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Biology

Drosophila Preparação e imagem longitudinal do coração Função In Vivo Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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Estudo longitudinal do coração em animais pequenos contribui para a compreensão de uma variedade de doenças cardiovasculares relacionados humanos, tais como relacionado com o gene defeitos cardíacos congénita 1,2. Nas últimas décadas, vários modelos animais, tais como 3,4 rato, Xenopus 5,6, peixe-zebra 7,8, aviária 9 e Drosophila 10-16, têm sido usados para conduzir o coração desenvolvimento humano relacionados com a investigação. O modelo do rato tem sido amplamente utilizada para estudar o desenvolvimento cardíaco normal e anormal e fenótipos defeito cardíaco devido às suas semelhanças com o 3,4 coração humano. O embrião Xenopus é especialmente útil no estudo do desenvolvimento do coração devido ao seu fácil manuseio e 5,6 transparência parcial. A transparência do embrião e larva início do modelo peixe-zebra permite a observação óptica fácil de 7,8 desenvolvimento cardíaco. O modelo aviária é um assunto comum de estudos cardíacos desenvolvimento because o coração pode ser facilmente acessado após a remoção das cascas de ovo e a semelhança morfológica dos corações de aves para os seres humanos 9. O modelo de Drosophila tem algumas características únicas que a tornam ideal para a realização de estudos longitudinais do coração. Em primeiro lugar, o tubo de coração de Drosophila é de ~ 200 um abaixo da superfície dorsal, que fornece a conveniência para o acesso óptico e observação do coração. Além disso, muitos mecanismos moleculares e vias genéticas são conservadas entre Drosophila e vertebrados. Os ortólogos de mais de 75% dos genes humanos da doença foram encontrados em Drosophila, que tornaram amplamente utilizado em estudos transgénicos 11,13. Além disso, ele tem um ciclo de vida curto e baixos custos de manutenção, e tem sido utilizada como um modelo de amostra para investigação em biologia de desenvolvimento 14-16.

Relatórios anteriores descritos os protocolos para monitorar funções cardíacas Drosophila como o que eleArtbeat. No entanto, os procedimentos de dissecação foram necessários 17,18. imageamento óptico oferece uma maneira eficaz de visualizar desenvolvimento cardíaco em animais devido à sua natureza não-invasiva. Diferentes modalidades de imagens ópticas têm sido aplicados na realização de estudo cardíaca animal, tais como a microscopia de dois fótons 19, microscopia confocal 20,21, microscopia folha de luz 22 e tomografia de coerência óptica (OCT) 16,23-26. Comparativamente, outubro é capaz de fornecer grande profundidade de imagem nos corações de pequenos animais sem o uso de agentes de contraste, mantendo uma alta resolução e uma velocidade de imagem ultra, que são importantes para os animais vivos de imagem. Além disso, o baixo custo de desenvolvimento de um sistema outubro popularizou esta técnica de imageamento óptico de espécimes. Outubro foi utilizado com sucesso para o estudo longitudinal de Drosophila. Usando OCT, imagiologia morfológica e funcional cardíaca foi realizada para estudar as estruturas do coração, o funcpapéis adicionais de genes e os mecanismos de defeitos cardiovasculares presentes em modelos mutantes durante o desenvolvimento cardíaco. Por exemplo, o declínio da função cardíaca dependente da idade foi confirmada com gene regulado por baixo de conversão da angiotensina relacionadas com a enzima (ACER) em Drosophila com 27 de outubro. Fenotipagem de cardiomiopatia relacionada gene foi demonstrada em Drosophila usando outubro 28-33. A pesquisa usando outubro também revelou o papel funcional do gene humano SOX5 no coração de Drosophila 34. Em comparação com outubro, a CCE utiliza uma objetiva com uma abertura numérica maior para proporcionar uma melhor transversal resolução. No passado, a disfunção cardíaca causada por silenciar um gene circadiano humano ortólogo dCry / dCLOCK foi estudado utilizando um sistema personalizado 15,16 OCM, bem como o efeito de elevado teor de gordura por dieta em cardiomiopatias em Drosophila compreender obesidade induzida humana doenças cardíacas. 15

Aqui, the protocolo experimental é resumido para o estudo longitudinal das alterações morfológicas e funcionais cardíacas em Drosophila no segundo instar (L2), terceiro estádio (L3), dia pupa 1 (PD1), dia pupa 2 (PD2), pupa dia 3 (PD3) , pupa dia 4 (PD4), pupa dia 5 (PD5), e adulto (Figura 1) através da CCE para facilitar o estudo de doenças cardíacas congénitas humanos relacionados com. Cardíacas parâmetros funcionais, tais como RH e CAP foram analisados ​​quantitativamente em diferentes estágios de desenvolvimento para revelar as características de desenvolvimento cardíacos.

