Introduction
Langsgående studium av hjertet i små dyr bidrar til å forstå en rekke humane relaterte kardiovaskulære sykdommer, slik som genet knyttet medfødt hjertefeil 1,2. I de siste tiårene, ulike dyremodeller, for eksempel mus 3,4, Xenopus 5,6, sebrafisk 7,8, avian 9, og Drosophila 10-16, har blitt brukt til å gjennomføre det menneskelige hjerte-utvikling relatert forskning. Musen Modellen har vært mye brukt til å studere normale og unormale hjerte utvikling og hjerte defekt fenotyper grunn av sine likheter med det menneskelige hjertet 3,4. Xenopus embryo er spesielt nyttig i studiet av hjerte utvikling på grunn av enkel håndtering og delvis gjennomsiktighet 5,6. Gjennomsiktigheten av embryoet og tidlig larve av sebrafisk-modellen gir enkel optisk observasjon av hjerte utvikling 7,8. Avian modellen er et felles tema for utviklingshjerte studier because hjertet kan være lett tilgjengelig etter fjerning av eggeskall og den morfologiske likheten av aviær hjerter for mennesker 9. Den Drosophila modellen har noen unike funksjoner som gjør den ideell for å utføre longitudinelle studier av hjertet. Først, i hjertet rør av Drosophila er ~ 200 mikrometer under den dorsale overflate, som gir enklere for optisk tilgang og overvåkning av hjertet. I tillegg er mange molekylære mekanismer og genetiske trasé konservert mellom Drosophila og virveldyr. De ortologer på over 75% av menneskelige sykdomsgener ble funnet i Drosophila, som har gjort det mye brukt i transgene studier 11,13. Videre har den en kort livssyklus og lave vedlikeholdskostnader, og har blitt brukt som et eksemplar modell for utviklingsbiologi forskning 14-16.
Tidligere rapporter beskrev protokoller for overvåking av Drosophila hjertefunksjoner slik som hanArtbeat. Men disseksjon prosedyrer var nødvendig 17,18. Optisk imaging gir en effektiv måte for å visualisere hjerte utvikling hos dyr på grunn av sin ikke-invasive karakter. Ulike optiske bildediagnostikk har blitt brukt til å utføre dyr hjertestudie, for eksempel to-foton mikroskopi 19, konfokalmikroskopi 20,21, lys ark mikroskopi 22, og optisk koherens tomografi (OCT) 16,23-26. Relativt, er oktober i stand til å gi god bildedybde i små dyrehjerter uten bruk av kontrastmidler, samtidig som en høy oppløsning og en ultrahøy bildehastighet, noe som er viktig for bildebehandling levende dyr. I tillegg har den lave kostnaden for å utvikle en oktober system popularisert denne teknikken for optisk avbildning av prøver. Oktober har blitt brukt for den langsgående studium av Drosophila. Bruk av oktober, hjerte morfologisk og funksjonell avbildning har blitt utført for å studere hjerte strukturer, den funcelle roller gener og mekanismer for kardiovaskulære defekter i mutant modeller under hjerte utvikling. For eksempel ble aldersavhengig hjertefunksjon nedgang bekreftet med nedregulert angiotensin-converting enzyme relaterte (ACER) genet i Drosophila med 27 oktober. Fenotyping av genet relatert kardiomyopati ble vist i Drosophila hjelp oktober 28-33. Forskning ved hjelp oktober avslørte også den funksjonelle rollen til det humane genet SOX5 i sentrum av Drosophila 34. Sammenlignet med oktober, bruker OCM et mål med en høyere numerisk apertur for å gi bedre tverrgående oppløsning. I det siste, har hjertet dysfunksjon forårsaket av stanse en ortolog menneskelige biologiske genet dCry / dClock blitt undersøkt ved hjelp av en tilpasset OCM system 15,16, samt effekten av høy-fett-diett på cardiomyopathies i Drosophila å forstå fedme indusert menneskelig hjertesykdommer. 15
Her the eksperimentelle protokollen er oppsummert for longitudinell studie av hjerte morfologiske og funksjonelle endringer i Drosophila på andre stadium (L2), tredje stadium (L3), puppe dag 1 (PD1), puppe dag 2 (PD2), puppe dag 3 (PD3) , puppe dag 4 (PD4), puppe dag 5 (PD5), og voksne (figur 1) ved hjelp OCM å legge til rette studiet av menneskelige relaterte medfødte hjertefeil. Hjerte funksjonelle parametre, som HR og CAP ble analysert kvantitativt på ulike utviklingsstadier for å avdekke hjerte utviklingstrekk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av OCM System for optisk avbildning av Drosophila 16
- Velg et spektrometer og en høyhastighets linje skanning kamera som gir en bildefrekvens på minst 80 ramme / sek så OCM systemet vil være i stand til å løse hjerterytme av Drosophila.
