: På PD3, farven på modellen i skallen er mørkere end på PD2 tidspunkt. På PD4 stadium, ca sorte stribern observeres inde i skallen af enhederne. Nogle fluer vil udvikle sig til voksne fra dette tidspunkt i den følgende dag, mens andre vil udvikle sig til PD5. På PD5 stadie, sorte striber er endnu mere naturligvis set i bananfluer. Disse fluer bliver voksne i den følgende dag.
- Billede Drosophila på PD1
- Billede Drosophila på Adult Stage
BEMÆRK: I det voksne stadium, kan kvindelige og mandlige fluer skelnes ved størrelsen af legemet og farven af den nedre abdomen. Kvindelige voksne har større størrelse, mens hannerne er mindre og mørke-farvet i underlivet.- Tag røret ud fra inkubatoren når bananfluen udvikler sig til en voksen, og overføre den voksne flyve til en ~ 45 ml tomme hætteglas.
- Dyp absorberende ende (~ 1 cm længde, ~ 3 mm diameter) i en tryllestav i anæstesi, sætte staven i hætteglasset, og sæt røret med en klynge af bomuld for at holde bedøvelsesmiddel ende lige under sluttet bomuld og til Anesthetize fluen i 3 min. Varigheden af anæstesi afhænger af størrelsen af fluen, og kan variere mellem 2,5 til 3,5 min (for eksempel: mænd i 2,5 min, hunnen i 3 eller 3,5 min).
- Forbered et objektglas med et stykke dobbeltklæbende tape.
- Flyt bedøvede flue på objektglasset med dorsale side vender opad ved hjælp af blød børste.
- Adskil vingerne ved hjælp af en pincet og holde vingerne på båndet under et mikroskop for at løse fluen og udsætte hjertet region for billeddannelse.
- Billede fluen fra A1 segment af fluen hjerte (figur 1). Ved afslutningen af eksperimentet, kan fluen ofres.
4. Imaging Analysis 16
- Udvikle Matlab programmer til at konvertere 2D-og 3D binære filer indsamlet med købet billedet software til billedfiler.
- Brug ImageJ at identificere hjertet rør-regionen i billeder de tværgående M-mode og en tryllestav algoritme til at Createa maske af hjertet region for hver tværgående M-modus billede. Segment den maskerede region og bruge en peak-finding algoritme til at identificere de systoliske og diastoliske steder. Beregn den tid afhængige ændringer hjerte diameter fra billeder de tværgående M-mode.
- Baseret på de erhvervede tidsafhængige hjerte diametre, beregne hjerte-parametre som HR, hjerteaktivitet periode (CAP), ende diastole diameter (EDD), ende systole diameter (ESD), ende diastole område (EDA), og ender systole område ( ESA). Beregn fraktioneret forkortelse (FS) med
- Brug ImageJ at analysere 3D OCM billeder til at visualisere den strukturelle udvikling af flyve hjerte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den langsgående billeddannelse af hjertet blev udført under anvendelse af de frugtfluer med 24B-GAL4 / + stamme ved stuetemperatur med OCM. Målinger blev udført ved L2, L3, og ved 8 timers intervaller fra PD1 til PD4, og voksen dag 1 (AD1) til at spore metamorfose proces (tabel 1). Larve, tidlig puppe, sen puppe og voksne fluer blev monteret på objektglas, som ses i figur 1A. Segmentaktiverne funktioner i hjertet for larve- og voksne fluer blev vist i de skematiske repræsentationer i figur 1B.
I denne udviklingsmæssige undersøgelse blev 4.096 frames erhvervet i 32 sek med vores custom OCM system til at spore hjerteslag på en frugt flyve. For at forbedre målenøjagtigheden blev fem gentagne målinger tages for hver prøve ved hver udviklingsstadiet. 3D-data kan også fås til at observere ændringer hjerte struktur under forvandling.