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Protocol

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1. Preparação da OCM do sistema para imagens ópticas de Drosophila 16

  1. Selecione um espectrômetro e uma linha de câmera de varredura de alta velocidade que fornece uma taxa de quadros de pelo menos 80 quadros / seg para que o sistema OCM será capaz de resolver o batimento cardíaco de Drosophila.
  2. Utilizar uma fonte de luz de banda larga para assegurar a resolução axial de 2 uM para identificar a estrutura de coração de Drosophila.
  3. Usar uma objectiva 10X para obter uma elevada resolução transversal.
  4. Usar um espelho de 45 ° haste de modo a reflectir o feixe luminoso de referência e o braço para gerar um feixe de luz braço amostra anelar para estender a profundidade de foco nas amostras.
  5. Desenvolver um programa de computador personalizado para controlar o sistema OCM e realizar medições.

2. Cultura de Drosophila

  1. Fly Preparação Food Standard
    1. Coloque ~ 5 ml fórmula Drosophila instantânea para um frasco de poliestirenotubo com a ajuda de uma calha de papel.
    2. Pour ~ 8 ml de água na fórmula para saturar adequadamente a comida.
    3. Adicionar diferentes suplementos para a comida mosca padrão para diferentes experimentos. Ao se preparar para todos--retinal (ATR) alimentos trans para a optogenética ritmo experimento 35, utilize uma pipeta para extrair ATR 100 mM e dissolvem-se em ~ 8 ml de água para obter a concentração de ATR de 1 mM em alimentos. Depois de se misturar a solução de modo uniforme, verter a solução para a fórmula e agita-se suficientemente.
    4. Para preparar um elevado teor de gordura-dieta para estudar a obesidade relacionada com disfunções cardíacas em Drosophila, 10,15 mistura ~ 10 ml fórmula com 15 ml de água num copo e calor durante 30 segundos num forno de microondas. Coloque um pouco de óleo de coco virgem extra biológico em outro copo e aquecê-lo por 90 segundos no forno de microondas.
    5. Extrair 7,5 ml de óleo de coco e misture com a fórmula preparada suficiente para tornar a relação peso / volume de óleo de coco para alimentos ~ 30/100, e Then ~ 2 ml de extracto de alimentos misturados e colocá-lo para o fundo de um tubo.
    6. Espere por 1 min até que o meio é completamente saturado. Compactar a comida cuidadosamente com uma superfície plana para otimizar as condições de vida da Drosophila. Adicionar 6 - 8 grãos de fermento para a fórmula preparada, e ligue o tubo com um conjunto de algodão.
  2. Frutas Cruzes voar e Cultura
    1. Tome um tubo com alimentos preparados mosca padrão, e remover o algodão conectado. transferir cuidadosamente as moscas adultas (masculino e feminino) ao tubo, e ligue o tubo com algodão imediatamente. Verifique o algodão para se certificar de que não há diferença entre o algodão e a parede do tubo para evitar moscas de escapar do tubo.
    2. Manter as moscas da fruta na incubadora a 25 ° C durante cruzamento. A maioria dos genes estão activos e as proteínas celulares são sintetizados a 25 ° C 36-39.
    3. Pegue o tubo para fora da incubadora depois de 8 de mão de transferências de umdult voa para fora do tubo para obter os ovos na mesma idade para o controle experimental.
    4. Continuar a cultura de ovos na incubadora a 25 ° C, que é a temperatura normal para o desenvolvimento de Drosophila com o período de desenvolvimento de 8,5 dias 40,41.
      NOTA: Temperatura influencia o período de desenvolvimento (ovo a adulto) e nível de vários genes de expressão.