- Bruke en bredbånds lyskilde for å sikre den aksielle oppløsning på 2 um for å identifisere hjertet strukturen i Drosophila.
- Bruk en 10X mål å oppnå en høy tverr oppløsning.
- Bruker en 45 ° stang speil for å reflektere referansearmen lysstråle og for å generere et ringformet prøve arm lysstråle for å utvide dybden av fokus i prøvene.
- Utvikle en tilpasset dataprogram for å kontrollere OCM systemet og utføre målinger.
2. Drosophila kultur
- Standard Fly Matlaging
- Sett ~ 5 ml umiddelbar Drosophila formel i et polystyren hetteglassrør med hjelp av et papir sjakten.
- Hell ~ 8 ml vann i formelen til riktig mette maten.
- Legg forskjellige kosttilskudd til standard fly mat for ulike eksperimenter. Når du forbereder for alle-trans -retinal (ATR) mat for optogenetic pacing eksperiment 35, bruk en pipette til å trekke 100 mM ATR og oppløses i ~ 8 ml vann for å få ATR konsentrasjon på 1 mM i mat. Etter blanding løsningen jevnt, hell løsningen inn i formelen og rør det tilstrekkelig.
- For å fremstille et høy-fett-diett for å studere fedmerelaterte dysfunksjoner i hjertet Drosophila, 10,15 mix ~ 10 ml formel med 15 ml vann i et beger og varme i 30 sekunder i en mikrobølgeovn. Ha litt økologisk extra virgin kokosolje i en kopp og varme den i 90 sekunder i mikrobølgeovnen.
- Ekstraher 7,5 ml kokosolje og blandes med den fremstilte formel tilstrekkelig til å gjøre den vekt / volum-forholdet av kokosnøttolje til mat ~ 30/100, og then ekstrakt ~ 2 ml blandet mat og sette den til bunnen av et rør.
- Vent i 1 min inntil mediet er grundig mettet. Komprimere mat forsiktig med en flat overflate for å optimalisere levekår for Drosophila. Legg 6 - 8 korn av gjær til forberedt formel, og plugge røret med en klynge av bomull.
- Bananflue Kors og kultur
- Ta en tube med forberedt standard fly mat, og fjern plugget bomull. overføre nøye de voksne fluene (mannlige og kvinnelige) til røret, og plugge røret med bomull umiddelbart. Sjekk bomull for å sikre at det ikke er noen åpning mellom bomull og rørveggen for å forhindre fluer fra rømmer fra røret.
- Hold frukt fluer i inkubator ved 25 ° C for innavl. De fleste av de gener som er aktive og de cellulære proteiner blir syntetisert ved 25 ° C 36-39.
- Ta slangen ut fra inkubatoren etter åtte hånd overføring av enDult flyr ut av røret for å få egg på samme alder for eksperimentell kontroll.
- Fortsett å dyrke eggene i inkubator ved 25 ° C, som er den standardtemperatur for Drosophila utvikling med utviklingen periode på 8,5 dager 40,41.
MERK: Temperatur påvirker utviklingsperioden (egg til voksen) og uttrykk nivå av ulike gener.
3. Utføre Optisk Imaging med OCM
- Mount Fly Larva for Optical Imaging
MERK: egg av Drosophila luker i 22 - 24 timer ved 25 ° C til den første instar larver (L1). Det andre stadium larven fremkommer etter ytterligere 24 timer. Den største larveformen er den tredje instar larve, som molts etter ca 24 timer. Strukturelle egenskaper i larve kan brukes til å skille de forskjellige utviklingsstadier. Størrelsen på munn mellom den første stadium og den andre stadium er forskjellig. Munnenkroker av den første stadium larven er svært liten og ser ut som to par små svarte flekker, mens munnen krokene på andre stadium larve er større og strukturen er klarere. De spiracles er vanligvis brukt til å identifisere den andre stadium, og den tredje instar. Den andre stadium Larven har skamslått fremre spiracles, mens for tredje stadium, blir de fremre spiracles forgrenet. En mørk orange ring vil begynne å vises på tuppen av de bakre spiracles i tredje stadium larve.- Påfør et stykke dobbeltsidig tape til en ren mikroskop glass slide. Utvise luftbobler under tape for å unngå refleksjoner forårsaket av luftbobler under bildebehandling.