Tværgående M-mode og 3D-billeder var c reated med brugerdefinerede Matlab programmer og ImageJ. En face billeder og aksiale snit også blev konstrueret ud fra de indsamlede data til at visualisere remodeling processen med hjertet under Drosophila metamorfose (figur 2). For at kvantificere hjertefunktionen af bananfluer, blev hjertet regionen automatisk segmenteret hjælp af en brugerdefineret Matlab program fra alle 4096 frames. Fluen hjertefrekvens (HR) kan kvantificeres fra tværgående M-mode OCM billeder (figur 3a). Under puppe stadier, holder Drosophila hjerte slå lejlighedsvis 16. Vi indførte en ny kardial funktionel parameter, hjerteaktivitet periode (CAP) at kvantificere forholdet af perioden med et hjerteslag til den samlede afbildningstiden (figur 3b). EDD, ESD, EDA, blev ESA og FS også til at kvantificere de hjertekammeret ændringer i både aksiale og tværgående dimensioner i løbet Drosophila udvikling. 16
indhold "> I larvestadier, hjertet røret begynder ved den bageste abdominale region A8 med en bredere lumen (A5 - A8 i figur 1B), og slutter ved den forreste dorsale segment A1 med en smallere diameter (T3 / A1 - A5 i figur 1B ). hjertekammeret var placeret medialt og dorsalt og blev større under L2 (figur 2 a, b) og L3 (figur 2 c, d). Efter indtastning PD1, iagttoges hjertet rør, der løber aksialt over toppen af en bevægelig luft boble (figur 2 e, f) Omkring 10 -. 13 timer senere, boblen forsvandt efter puparium dannelse og de brede lumen blev krænget Da den forreste hjerte røret blev ventralt beliggende, hele hjertet røret var usynlige undtagen den posteriore region i. . OCM billeder ~ 12 timer efter puparium dannelse Senere under PD2, hjertekammeret gradvist på linje langs den dorsale abdomen, og den bageste del (A6 - A8) af hjertet blev elimineret (figur 2 g, h) 42,43. En konisk kammer begyndte at udvikle ~ A1 - A4 segment under PD2 og voksede i størrelse, indtil den voksne fase (figur 2 i - m).Udover at observere strukturændringer blev mange funktionelle ændringer findes såvel under hjerte-remodellering. De M-mode billeder vist i figur 3 viser, at hjerteslag aftog markant fra larvestadiet til puppestadiet, og derefter steg betydeligt fra puppe til voksen. Blev observeret Væsentlige HR ændringer i livsforløbet (figur 4a). Endvidere blev hjerteaktivitet periode (CAP) analyseres for alle prøverne målt fra L2 til AD1 (figur 4b). Som vist i figur 4, HR besidder ~ 277 slag pr minut (bpm) for L2 og L3. Ved at indtaste de tidlige puppe stadier er der et markant fald i HR og den fælles landbrugspolitik. HR er reduceret til 86 ± 11 bpm i begyndelsen af PD1, og fortsætter med at falde til 26 ± 8 bpm af end af PD1 endelig kommer til et fuldstændigt stop tidligt i PD2. En interessant opdagelse er den længere periode med hjerte-inaktivitet observeret omkring PD2 etape (~ 24 timer - 48 timer efter puparium dannelse), kaldet hjerte-udviklingsmæssige diastalsis 16. I slutningen af PD2, genoptager langsom intermitterende bankende (HR 17 bpm ± 6 med CAP 5 ± 2). Gennem PD3 og PD4, HR og forøgelse af den fælles landbrugspolitik, indtil den når 392 ± 32 bpm og 95 ± 3% ved den første dag af den voksne fase (5 dage efter begynder puppestadiet).
Figur 1. Montering af Drosophila på forskellige stadier og Skematisk repræsentation af Heart Metamorphosis. (a) Montering af larver, puppe og voksen WT (24B-GAL4 / +) flyver på objektglas. (b) Skematisk repræsentation af hjerte metamorfose. Røde pile på larve og voksen schematic betegne OCM M-mode imaging steder indtil PD1 24 timer og for efterfølgende tidspunkter, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Drosophila Heart morfologiske ændringer. En face og aksialsnit OCM billeder af en WT Drosophila opnået ved (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 og (k, m) voksen niveauer. M-mode billeder af Drosophila hjerte blev opnået fra A7 segment indtil PD1 og fra A1 segmentet for senere stadier. Skalaen barer i en face og aksiale sektionsopdelte billeder betegne 200 um og 500 um, respectively. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Drosophila Heart funktionelle ændringer. (a) M-mode billeder på forskellige udviklingsstadier, der viser HR ændringer på tværs af livscyklus. (b) Eksempler demonstrerer hjerteaktivitet periode (CAP) beregning. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Kvantitativ analyse af Funktionel Cardiac Parameters i WT Fluer på forskellige udviklingsstadier, herunder L2, L3, puppe Stages ved 8 timers intervaller, og AD1. (a) HR. (b) den fælles landbrugspolitik. Fejlen bar i hver gruppe repræsenterer standardafvigelsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
| Developmental Stage | |||||||||||||||||
| L2 | L3 | PD1 | PD2 | PD3 | PD4 | AD1 | |||||||||||
| 8 timer | 16 timer | 24 timer | 32 timer | 40 t | 48 timer | 56 timer | 64 timer | 72 timer | 80 t | 88 timer | |||||||
| Specimen Number | 21 | 17 | 13 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 18 | 17 | 18 | 9 | 25 | |||
Tabel 1. Antal WT bananfluer målt ved forskellige udviklingsstadier i Cardiac Developmental Study.