3. Execução de imagens ópticas com OCM

  1. Mount Fly Larva for Imaging Optical
    NOTA: O ovo de portinholas de Drosophila em 22-24 h a 25 ° C a larva de primeiro estágio (L1). A segunda larva instar surge após mais 24 horas. A maior forma larval é a terceira larva instar, que molts após cerca de 24 horas. características estruturais em larvas podem ser usadas para distinguir as suas diferentes fases de desenvolvimento. O tamanho dos aparelhos bucais entre o primeiro estádio e do segundo estádio é diferente. A bocaganchos de larva de primeiro estágio são muito pequenas e se parecem com dois pares de minúsculos pontos negros, enquanto os ganchos na boca da segunda larva instar são maiores e a estrutura é mais clara. Os espiráculos são normalmente usados ​​para identificar o segundo instar e o terceiro instar. A segunda larva instar tem batido espiráculo anterior, enquanto que, para o terceiro instar, os espiráculos anteriores são ramificadas. Um anel de laranja escuro começa a aparecer na ponta dos espiráculos posteriores no terceiro instar de larva.
    1. Aplique um pedaço de fita dupla face para uma lâmina de microscópio de vidro limpo. Expulsar as bolhas de ar sob a fita para evitar as reflexões provocadas por bolhas de ar durante o exame.
    2. Pegue um dos tubos com as moscas cultivadas fora da incubadora na fase larval.
    3. Identificar a larva na mídia, remova-o da mídia com uma escova macia e coloque sobre um pano limpo. Remova qualquer alimento preso ao larva com uma escova macia molhada e seque-o sobre o tecido.
    4. Mova o cleaned voar para um tecido sob a lente objetiva de uma vasta microscópio de campo.
    5. Ajustar a focagem do microscópio, para encontrar uma visão clara da mosca. Identificar o estágio de desenvolvimento da larva direita pelas suas características estruturais, com o microscópio.
    6. Posicione a mosca usando a escova macia. Garantir que o corpo é linear com o lado dorsal voltada para cima para se preparar para montagem sobre a lâmina de vidro por o lado dorsal. Executar este passo sob o microscópio.
    7. Garantir a larva está completamente seco antes de montagem na fita. Caso contrário, a larva não irá aderir à fita.
    8. Cole lado dorsal da mosca posicionada para o lado de fita dupla na lâmina de vidro com uma pressão moderada. Note-se que demasiada pressão pode matar a mosca e muito pouca força vai levar para voar movimento durante o exame.
  2. Imagem óptica de Drosophila na fase larval (L2 e L3) com OCM
    NOTA: Uma ampla lúmen do tubo cardíaco pode ser found localizada nos segmentos entre A5 a A8 nas fases larvares (Figura 1). As imagens em modo-M OCM transversais (2D + tempo) foram adquiridas no segmento de A7 do tubo de coração para cada larva para facilitar as pressões sistólica e diastólica análise.
    1. Coloque a larva montado na fase de amostra ajustável do sistema OCR ao longo da direcção transversal Y-com o lado dorsal voltada para cima por baixo da lente objectiva. Um pequeno orifício na fase de amostra é necessário para a colocação da larva, para evitar o seu contacto com o plano de fase.
    2. Ajustar a fase de amostra para mover o tubo de coração a mosca da fruta ao plano focal do feixe de imagem. Para encontrar facilmente o segmento A7, encontrar região posterior do tubo de coração com o tempo real Imagens de corte OCM no software de aquisição de imagem. Em seguida, mova o palco para a frente até o segmento A7 é visível.
    3. Definir parâmetros do software de aquisição de imagem de 100 A-scans por B-scan (frame), 100 B-scans, eo scannetensão r para cobrir ~ 0,28 mm na direcção transversal X, e 0 V na direcção y transversal. Clique no botão "Iniciar" no software para adquirir os dados de ruído de fundo para a subtracção de fundo, bloqueando o caminho do feixe de amostra com um pano escuro.
      NOTA: 3 dos quadros 100 pode ser utilizado para a subtracção do fundo.
    4. Definir parâmetros do software de aquisição de dados 128 A-scans por B-scan, 4096 B-scans e a tensão scanner para cobrir ~ 0,28 mm na direcção-x transversal, e 0 V na direção y-transversal. Clique no botão "Iniciar" no software para adquirir as transversais imagens em modo-M em todo o segmento de A7 do tubo coração aérea sobre uma região que abrange 0,28 x 0,57 mm2 por cerca de 30 segundos.
    5. Bloquear o feixe de imagem com um pano escuro durante o processo de gravação de dados para evitar exposição prolongada do coração voar para a luz de imagem.
    6. Repetir a medição por 5 vezes para obter medições fiáveis ​​da diversão coraçãocção.
    7. Definir parâmetros do programa de aquisição de imagem para 400 A-scans por B-scan, 800 B-scans e a tensão scanner para cobrir ~ 1,7 mm na direcção-x transversal, e ~ 4 mm na direcção y-transversal. Mova o estágio em ambas as direções para assegurar toda a mosca da fruta pode ser trabalhada. Clique no botão "Iniciar" no software para adquirir um conjunto de dados para obter imagens da mosca da fruta em 3 dimensões. Nota: A estrutura mosca 3D pode ser processado usando software Amira 3D