- Ta en av rørene med de dyrkede flyr ut fra inkubatoren på larvestadiet.
- Identifiser larve i media, fjerne den fra media med en myk børste og legg dem på en ren klut. Fjern eventuelle mat stakk til larven med en våt myk børste og tørk den på vev.
- Flytt cleaned fly til en vev under objektiv av et bredt felt mikroskop.
- Juster fokus i mikroskop for å finne et klart syn på fly. Finne de riktige utviklingsstadiet av larven ved sine strukturelle egenskaper med mikroskop.
- Plasser fly med myk børste. Sikre at legemet er rett med ryggsiden vendt oppover for å forberede for montering på glass-slide ved dorsalsiden. Utfør dette trinnet under mikroskopet.
- Sørg larven er helt tørt før montering på båndet. Ellers vil larven ikke holder seg til tape.
- Stikke den dorsale side av det plassert fly til den doble side tape på glass-slide med moderat trykk. Legg merke til at for mye press kan drepe fly og for lite kraft vil føre til fly bevegelser under bildebehandling.
- Optisk Imaging av Drosophila på larvestadier (L2 og L3) med OCM
MERK: En bred lumen av hjertet røret kan være found ligger i segmentene mellom A5 til A8 på larvestadier (figur 1). De tverrgående OCM M-mode bilder (2D + tid) ble kjøpt til A7 segment av hjertet tube for hver larve til rette for systolisk og diastolisk analyse.- Plasser montert larve på det justerbare prøven fasen av OCM system langs y-tverretning med ryggsiden vendt oppover under objektivlinsen. Et lite hull i prøvetrinnet som er nødvendig for å plassere larven for å unngå dens kontakt med scenen planet.
- Juster prøvetrinnet for å bevege hjertet røret i bananflue til fokalplanet på bilde bjelken. For enkelt å finne A7 segmentet, finne den bakre delen av hjertet røret med sanntid snitt OCM bilder i bilde oppkjøpet programvare. Deretter flytter scenen fremover til A7 segmentet er synlig.
- Angi parametere for bildeopptak programvare til 100 A-skanninger per B-scan (ramme), 100 B-skanner, og scanner spenning for å dekke ~ 0,28 mm x-tverretningen, og 0-V i y-tverretningen. Klikk på "Start" -knappen i programvaren for å skaffe seg bakgrunnsstøydata for bakgrunnen subtraksjon ved å blokkere prøven strålebanen med en mørk klut.
NOTE: 3 av de 100 rammer kan anvendes for bakgrunnen subtraksjon. - Angi parametere for datainnsamling programvare til 128 A-skanninger per B-scan, 4096 B-skanner, og skanneren spenning for å dekke ~ 0,28 mm i x-tverretningen, og 0-V i y-tverretningen. Klikk på "Start" -knappen i programvaren for å skaffe seg de tverrgående M-mode bilder over A7 segment av flua hjertet rør over et område som dekker 0,28 x 0,57 mm 2 for ca 30 sek.
- Blokker bilde strålen å bruke en mørk klut under data lagringsprosessen for å unngå langvarig eksponering av flua hjerte til bilde lys.
- Gjenta målingen for 5 ganger for å få pålitelig måling av hjerte moroDette skjer.
- Angi parametere for bildeopptak programvaren til 400 A-skanninger per B-scan, 800 B-skanner, og skanneren spenning for å dekke ~ 1,7 mm i x-tverretningen, og ~ 4 mm i y-tverretningen. Flytt scenen i begge retninger for å sikre at hele bananflue kan avbildes. Klikk på "Start" -knappen i programvaren for å skaffe seg en datasettet for å få bilder av bananflue i 3 dimensjoner. Merk: 3D fly struktur kan gjengis ved hjelp av Amira 3D-programvare
- Bruk en våt myk børste for å fukte den målte fly og forsiktig fjerne den fra objektglass. Flytt den i et eget rør for kontinuerlig utvikling. Merk røret for longitudinell studie gjennom de neste utviklingsstadier.
