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Biology

果蝇的制备及心功能体内使用光学相干显微镜成像纵向(OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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在小动物心脏的纵向研究有助于了解人类的各种心脑血管疾病,如基因相关的先天性心脏缺陷1,2。在过去的几十年中,各种动物模型,例如小鼠3,4-,爪蟾5,6-,斑马鱼7,8,禽流9,果蝇10-16,已被用来进行人体心脏的开发有关的研究。小鼠模型已被广泛用来研究正常和异常心脏发育,并且由于其相似与人的心脏3,4-心脏缺陷的表型。非洲爪蟾胚胎心脏发育的研究中尤其有用,因为它易于处理和部分透明5,6。胚胎和斑马鱼模型的早期幼虫的透明度,使得心脏发育7,8容易光学观测。禽流模型是心脏发育研究的共同课题因为...E中的心脏可以去除蛋壳和禽流感的心给人类9形态相似后,很容易地访问。 果蝇模型具有一些独特的功能,这使得它非常适合进行心脏的纵向研究。首先, 果蝇的心脏管〜200微米背表面之下,这对于心脏的光纤接入和观察提供了方便。此外,许多分子机制和遗传途径是果蝇和脊椎动物之间保守。人类疾病基因的75%以上的同源基因在果蝇 ,这些都使得它广泛应用于转基因研究11,13被发现了。此外,它具有生命周期短,维护成本低,并已被广泛用作发育生物学研究14-16标本模型。

以前的报告中所述的协议监测果蝇的心脏功能,如他artbeat。然而,被要求17,18解剖程序。光学成像提供了可视化的动物心脏发育的有效方法,因为它的非侵入性的性质。不同的光学成像方法都在进行动物心脏研究中得到应用,如双光子显微镜19,共焦显微镜20,21,光片镜22和光学相干断层扫描(OCT)16,23-26。相比较而言,OCT能够提供在小动物的心大成像深度不使用造影剂,同时保持了高分辨率和超高成像的速度,这是用于成像活体动物重要的。此外,开发一个OCT系统的低成本已经普及这种技术的样品光学成像。 OCT已经被成功地用于果蝇的纵向研究。使用OCT,心脏形态和功能成像已进行研究心脏的结构中,func基因的国的角色,并在突变体模型心血管缺陷心脏发育过程中的机制。例如,年龄依赖性心功能下降是证实了下调血管紧张素转换酶相关(ACER)在果蝇基因与华侨城27基因相关的心肌病表型是使用OCT进行28-33 果蝇证实。研究采用OCT还揭示了人类基因SOX5在34果蝇的心脏功能作用与华侨城相比,OCM使用一个客观的具有更高的数值孔径,以提供更好的横向分辨率。在过去,所造成的沉默同源物人体生理基因dCry / DCLOCK的心脏功能障碍已被使用定制OCM系统15,16,以及高脂饮食对果蝇心肌病的效果,了解肥胖诱导人研究心脏疾病。 15

在这里,日Ë实验方案总结为果蝇在二龄(L2),三龄(L3),蛹1天(PD1),蛹天2(PD2),蛹第3天心脏形态和功能变化的纵向研究(PD3) ,蛹天4(PD4),蛹5天(PD5)和成人使用OCM以促进人类有关的先天性心脏病的研究( 图1)。心脏功能参数,如HR和CAP物进行定量分析在不同发育阶段以显示心脏发育的功能。

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Protocol

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1. 果蝇 16的光学成像OCM系统的研制

  1. 选择一个分光计和高速行扫描摄像机,可提供至少80帧/秒的帧速率,以便该OCM系统将能够解决果蝇的心跳。
  2. 使用宽带光源,以确保2微米轴向分辨率识别果蝇的心脏结构。
  3. 使用10X的目标,以获得较高的横向分辨率。
  4. 使用45°杆镜子反射参考臂的光束,并产生一个环形样品臂光束扩展聚焦深度的标本。
  5. 开发一个定制的计算机程序,以控制该OCM系统并执行测量。

2. 果蝇文化

  1. 标飞食品制作
    1. 放〜5毫升瞬间果蝇式成聚苯乙烯小瓶管纸槽的援助。
    2. 倒〜8毫升水入公式正确饱和的食物。
    3. 添加不同的添加剂的标准飞食品不同的实验。当全反式 -retinal(ATR)食品备战光遗传学实验起搏35,用吸管抽取100毫米ATR和溶入〜8毫升水进入食品1毫米的ATR浓度。该解决方案混合均匀后,将溶液倒入公式,并充分搅拌均匀。
    4. 用于在果蝇研究肥胖相关心脏功能障碍用15ml水在杯子和热制备高脂肪饮食,10,15组合〜10毫升式用于在微波炉30秒。把一些有机特级初榨椰子油在另一个杯子加热它在微波炉90秒。
    5. 提取7.5毫升椰子油和制得的式混合足以使椰子油的重量/体积比为食品〜30/100,和第烯提取物约2ml混合食物,并把它到管的底部。
    6. 等待1分钟,直到介质彻底饱和。仔细紧凑食品与一个平坦的表面,以优化果蝇的生活条件。添加6 - 酵母的8粒向制备的配方,并用棉的集群堵塞管。
  2. 果蝇十字架和文化
    1. 采取与标准的准备飞食品管,并取出堵塞棉花。小心转移成蝇(男性和女性)的管中,并立即用棉塞的管。检查棉花,以确保有棉花与管壁,防止蝇从管逸出之间没有间隙。
    2. 保持在孵化器的果蝇在25℃下进行杂交育种。大多数的基因被激活和细胞蛋白质在25℃下36-39合成。
    3. 就拿出来管从孵化后8手转移一个dult飞出管在年龄相仿的实验控制,以获得鸡蛋。
    4. 继续在25℃,这对于果蝇开发的8.5天40,41发展期的标准温度在孵化器中培养卵。
      注:温度会影响发育时期(卵到成虫)和各种基因的表达水平。