    8. Use uma escova macia molhada para umedecer a mosca medido e gentilmente removê-lo da lâmina de vidro. Movê-lo para um tubo separado para desenvolvimento contínuo. Rotular o tubo para o estudo longitudinal através dos próximos estágios de desenvolvimento.
  3. Imagem Drosophila na pupa
    Nota: Todas as moscas de fruta foram retirados para a imagem latente de PD1 a PD5. Como se mostra no esquema larva na Figura 1b, uma ampla lúmen permanece em A5 a A8 segmentos de thtubo de coração e até PD1. De PD2, uma câmara cónica começa a desenvolver-se entre A1 a A4 segmentos. Para adquirir imagens consistentes e facilitar a análise do coração, imagens em modo-M transversais foram obtidos a partir do segmento A7 em PD1, e a partir do segmento A1 após PD2, conforme marcado na Figura 1b.
    1. Imagem Drosophila em PD1
      NOTA: Drosophila terá um pupário branco para uma janela de tempo curto (0-1 horas), durante PD1. Esta janela de tempo é ideal para a realização de imageamento óptico de pupa cedo porque a alta transparência leva a uma maior penetração de luz para a imagem OCM.
      1. À medida que as moscas da fruta são encontrados na parede do tubo quando se tornam pupa, remover a pupa de tubos individuais para a imagiologia de PD1 com uma escova macia molhada, e limpar a pupa com a escova se houver comida colada ao corpo.
      2. Monte a mosca da fruta em uma pequena lâmina de vidro diretamente com o pincel molhado e mantenha o lado dorsal voltada para cima (Figura 1a
      3. Remover a água em excesso a partir do lado do corpo da mosca.
      4. Colocar a lâmina de vidro na fase de amostra do sistema OCR, mantendo a mosca da fruta em cima. Localizar imagem em tempo real clara do segmento A7 do coração mosca utilizando a mesma estratégia descrita na medição larva.
      5. Definir os mesmos parâmetros do software de aquisição de dados, como na seção 3.2, e a imagem dos batimentos cardíacos no segmento A7 para adquirir M-modo transversal e imagens 3D.
      6. Após a imagiologia, utilizar uma pinça para colocar a lâmina de vidro com crisálidas de volta para dentro do tubo para cultura contínua.
    2. Imagem de Drosophila em PD2 aos estádios PD5
      Observação: Uma vez que a amostra torna-se cada vez mais opaco, durante as fases de pupa, a profundidade de penetração do sistema de imagem será reduzida.
      1. Use uma pinça para remover cuidadosamente o s de vidrolide montado com a mosca na PD2 do tubo de imagem. No PD2, a concha amostra torna-se amarelada e o corpo torna-se menos transparente em comparação com PD1 (Figura 1).
      2. Coloque o slide no palco amostra do sistema OCM.
      3. Ajuste o estágio da amostra para mover a voar para o plano focal do feixe de imagem do sistema OCM. Localizar a extremidade anterior do tubo de imagem cardíaca OCM transversal em tempo real com. Mover ~ 50 mm para trás na direcção posterior para encontrar o segmento A1 do tubo cardíaco.
        NOTA: Neste ponto do desenvolvimento do coração (PD2), a câmara cónica será muito pequena e não pode ser bater.
      4. Recolha transversais conjuntos de dados em modo M do segmento A1, bem como dados 3D usando o mesmo método que estágios de desenvolvimento anteriores.
      5. Coloque o slide de volta para o tubo com cuidado para a cultura contínua.
        NOTA: A PD3, a cor da amostra no shell é mais escura do que na fase PD2. Na fase PD4, listras pretas can ser observados no interior do reservatório de os espécimes. Algumas moscas irá desenvolver em adultos a partir desta fase, no dia seguinte, enquanto outros vão evoluir para PD5. Na fase PD5, listras pretas são ainda mais obviamente visto nas moscas da fruta. Estas moscas se tornarão adultos no dia seguinte.
  4. Imagem Drosophila na fase adulta
    NOTA: Na fase adulta, moscas macho e fêmea podem ser distinguidos pelo tamanho do corpo e a cor da parte inferior do abdómen. adultos do sexo feminino têm tamanho maior, enquanto os machos são menores e no abdômen inferior de cor escura.
    1. Pegue o tubo para fora da incubadora, quando a mosca da fruta se desenvolve em um adulto, e transferir o adulto voar para a ~ 45 ml frasco vazio.
    2. Mergulhe a ponta absorvente (~ 1 cm de comprimento, ~ 3 mm de diâmetro) de uma varinha para a anestesia, coloque a varinha para dentro do frasco, e ligue o tubo com um conjunto de algodão para manter a extremidade anestésico logo abaixo do algodão ligado e anesthetize a mosca por 3 min. A duração da anestesia depende do tamanho da mosca, e pode variar entre 2,5 a 3,5 min (por exemplo: masculino durante 2,5 min, para a fêmea 3 ou 3,5 min).
    3. Prepara-se uma lâmina de vidro com um pedaço de fita adesiva de dupla face.
    4. Mova a mosca anestesiado sobre a lâmina de vidro com o lado dorsal voltada para cima usando a escova macia.
    5. Separar as asas, usando uma pinça e cumpri as asas na fita sob um microscópio para corrigir a mosca e expor região do coração para a imagem latente.
    6. Imagem da mosca do segmento A1 do coração mosca (Figura 1). No final da experiência, a mosca pode ser sacrificado.