- Bilde Drosophila på pupal Stages
MERK: Alle frukt fluer ble tatt ut for avbildning fra PD1 til PD5. Som vist i larven skjematisk i Figur 1b, er fortsatt en bred lumen i A5 til A8 segmenter av the hjerte rør til PD1. Fra PD2, starter en konisk kammer for å utvikle seg mellom A1 til A4 segmenter. For å skaffe konsistente bilder og legge til rette for hjerte-analyse, ble tverr M-mode bilder hentet fra A7 segmentet på PD1, og fra A1 segment etter PD2, som markert i Figur 1b.- Bilde Drosophila på PD1
MERK: Drosophila vil ha en hvit puparium for et kort tidsvindu (0 - 1 time) i løpet av PD1. Dette tidsvinduet er ideell for å utføre optisk avbildning av tidlig puppe fordi høy transparens fører til høyere lys penetrasjon for OCM bildebehandling.- Som frukt fluer er funnet på rørveggen når de blir puppe, fjerne puppe fra individuelle rør for bildebehandling på PD1 med en våt myk børste, og rengjør puppe med børsten hvis det er mat fast til kroppen.
- Monter frukt fly på et lite glass lysbilde direkte med våt pensel og holde ryggsiden vendt oppover (Figur 1a
- Fjerne overdreven vann fra den siden av fluelegeme.
- Sett glasset lysbildet på prøven stadium av OCM system, holder bananflue på toppen. Finne klar sanntids bilde av A7 segment av flue hjerte anvendelse av samme strategi som er beskrevet i larven målingen.
- Still de samme parameterne for datainnsamling programvare som i avsnitt 3.2, og bilde av hjerteslag på A7 segmentet å skaffe tverr M-modus og 3D-bilder.
- Etter bildebehandling, bruk en pinsett til å plassere glass-slide med puppe tilbake inn i røret for kontinuerlig kultur.
- Bilde Drosophila ved PD2 til PD5 Stages
Merk Fordi prøven blir mer og mer ugjennomsiktig i løpet av pupal fase, vil inntrengningsdybden av det bildedannende system reduseres.- Bruk en pinsett til å fjerne glasset s nøyeLiDE montert med fly på PD2 fra røret for bildebehandling. Ved PD2, blir prøven skallet gulaktig og legemet blir mindre gjennomsiktig sammenlignet med PD1 (figur 1).
- Sett lysbildet på prøven stadium av OCM system.
- Juster prøvetrinnet for å bevege fly inn i fokalplanet avbildning strålen fra OCM-systemet. Finner den fremre enden av hjerte rør med sanntids tverrsnittsbilde OCM. Bevege ~ 50 mikrometer tilbake i bakre retning for å finne den A1 segment av hjertet røret.
MERK: På dette punktet i hjertet utvikling (PD2), vil det koniske kammer være svært liten og kan ikke slå. - Samle tverr M-modus datasett fra A1 segment, samt 3D-data ved hjelp av samme metode som tidligere utviklingsstadier.
- Sett lysbildet tilbake til røret nøye for kontinuerlig kultur.
MERK: Ved PD3, fargen av prøven i skallet er mørkere enn den ved PD2 stadiet. På PD4 scenen, sorte striper can holdes inne i skallet av prøvene. Noen fluer vil utvikle seg til voksen fra dette stadiet i den påfølgende dagen, mens andre vil utvikle seg til PD5. På PD5 scenen, sorte striper er enda mer åpenbart sett i frukt fluer. Disse fluene blir voksne i den påfølgende dagen.
- Bilde Drosophila på PD1
- Bilde Drosophila på Voksen Stage
NB: I den voksne stadiet, kan kvinnelige og mannlige fluer skilles fra hverandre ved størrelsen av kroppen og fargen på den nedre del av magen. Voksne kvinner har større størrelse, mens menn er mindre og mørk-farget i nedre del av magen.- Ta slangen ut fra inkubatoren når bananflue utvikler seg til en voksen, og overføre den voksne fly til en ~ 45 ml tomme hetteglasset.
- Dypp absorberende enden (~ 1 cm lengde, ~ 3 mm diameter) av en tryllestav inn i anestesi, satte staven inn i hetteglasset, og plugge røret med en klynge av bomull for å holde bedøvelse slutt like nedenfor plugget bomull og til Anesthetize fly for 3 min. Varigheten av anestesi avhenger av størrelsen av fly, og kan variere mellom 2,5 til 3,5 min (for eksempel: Hann 2,5 min, kvinnelig til 3 eller 3,5 min).
- Forbered en glassplate med et stykke dobbeltsidig tape.
- Flytt bedøvet flue på glass-slide med ryggsiden mot oppover med myk børste.
- Separer vingene ved hjelp av en pinsett og hold vingene på båndet under et mikroskop for å fikse fly og avsløre hjerteregionen for bildebehandling.
- Bilde fly fra A1 segment av flua hjertet (figur 1). Ved slutten av eksperimentet, kan flue bli ofret.