Video 1. Sporing af Heartbeat Sammen Temporal Dimension og Tilsvarende Heart Chamber Diameter Skift langs Z-retning (aksial retning) i en WT flyve på L2. Hjertet slog relativ hurtigt med en konstant hastighed. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.) p>
Video 2. Tracking af Heartbeat ad Temporal Dimension og Tilsvarende Heart Chamber Diameter Skift langs Z-retning (aksial retning) i en WT flyve ved PD1. HR begyndte at falde. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 3. Sporing af Heartbeat ad Temporal Dimension og Tilsvarende Heart Chamber Diameter Skift langs Z-retning (aksial retning) i en WT flyve ved PD2. Hjertet holdt op at slå helt i den tid. Oscillation afbildes z-diameter skyldtes billeddannelse støj. target = "_ blank"> Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 4. Sporing af Heartbeat ad Temporal Dimension og Tilsvarende Heart Chamber Diameter Skift langs Z-retning (aksial retning) i en WT flyve ved PD4. Efter PD2, HR og CAP begyndte at stige. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 5. Sporing af Heartbeat ad Temporal Dimension og Tilsvarende Heart Chamber Diameter Skift langs Z-retning (aksial retning) i en WT Flyv på AD1. HR var den højeste blandt alle faser og CAP var næsten 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Video 6. 3D strukturel gengivelse af en larve flue. Klik her for at se denne video. (Højreklik for at downloade.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den hurtige hjerteslag Drosophila, med en maksimal HR omkring 400 bpm på larver og voksne stadier, kræver høj billeddannelseshastighed at løse hjertet diastoles og systoles (ikke mindre end 80 billeder / sek baseret på erfaringer). På grund af den lille hjertekammeret størrelse og micron skala hjerte vægtykkelse (5 - 10 um), en høj rumlig opløsning (bedre end 2 um) er påkrævet for at løse de hjerte rørstrukturer. I denne undersøgelse blev en høj opløsning og ultrahøj hastighed OCM system udviklet, hvor et spektrometer med 600 linjer / mm transmission rivning og en 2.048 pixel line-scan-kamera blev anvendt. En A-scanningshastighed på 20 kHz leveres af line-scan-kamera. Rammen hastighed på 128 billeder / sek er hurtig nok til at fange Drosophila hjerteslag ved multiple udviklingsstadier, herunder L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, og voksen. Lyskilden var en bred båndbredde superkontinuum lyskilde med en central bølgelængde og båndbredden af ~ 800 nm og ~220 nm og opnåede en aksial opløsning på ~ 1,3 um i væv. En 10X objektiv blev anvendt i prøven armen for at realisere en tværgående opløsning på ~ 3,9 um. Eftersom hjertet tube Drosophila er omkring 200 um under den dorsale overflade, er et billeddannende dybde af hundredvis af mikron meter påkrævet. En 45 ° stang spejl kan bruges til at generere en ringformet prøvestrålen og udvide fokusdybden i prøven 44. Følsomheden og 3 dB roll-off blev bestemt til at være 96 dB og 600 um, henholdsvis med prøven arm magt ~ 9 mW. En tilpasset computerprogram blev anvendt til at styre OCM-systemet og udføre målingerne. De kardiale strukturelle billeder og funktionelle parametre opnået demonstrere muligheden for at bruge OCM til kvantitativt karakterisere hjerte morfologi og funktion af Drosophila hele dets livscyklus.