4. Imagem Análise 16

  1. Desenvolver programas de Matlab para converter os arquivos binários 2D e 3D coletados com o software de aquisição de imagem para arquivos de imagem.
  2. Use ImageJ para identificar a região do tubo cardíaco nas imagens em modo-M transversais e um algoritmo de varinha mágica que serve para criarmáscara ea da região do coração para cada imagem em modo M transversal. Segmento da região mascarada e usar um algoritmo de busca de pico para identificar os locais sistólica e diastólica. Calcule o tempo muda de diâmetro coração dependentes das imagens em modo-M transversais.
  3. Com base nos diâmetros cardíacos dependentes do tempo adquiriu, calcular os parâmetros cardíacos, tais como RH, período de atividade cardíaca (PAC), diâmetro diástole final (EDD), diâmetro sístole final (ESD), end área de diástole (EDA), e terminam área sístole ( ESA). Calcule a fração de encurtamento (FS) com equação 1
  4. Use ImageJ para analisar as imagens 3D OCM para visualizar o desenvolvimento estrutural do coração mosca.

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Representative Results

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A imagem cardíaca longitudinal foi realizada utilizando as moscas da fruta com o 24B-GAL4 / + deformação à temperatura ambiente com OCM. As medições foram realizadas em L2, L3, e a intervalos de 8 hr de PD1 a PD4 e adultos dia 1 (AD1) para controlar o processo de metamorfose (Tabela 1). Larva, pupa cedo, pupa tardia e adultos moscas foram montadas em lâminas de vidro como pode ser visto na Figura 1A. As características segmento do coração para moscas larvares e adultas foram mostradas nas representações esquemáticas na Figura 1B.

Neste estudo de desenvolvimento, 4.096 quadros foram adquiridos em 32 segundos com o nosso sistema OCM personalizado para rastrear o batimento cardíaco de uma mosca da fruta. Para melhorar a precisão da medição, cinco medidas repetidas foram tomadas para cada amostra em cada estágio de desenvolvimento. dados 3D também pode ser obtido a observar as mudanças na estrutura do coração durante a metamorfose.

Transverse M-mode e imagens 3D foram c reated com os programas Matlab personalizados e ImageJ. En imagens de face e secções axiais também foram construídos a partir dos dados adquiridos para visualizar o processo de remodelação do coração durante a metamorfose de Drosophila (Figura 2). Para quantificar a função cardíaca de moscas de fruta, região do coração foi segmentada automaticamente usando um programa Matlab costume de todos os 4096 quadros. A frequência cardíaca mosca (HR) podem ser quantificados a partir das imagens OCM em modo M transversal (Figura 3A). Durante pupa, o coração pára de bater Drosophila ocasionalmente 16. Introduzimos um novo parâmetro funcional cardíaca, período de actividade cardíaca (PAC) para quantificar a relação entre o período com um batimento cardíaco para o tempo total de imagiologia (Figura 3b). EDD, ESD, EDA, ESA, e FS também foram usados para quantificar as mudanças câmara do coração, tanto axiais e transversais dimensões durante o desenvolvimento de Drosophila. 16