4. Imaging Analyse 16
- Utvikle Matlab programmer for å konvertere 2D og 3D binærfiler innsamlet med bildet oppkjøpet programvare til bildefiler.
- Bruk ImageJ å identifisere hjertet tube-regionen i de tverrgående M-mode bilder og en tryllestav algoritme for å oppretteea maske av hjerteregionen for hver tverr M-modus bilde. Segment den maskerte regionen og bruke en topp-finding algoritme for å identifisere de systoliske og diastoliske steder. Beregn tidsavhengige hjertet diameter endringer fra de tverrgående M-mode bilder.
- Basert på ervervet tidsavhengige hjerte diametre, beregne hjerte parametere som HR, hjerteaktivitet periode (CAP), endediastolen diameter (EDD), slutten systole diameter (ESD), endediastolen område (EDA), og ender systole området ( ESA). Beregn brøk forkorting (FS) med
- Bruk ImageJ å analysere 3D OCM bildene for å visualisere den strukturelle utviklingen av flua hjertet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den langsgående hjerteavbildning ble utført ved hjelp av bananfluer med 24B-GAL4 / + belastning ved romtemperatur med OCM. Målinger ble utført ved L2, L3, og ved 8 timers intervaller fra PD1 til PD4, og voksen dag 1 (AD1) for å spore metamorfose fremgangsmåte (tabell 1). Larva, tidlig puppe sent Pupa og voksne fluer ble montert på glassplater som vist i figur 1A. Segment funksjonene i hjertet for larver og voksne fluene ble vist i de skjematiske fremstillinger i figur 1B.
I denne utviklings studien ble 4096 rammer kjøpt i 32 sek med våre tilpasset OCM system for å spore pulsen på en bananflue. For å forbedre målenøyaktigheten, ble fem gjentatte målinger tatt for hver prøve ved hvert utviklingsstadiet. 3D-data kan også fås til å observere hjerte strukturen endres i løpet av metamorfose.
Tverrgående M-modus og 3D-bilder var c reated med tilpassede Matlab programmer og ImageJ. En ansiktsbilder og aksiale snitt ble også konstruert fra de innsamlede data for å visualisere prosessen fornyelse av hjertet under Drosophila metamorfose (figur 2). For å kvantifisere hjertefunksjon av fruktfluer, ble hjerteregionen automatisk segmentert bruke en tilpasset Matlab program fra alle 4096 rammer. Flua hjertefrekvens (HR) kan kvantifiseres fra tverrgående M-mode OCM bilder (figur 3a). Under pupal etapper, slutter Drosophila hjertet slår av og til 16. Vi har introdusert et nytt hjerte funksjonell parameter, hjerteaktiviteten periode (CAP) for å kvantifisere forholdet mellom perioden med hjertet til den totale avbildnings tid (figur 3b). EDD, ESD, EDA, ESA, og FS ble også brukt til å kvantifisere hjertekammeret endringer i både aksial og tverrdimensjoner under Drosophila utvikling. 16
innhold "> På larvestadier, begynner hjertet rør i bakre mageregionen A8 med en bredere lumen (A5 - A8 i figur 1B) og ender på fremre ryggsegmentet A1 med smalere diameter (T3 / A1 - A5 i figur 1B ). hjertet kammeret ble plassert medialt og dorsalt og vokste seg større under L2 (Figur 2 a, b) og L3 (fig 2 c, d). Etter inntasting PD1, hjertet røret ble observert løper aksialt over toppen av et bevegelig luft boble (figur 2 e, f) Rundt 10 -. 13 timer senere, forsvant boblen etter puparium dannelse og de brede lumen ble vrengt Siden fremre hjertet røret ble ventralt plassert, av hele sitt hjerte røret var usynlig bortsett fra den bakre regionen i. . OCM bilder ~ 12 timer etter puparium formasjon senere under PD2, hjertet kammeret gradvis innstilt langs rygg- buk, og den bakre del (A6 - A8) av hjertet ble fjernet (figur 2 g, h) 4-2,43. En konisk kammer begynte å utvikle ~ A1 - A4-segmentet i løpet av PD2 og vokste i størrelse inntil det voksne stadium (figur 2 i - m).Foruten å observere strukturelle endringer, ble mange funksjonelle endringer fant også under hjerte ombygging. M-modus kan bildene i Figur 3 viser at hjerterytmen bremset ned betydelig fra larvestadiet til pupal scenen, og deretter økte betydelig fra puppe til voksen. Vesentlige HR endringer ble observert i løpet av livssyklusen (figur 4a). Videre ble hjerteaktiviteten perioden (CAP) analysert for alle prøvene, målt fra L2 til AD1 (figur 4b). Som vist i figur 4, holder HR på ~ 277 slag per minutt (bpm) for L2 og L3. Ved å skrive inn de tidlige pupal etapper er det en markert nedgang i HR og CAP. HR er redusert til 86 ± 11 bpm i begynnelsen av PD1, og fortsetter å synke til 26 ± 8 bpm av end av PD1 endelig kommer til en fullstendig stopp tidlig i PD2. Et interessant funn er lengre hjerte inaktivitet observert rundt PD2 scenen (~ 24 timer - 48 timer etter puparium dannelse), referert til som hjerteutviklings diastalsis 16. Ved slutten av PD2, fortsetter langsom forbigående pisking (HR 17 bpm ± 6 med CAP 5 ± 2). Gjennom PD3 og PD4, HR og CAP økning inntil nå 392 ± 32 bpm og 95 ± 3% på den første dagen av den voksne stadiet (5 dager etter start av pupal scenen).