I øjeblikket er flere andre teknikker også anvendes til at afbilde en lilledyrets hjerte struktur eller funktion, såsom computertomografi (CT), magnetisk resonans billeddannelse (MRI), og ultralyd. OCM giver højere rumlige og tidsmæssige opløsninger end disse teknikker, der gør det muligt visualisering af fine strukturer og hurtige dynamik i animalske hjerter. Konfokal mikroskopi er en anden udbredt imaging teknik, men dens lave billedbehandling penetration og rekvisition af billeddannende kontrastmidler begrænse sine applikationer i levende dyr. Forholdsvis, OCM giver høj hastighed og etiket-fri billeddannelse til visualisering hurtige hjerte- dynamik ikke-invasivt i små dyr. Der er dog stadig begrænsninger OCM. For eksempel er det billeddannende dybde leveres af OCM begrænset ved lysspredning fra flere hundrede mikrometer til ca. 1 mm i væv, mens ultralyd har penetration dybder på op til 10 cm. Sammenlignet med konfokal mikroskopi, OCM har en højere hastighed og bedre billedbehandling dybde, men med lavere opløsning og dårlig molekylær kontrast. Desuden er vores nuværende OCM system er based på spektral-domæne detektionssystemer. Højere billeddannelseshastighed baseret på fejede source OCM 45 kan give mere tydelige billeder af hurtige dynamik ligesom hjerteslag.
For at udføre langsgående undersøgelse af hjerteslag i Drosophila med OCM, er der flere kritiske trin i protokollen. Fluerne skal håndteres meget fint i alle faser af forsøget. Håndtering larve bør være særligt skånsom, da det er let at beskadige larve, som kunne påvirke hjerte struktur og funktion i følgende udviklingsstadier. Fluerne skal placeres på dækglasset og den billeddannende fase meget præcist. Dårligt placerede fluer vil gøre det vanskeligt at erhverve kvalitet billeder og kan forårsage skæve strukturelle og funktionelle hjerte parameterværdier. Derudover overfører voksne fluer fra det ene rør til et andet og at sætte vat bør være meget hurtig til at forhindre deres flugt fra røret.
Forskellige undersøgelser afDrosophila hjerte udvikling kan udføres ved at modificere protokollen. Temperaturen, ved hvilken fluerne dyrkes, kan øges eller mindskes fra 25 ° C til at ændre hjertets genekspression niveau og ændre perioden flyve udvikling. Ved at tilføje nogle ingredienser såsom kokosnøddeolie eller ATR til standarden fødevarer, kan hjertet udvikling ændres. Specifikke undersøgelser kan udføres i vildtype eller transgene fluer. Når man studerer bananflue hjerte udvikling i længderetningen, kan forskellige tidsintervaller anvendes til at udføre de OCM målinger, for eksempel kunne en 8 timers interval anvendes under de puppe stadier. Grundet begrænset følsomhed vores OCM-system, er en masse af ensartet pletstøj fundet i tværgående M-mode billeder de, som kan gøre det vanskeligt at korrekt identificere hjerte sammentrækning signaler med Matlab programmer og mindske effektiviteten af dataanalyse. Følsomhed kan øges ved at forbedre tilpasningen af OCM-systemet. Optimerede filtrering algoritmeranbefales at fjerne en del af de prikker.
Den beskrevne protokol er blevet anvendt til at studere stilhed menneskelige døgnrytmen ortologer, dCry og dClock inducerede kardiale defekter i Drosophila. Nedsat HRs blev observeret på forskellige udviklingsstadier, herunder larve, puppe og voksen 15,16. Rollen af døgnrytmen gener i hjertet udvikling blev afsløret, hvilket kan forklare associationen mellem kardiovaskulære sygdomme og døgnrytme relateret aktivitet mønstre. High-fat-kost (HFD) inducerede hjertelidelser blev også undersøgt ved at analysere hjerte funktionelle ændringer af bananfluer fodret med HFD 15. Disse undersøgelser viste ikke blot Drosophila som et effektivt redskab i den udviklingsmæssige undersøgelse af hjerte struktur og funktion, men også betydningen af hjerte-forløbsundersøgelse i forståelsen medfødte og postnatal humane sygdomme. Det OCM platform vil muliggøre en bred vifte af fremtidige undersøgelser in-gen-relateret humant hjertesygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
References
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
- Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
- Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
- Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
- Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
- Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
- Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
- Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
- Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
- Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
- Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
- Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
- Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
- Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
- Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
- Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
- Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
- Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
- Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
- Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
- Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
- Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
- Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
- Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
- Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
- Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
- Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
- Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
- Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).