conteúdo "> Em estágios larvais, o tubo de coração começa no posterior A8 região abdominal com um lúmen mais amplos (A5 - A8 na Figura 1B) e termina no anterior A1 segmento dorsal com um diâmetro mais estreito (T3 / A1 - A5 na Figura 1B ). a câmara do coração foi localizado medialmente e dorsalmente e cresceu mais durante L2 (Figura 2 a, b) e L3 (Figura 2 c, d). Depois de entrar PD1, observou-se o tubo de coração correndo axialmente sobre a parte superior de um ar em movimento bolha (Figura 2 e, f) Cerca de 10 -. 13 h mais tarde, a bolha desapareceu após a formação pupário e o lúmen largos tornou-se evertido Uma vez que o tubo cardíaco anterior foi ventralmente localizadas, todo o tubo de coração foi invisível excepto a região posterior em a. . imagens OCM ~ 12 h após a formação pupário Mais tarde durante PD2, a câmara do coração gradualmente alinhadas ao longo do abdómen dorsal, e a parte posterior (A6 - A8) do coração foi eliminado (Figura 2 g, h) 42,43. Uma câmara cónica começou a desenvolver ~ A1 - A4 segmento durante PD2 e cresceu em tamanho até o estágio adulto (Figura 2 i - m).

Além de observar as mudanças estruturais, muitas mudanças funcionais foram encontrados, bem como durante a remodelação cardíaca. As imagens em modo-M mostrados na Figura 3 demonstram que o batimento cardíaco diminuiu significativamente a partir da fase larval para a fase de pupa, e, em seguida, aumentou substancialmente de pupa para adulto. Mudanças de RH significativas foram observadas durante o ciclo de vida (Figura 4a). Além disso, o período de actividade cardíaca (PAC) foi analisada por todos os espécimes medidos de L2 para AD1 (Figura 4b). Como mostrado na Figura 4, RH mantém a ~ 277 batimentos por minuto (bpm) para L2 e L3. Ao entrar no pupa início há uma diminuição acentuada no HR e CAP. RH é reduzido para 86 ± 11 bpm no início de PD1, e continua a diminuir para 26 ± 8 BPM e peland de PD1 finalmente chegando a uma parada completa no início PD2. Uma descoberta interessante é o longo período de inactividade cardíaca observada em torno de fase PD2 (~ 24 h - 48 h após a formação pupário), referido como cardíaca diastalsis desenvolvimento 16. No final de PD2, lento batimento intermitente retoma (RH 17 bpm ± 6 com PAC 5 ± 2). Ao longo PD3 e PD4, RH e aumento PAC até atingir 392 ± 32 BPM e 95 ± 3%, no primeiro dia da fase de adulto (5 dias após o início da fase de pupa).

figura 1
Figura 1. Montagem de Drosophila em fases diferentes e de Representação esquemática do coração Metamorphosis. (a) Montagem de larvas, pupas e adultos WT (24B-GAL4 / +) voa em lâminas de vidro. (b) Representação esquemática da metamorfose coração. setas vermelhas no larva e adulto schematic denotam os locais de imagem em modo M OCM até PD1 24 horas e para os pontos de tempo subsequentes, respectivamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2. Drosophila alterações morfológicas cardíacas. En face e imagens OCM em corte axial de um Drosophila WT obtido em (a, b) L2 (c, d) L3 (E, F) PD1 (g, h), PD2 (i, l) PD4 e (k, m) adulto estágios. Imagens em modo-M do coração de Drosophila foram obtidos a partir do segmento A7 até PD1 e do segmento de A1 para as fases posteriores. As barras de escala em en face e axial imagens seccionais denotar 200 um e 500 um, respectively. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3. Alterações Funcionais Drosophila coração. (a) as imagens em modo-M, em diferentes estágios de desenvolvimento que mostram alterações de RH em todo ciclo de vida. (b) Os exemplos que demonstram período de atividade cardíaca (PAC) cálculo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4. Análise Quantitativa de parâmetro funcional cardíacas no WT voa em diferentes estágios de desenvolvimento, incluindo L2, L3, pupa em intervalos de RH 8 e AD1. (a) HR. (b) CAP. A barra de erro de cada grupo representa o desvio padrão. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

estágio de desenvolvimento
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8 hr 16 hr 24 hr 32 hr 40 hr 48 hr 56 hr 64 hr 72 hr 80 hr 88 hr
Número espécime 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