Figur 1. Montering av Drosophila på ulike stadier og skjematisk fremstilling av hjerte Metamorphosis. (a) Montering av larve, pupal, og voksen WT (24B-GAL4 / +) flyr på glassplater. (b) Skjematisk fremstilling av hjerte metamorfose. Røde piler på larve og voksen schematic betegne OCM M-modus bildebehandling steder inntil PD1 24 timer og for senere tidspunkt, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Drosophila Hjerte morfologiske endringer. En ansikt og aksialsnitt OCM bilder av en WT Drosophila oppnådd ved (a, b) L2 (c, d) L3 (e, f) PD1 (g, h) PD2 (i, l) PD4 og (k, m) voksen etapper. M-modus bilder av Drosophila hjertet ble oppnådd fra A7 segmentet inntil PD1 og fra A1 segment for senere stadier. Skalaen barer i en face og aksiale sectional bilder betegne 200 mikrometer og 500 mikrometer, respectively. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Drosophila Hjerte funksjonelle endringer. (a) M-mode bilder på ulike utviklingsstadier som viser HR endringer på tvers av livssyklusen. (b) Eksempler som viser hjerteaktivitet periode (CAP) beregning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Kvantitativ analyse av Functional Cardiac Parameters i WT Fluer på ulike utviklingsstadier, inkludert L2, L3, pupal Stages 8 timers mellomrom, og AD1. (a) HR. (b) CAP. Feilen bar av hver gruppe representerer standardavviket. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| utviklings~~POS=TRUNC Stage | |||||||||||||||||
| L2 | L3 | PD1 | PD2 | PD3 | PD4 | AD1 | |||||||||||
| 8 timers | 16 timer | 24-timers | 32 hr | 40 hr | 48 timer | 56 hr | 64 hr | 72 timer | 80 hr | 88 hr | |||||||
| prøve~~POS=TRUNC | 21 | 17 | 1. 3 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 19 | 18 | 17 | 18 | 9 | 25 | |||
Tabell 1. Antall WT fruktfluer målt ved forskjellige utviklingsstadier i Cardiac Developmental Study.
Video 1. Sporing av Heartbeat Langs tidsdimensjonen og tilsvarende hjerte Chamber Diameter Endre langs z retning (aksial retning) i en WT fly på L2. Hjertet banket relativ rask i en jevn hastighet. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.) p>
Video 2. Sporing av Heartbeat langs tidsdimensjonen og tilsvarende hjerte Chamber Diameter Endre langs z retning (aksial retning) i en WT fly på PD1. HR begynte å avta. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 3. Sporing av Heartbeat langs tidsdimensjonen og tilsvarende hjerte Chamber Diameter Endre langs z Direction (aksial retning) i en WT fly på PD2. Hjertet stanset fullstendig i løpet av tiden. Den oscillasjon av de plottede z-diameter var på grunn av det bildestøy. target = "_ blank"> Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 4. Sporing av Heartbeat langs tidsdimensjonen og tilsvarende hjerte Chamber Diameter Endre langs z Direction (aksial retning) i en WT fly på PD4. Etter PD2, HR og CAP begynte å øke. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 5. Sporing av Heartbeat langs tidsdimensjonen og tilsvarende hjerte Chamber Diameter Endre langs z Direction (aksial retning) i en WT Fly på AD1. HR var den høyeste blant alle stadier og CAP var nesten 100%.rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "target =" _ blank "> Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Video 6. 3D strukturelle gjengivelse av en larve fly. Klikk her for å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den raske hjerteslag Drosophila, med en maksimal HR rundt 400 bpm på larve og voksne stadier, krever høy bildehastighet for å løse hjerte diastoles og systoler (ikke mindre enn 80 bilder / sek basert på erfaringer). På grunn av den lille størrelse hjertekammeret og mikron skala hjerteveggtykkelse (5 - 10 um), en høy romlig oppløsning (bedre enn 2 um) er nødvendig for å løse de hjerte rør strukturer. I denne studien ble en høy oppløsning og ultrahøy hastighet OCM system som er utviklet, hvor et spektrometer med 600 linjer / mm overføring gitter og en 2048 pixel linje scan kamera ble anvendt. En A-scan rate på 20 kHz er levert av line-skanning kamera. Bildefrekvens på 128 bilder / sek er rask nok til å fange Drosophila hjerterytme på flere utviklingsstadier, inkludert L2, L3, PD1, PD2, PD3, PD4, PD5, og voksen. Lyskilden var en bred båndbredde supercontinuum lyskilde med en sentral bølgelengde og båndbredden til ~ 800 nm og ~220 nm henhold og fått en aksial oppløsning på ~ 1,3 mikrometer i vev. En 10X objektiv ble brukt i prøven armen for å realisere en tverrgående oppløsning av ~ 3,9 um. Siden hjertet tube av Drosophila er rundt 200 mikrometer under dorsalflaten, er en bildedybde på hundrevis av mikron meter nødvendig. En 45 ° stang speil kan anvendes for å generere et ringformet prøvestråle og utvide dybden av fokus i prøven 44. Følsomheten og 3 dB roll-off ble bestemt til å være 96 dB og 600 um, henholdsvis med prøven arm kraft på ~ 9 mW. En tilpasset datamaskinprogram ble brukt til å styre OCM system og utføre målingene. De hjerte strukturelle bildene og funksjonelle parametrene oppnådd demonstrere gjennomførbarheten av å bruke OCM til kvantitativt å karakterisere hjerte morfologi og funksjon av Drosophila gjennom hele sin levetid.
For tiden er en rekke andre teknikker også brukes til å avbilde en litendyrets hjerte struktur eller funksjon, for eksempel computertomografi (CT), magnetisk resonans imaging (MRI), og ultralyd. OCM gir høyere romlig og tidsmessige oppløsninger enn disse teknikkene, slik visualisering av fine strukturer og raske dynamikken i dyre hjerter. Konfokalmikroskopi er en annen mye brukt avbildningsteknikk, men den lave bilde penetrasjon og rekvirering av bildekontrastmidler begrense sine applikasjoner i levende dyr. Forholdsvis gjør OCM høy hastighet og label-free bildebehandling for å visualisere raske hjerte dynamikk non-invasiv i små dyr. Men det er fortsatt begrensninger i OCM. For eksempel er det tenkelig dybde gitt av OCM begrenset av lysspredning fra flere hundre pm til ca. 1 mm i vev mens ultralyd har penetreringsdybder opp til 10 cm. Sammenlignet med konfokalmikroskopi, har OCM en høyere hastighet og bedre bildedybde, men med lavere oppløsning og dårlig molekylær kontrast. Videre er vår nåværende OCM system based på spektral-domenet deteksjonssystemer. Høyere bildehastighet basert på feide-kilde OCM 45 kan gi mer tydelige bilder av raske dynamikken som hjerteslag.
For å utføre longitudinell studie av hjerteslag i Drosophila med OCM, er det flere kritiske trinn i protokollen. Fluene må håndteres svært delikat i alle faser av forsøket. Managing larve bør være særlig forsiktig, siden det er lett å skade larve, noe som kan påvirke hjerte struktur og funksjon i de følgende utviklingsstadier. Fluene må plasseres på dekkglasset og avbildningstrinnet meget nøyaktig. Dårlig plassert fluer vil gjøre det vanskelig å skaffe seg kvalitetsbilder, og kan føre til forskjøvet strukturelle og funksjonelle hjerteparameterverdier. I tillegg flyr overføre voksen fra ett rør til et annet og koble bomullsdott bør være veldig fort for å hindre at deres flukt fra røret.