Tabela 1. Número de WT moscas de fruta Medido em vários estágios de desenvolvimento do Estudo de Desenvolvimento cardíaca.

video 1
Vídeo 1. Acompanhamento da pulsação do coração Junto Temporal Dimension e correspondente câmara do coração Diâmetro Mudança ao longo da z Direction (direcção axial) em um WT voar a L2. O coração batia rápido em relação a uma taxa constante. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar). p>

video 2
Vídeo 2. Acompanhamento da pulsação do coração ao longo Temporal Dimension e correspondente câmara do coração Diâmetro Mudança ao longo da z Direction (direcção axial) em um WT voar em PD1. O HR começou a diminuir. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

vídeo 3
Vídeo 3. Acompanhamento da pulsação do coração ao longo Temporal Dimension e correspondente câmara do coração Diâmetro Mudança ao longo da z Direction (Direção Axial) em um WT voar a PD2. O coração parou de bater completamente durante o tempo. A oscilação de Z-plotados diâmetro era devido ao ruído de imagem. target = "_ blank"> Clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

video 4
Vídeo 4. Acompanhamento da pulsação do coração ao longo Temporal Dimension e correspondente câmara do coração Diâmetro Mudança ao longo da z Direction (Direção Axial) em um WT voar em PD4. Após PD2, o RH e CAP começou a aumentar. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

vídeo 5
Vídeo 5. Acompanhamento da pulsação do coração ao longo Temporal Dimension e correspondente câmara do coração Diâmetro Mudança ao longo da z Direction (Direção Axial) em uma mosca WT em AD1. A FC foi a maior entre todas as fases e CAP era quase 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Clique aqui para ver este vídeo. (botão direito do mouse para baixar).

vídeo 6
Rendição estrutural de vídeo 6. 3D de uma mosca larval. Por favor clique aqui para ver este vídeo. (Botão direito do mouse para baixar).

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Discussion

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A rápida pulsação de Drosophila, com um FC máxima em torno de 400 bpm em estágios larvais e adultas, requer alta velocidade de imagem para resolver os diástoles cardíacos e sístoles (não inferior a 80 frames / seg com base em experiências). Devido à dimensão da espessura de tamanho pequeno da câmara do coração e da parede do coração mícron (5 - 10 um), uma resolução espacial elevada (superior a 2 mm) é necessária para a resolução de estruturas de tubo coração. Neste estudo, um sistema OCR velocidade ultra-elevada e alta resolução foi desenvolvido, em que um espectrómetro de transmissão com 600 linhas / mm ralar e uma câmara de varrimento de linha de pixel 2048 foram usadas. Uma taxa de A-scan de 20 kHz é fornecido pela câmara linha de varredura. A taxa de quadros de 128 frames / seg é rápido o suficiente para capturar o batimento cardíaco Drosophila em vários estágios de desenvolvimento, incluindo L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5 e adultos. A fonte de luz foi uma ampla fonte de luz de banda supercontínuo com um comprimento de onda central e largura de banda de ~ 800 nm e ~220 nm, respectivamente, e obtida uma resolução axial de ~ 1,3 ^ M no tecido. Uma objectiva 10X foi usada no braço de amostra para realizar uma resolução transversal de ~ 3,9 | iM. Uma vez que o tubo de coração de Drosophila é de cerca de 200 um abaixo da superfície dorsal, é necessária uma profundidade de imagem de centenas de metros micron. Um espelho haste 45 ° pode ser utilizado para gerar um feixe de amostra anelar e prolongar a profundidade de foco 44 na amostra. A sensibilidade e 3 dB roll-off estavam determinados a ser de 96 dB e 600 mm, respectivamente, com o poder do braço amostra de ~ 9 mW. Um programa de computador personalizado foi usado para controlar o sistema de CCE e conduzir as medições. As imagens cardíacas estruturais e parâmetros funcionais obtidos demonstram a viabilidade do uso OCM para caracterizar a morfologia quantitativamente a função cardíaca e de Drosophila ao longo de todo o seu ciclo de vida.