Ulike studier påDrosophila hjerte utvikling kan utføres ved å endre protokollen. Temperaturen ved hvilken fluene dyrket kan økes eller reduseres fra 25 ° C til å forandre hjerte genekspresjon nivå og endre flueutviklingsperioden. Ved tilsetning av noen ingredienser så som kokosnøttolje eller ATR til den standard mat, kan hjertet utvikling endres. Spesifikke studier kan gjennomføres i villtype eller transgene fluer. Når man studerer bananflue hjerte utvikling i lengderetningen, kan forskjellige tidsintervaller bli brukt til å utføre de OCM målinger, for eksempel, kan en 8 timers intervall bli brukt i løpet av de pupal stadier. På grunn av begrenset følsomhet i vårt OCM system, blir en masse av ensartet flekkstøy som finnes i de tverrgående M-modus-bilder, som kan gjøre det vanskelig å korrekt identifisere hjertesammentreknings signaler med Matlab-programmer og redusere effektiviteten av data analyse. Følsomhet kan økes ved å forbedre innrettingen av OCM systemet. Optimalisert filtrering algoritmerDet anbefales å fjerne en del av flekker.
Den beskrevne protokollen har blitt brukt til å studere stillheten av menneskelige biologiske ortologer, dCry og dClock indusert hjertefeil i Drosophila. Redusert HRS ble observert på ulike utviklingsstadier, inkludert larve, puppe og voksen 15,16. Rollen circadian gener i hjertet utvikling ble avslørt, noe som kan forklare sammenhengen mellom hjerte- og karsykdommer og døgnrytme relaterte aktivitetsmønstre. Høy-fett-diett (HFD) indusert hjertesykdommer ble også studert ved å analysere hjerte funksjonelle endringer av fruktfluer matet med HFD 15. Disse studiene viste ikke bare Drosophila som et kraftig verktøy i utviklingsstudie av hjerte struktur og funksjon, men også betydningen av hjerte longitudinell studie i å forstå medfødte og postnatal menneskelige sykdommer. Den OCM plattformen vil gjøre et bredt spekter av fremtidige studier in gen relatert menneskelig hjertesykdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Custom OCM imaging system | Developed in our lab | ||
| my Temp Mini Digital Incubator | Benchmark | H2200-HC | |
| Cover glass | AmScope | 200PCS | |
| Cotton Ball | RITE AID | ||
| Instant Drosophila Formula | CAROLINA | formula 4-24 | |
| Yeast | ActiveDry | ||
| Microscope | SONY | WILD M420 | |
| Brush | Loew-Cornell | 245B | being used to move specimens |
| Labview software | National Instruments | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | ||
| Matlab | Mathworks | ||
| Tweezer | Wiha | AA SA | to fix the fruit fly wings |
| FlyNap | Carolina Biological Supply Company | 4,224,898 | |
| Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M | Scotch | ||
| Pipette | Fisherbrand | MU18837 | |
| Organic Extra Coconut Oil | Spring Valley | 13183 | |
| Microscope Slide | CapitolBrand | M3504-E | |
| Drosophila Vials | SEOH | 8401SS | |
| All-trans-retinal | Sigma-Aldrich Co. | R2500 |
References
- Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223 (1), 169-180 (2000).
- Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223 (2), 266-278 (2000).
- Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15 (3), 165-176 (2003).
- Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37 (4), 395-414 (2009).
- Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11 (14), 1650-1658 (2003).
- Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064021 (2007).
- Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91 (2), 279-288 (2011).
- Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
- Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76 (1), 66-71 (2006).
- Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12 (5), 533-544 (2010).
- Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5 (1), 21-28 (1995).
- Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178 (2), 203-216 (1996).
- Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22 (3), 181-186 (1998).
- Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246 (1), 14-28 (2002).
- Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22 (4), 6803213 (2016).
- Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10 (9), e0137236 (2015).
- Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
- Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
- Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299 (5), H1728-H1735 (2010).
- Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41 (3), 465-469 (1993).
- Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. , 1303-1306 (2014).
- Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9 (2), 113-119 (2015).
- Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94 (9), 4256-4261 (1997).
- Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
- Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15 (10), 6251-6267 (2007).
- Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2 (03), 253-259 (2009).
- Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19 (1), 011014 (2014).
- Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (5), 1394-1399 (2006).
- Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), e35-e36 (2006).
- Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8 (3), 313 (2011).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15 (5), 056020 (2010).
- Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4 (3), 411-420 (2011).
- Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6 (9), 708-717 (2013).
- Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22 (18), 3798-3806 (2013).
- Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1 (9), e1500639 (2015).
- Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
- Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3 (4), (2007).
- McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20 (8), 384-391 (2004).
- Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17 (2), 241-254 (1979).
- Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
- Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
- Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109 (1), 51-59 (2001).
- Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132 (23), 5283-5293 (2005).
- Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17 (8), 1010-1014 (2011).
- Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21 (15), 18021-18033 (2013).