Actualmente, várias outras técnicas também são utilizados para a imagem de um pequenoanimais da estrutura cardíaca ou função, tais como tomografia computadorizada (TC), ressonância magnética (MRI) e ultra-som. OCM fornece resoluções espaciais e temporais maiores do que estas técnicas, permitindo a visualização de estruturas finas e dinâmica rápida em corações de animais. A microscopia confocal é uma outra técnica de imagem amplamente utilizado, mas a sua baixa penetração de imagem e requisição de agentes de contraste de imagem limitar suas aplicações em animais vivos. Comparativamente, OCM permite alta velocidade e de imagem livre de etiqueta para a visualização dinâmica cardíaca rápida não-invasiva em pequenos animais. No entanto, ainda há limitações de OCM. Por exemplo, a profundidade da imagem fornecida pelo CCE é limitada por difusão de luz a partir de várias centenas de microns até cerca de 1 mm no tecido, enquanto o ultra-som tem profundidades de penetração de até 10 cm. Em comparação com a microscopia confocal, OCM tem uma velocidade maior e melhor profundidade da imagem, mas com menor resolução e contraste molecular pobres. Além disso, nosso sistema atual OCM é based em sistemas de detecção espectral no domio. Velocidade de imagem superior com base nos varreu-source OCM 45 pode fornecer imagens mais distintas da dinâmica rápidos como os batimentos cardíacos.

Para realizar estudo longitudinal dos batimentos cardíacos em Drosophila com OCM, há várias etapas críticas do protocolo. As moscas devem ser manuseados muito delicadamente em todas as fases da experiência. Gerenciando larva deve ser especialmente delicado, uma vez que é fácil de danificar a larva, o que poderia afetar a estrutura e função do coração nos seguintes estágios de desenvolvimento. As moscas deve ser posicionado sobre o vidro de cobertura e a fase de imagens com grande precisão. Mal moscas posicionados irá tornar mais difícil para adquirir imagens de alta qualidade e pode causar valores de parâmetros coração estruturais e funcionais distorcidas. Além disso, a transferência de moscas adultas a partir de um tubo para outro e ligar a bola de algodão deve ser muito rápido para impedir a sua fuga do tubo.

Diferentes estudos sobreO desenvolvimento do coração de Drosophila pode ser realizado modificando o protocolo. A temperatura a que as moscas são cultivadas pode ser aumentada ou diminuída de 25 ° C para alterar o nível de expressão de genes cardíacos e alterar o período de desenvolvimento da mosca. Pela adição de alguns ingredientes, tais como óleo de coco ou ATR para a comida padrão, o desenvolvimento do coração pode ser alterada. Estudos específicos pode ser realizado no tipo selvagem ou moscas transgénicas. Ao estudar o desenvolvimento do coração de mosca da fruta longitudinalmente, diferentes intervalos de tempo pode ser usado para executar as medições OCM, por exemplo, um intervalo de 8 horas pode ser utilizado durante as fases de pupa. Devido à sensibilidade limitada do nosso sistema OCM, muito barulho salpico uniforme é encontrado nas imagens em modo-M transversais, que podem fazer com que seja difícil de identificar corretamente os sinais de contração do coração com programas Matlab e diminuir a eficiência da análise de dados. A sensibilidade pode ser aumentada melhorando o alinhamento do sistema OCR. algoritmos de filtragem otimizadossão recomendados para remover uma porção do mosqueado.

O protocolo descrito foi aplicado para estudar o silêncio da orthologs circadiano humano, dCry e dCLOCK induzidas defeitos cardíacos em Drosophila. RHs houve diminuição em diferentes estágios de desenvolvimento, incluindo a larva, pupa e adulto 15,16. O papel dos genes circadianos em desenvolvimento do coração foi revelado, o que pode explicar a associação entre doenças cardiovasculares e padrões de atividade relacionada ritmo circadiano. Alto teor de gordura, dieta (HFD) Doenças cardíacas induzidas também foram estudados por meio da análise do coração alterações funcionais de moscas da fruta alimentados com HFD 15. Estes estudos não só demonstraram Drosophila como uma ferramenta poderosa para o estudo do desenvolvimento da estrutura e função do coração, mas também o significado de estudo longitudinal cardíaca na compreensão de doenças humanas congénitas e pós-natais. A plataforma OCM irá permitir uma ampla gama de estudos futuros ido gene n relacionado com a doença cardíaca humana.

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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<em>Drosophila</em> Preparação e imagem longitudinal do coração Função <em>In Vivo</em> Usando Optical Coherence Microscopy (OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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