3.执行与OCM光学成像

  1. 飞山为幼虫光学成像
    注: 果蝇舱口22蛋- 24小时,在25℃至第一龄幼虫(L1)。接连24小时的第二龄幼虫出现。最大的幼虫形态是第三龄幼虫,这后约24小时换毛。在幼虫结构特征可用于区分其不同发育阶段。第一龄和第二龄之间的口器的大小是不同的。口第一龄幼虫的钩子都非常小,看起来像两个双很小的黑点,而第二龄幼虫的口钩较大,结构清晰。的气孔,通常用于识别第二龄期和第三龄。二龄幼虫有杵状前气孔,同时,第三龄,前气孔是支。深橙色圈将开始出现在第三龄幼虫后气门的一角。
    1. 应用一片双面胶带的到一个干净的显微镜载玻片。驱逐胶带下的气泡,以避免在成像期间由气泡引起的反射。
    2. 采取与在幼虫期培养的果蝇出从培养箱管中的一个。
    3. 确定幼虫在媒体,从媒体用软毛刷放于干净的纸巾将其删除。取下粘在幼虫任何食物用湿软刷和烘干的组织。
    4. 移动cleaneð飞至组织宽视场显微镜的物镜下。
    5. 调整显微镜的焦点,找到飞一个明确的说法。通过用显微镜其结构特征确定幼虫的右侧发育阶段。
    6. 用软毛刷飞的位置。确保身体直朝上以用于安装在由背侧载玻片制备背侧。执行显微镜下这一步。
    7. 确保幼虫是安装在磁带上之前完全干燥。否则,幼虫不会粘附到磁带上。
    8. 被定位飞背侧粘到与中等压力的载玻片双面胶带。需要注意的是压力太大可能会杀死苍蝇和过少的力量会导致成像过程中飞行运动。
  2. 在幼虫阶段(L2和L3)与OCM 果蝇的光学成像
    注:心脏管的广泛管腔可FOUND位于在幼虫阶段A5之间的段至A8( 图1)。横向OCM M模式图像(2D +时间)在所述心脏管的A7段获取的每个幼虫以促进收缩和舒张的分析。
    1. 放在一起向上面对物镜下方的背侧的y横向的OCM系统的可调节的试料台的安装幼虫。在样品台一个小孔是必要的放置幼虫,以避免其与阶段平面接触。
    2. 调整样品台移动水果的心脏管飞摄像光束的焦平面。要轻松找到A7段,发现心脏管与实时截OCM图像在图像采集软件后部区域。然后移动台向前直到A7段是可见的。
    3. 图像采集软件至100%B扫描的A扫描(帧),100 B扫描的设置参数,并且scanneř电压以覆盖〜0.28毫米在x横向,并在y横向方向0 V.点击软件的“开始”按钮通过用暗布阻断样品光束路径获取背景扣除背景噪声的数据。
      注:在100帧的3可以用于背景减除。
    4. 数据采集​​软件128每B扫描的A扫描,4096 B扫描,并且扫描仪电压的设定参数以覆盖〜0.28毫米在x横向,和0 V在y横向方向。点击软件的“开始”按钮在覆盖0.28点¯x0.57毫米2为约30秒的区域来获取整个飞心脏管的A7段横向M模式图像。
    5. 在数据保存过程中使用深色的布,以避免飞心脏的长时间暴露在成像光阻断成像光束。
    6. 重复测量5次获得心脏乐趣可靠的测量ction。
    7. 图像采集软件400每B扫描的A扫描,800 B扫描,并且扫描仪电压的设定参数以覆盖〜1.7毫米在x横向,和〜4毫米的y横向方向。移动台在两个方向,以确保整个果蝇可以成像。点击软件中的“开始”按钮,获得一个数据集,以获得3维果蝇的图像。注:3D飞行结构可以用阿米拉3D软件渲染
    8. 用湿柔软的刷子沾测量飞行,轻轻地从载玻片上删除。移动它转化为不断发展的独立管。在接下来的发展阶段标注管纵向研究。
  3. 图像在果蝇蛹的阶段
    注:所有果蝇取出从PD1到PD5成像。如在图1b中的幼虫概略所示,宽腔保持在A5至第的A8段Ë心脏管,直到PD1。从PD2,锥形腔开始A1之间发展到A4段。为了获得一致的图像和促进心脏分析,从该A7段在PD1得到横M模式图像,并且从A1段PD2后,如标示于图1b。
    1. 果蝇的图像在PD1
      注: 果蝇将有一个白puparium短时间窗口(0 - 1小时)PD1中。这个时间窗口是理想的,因为透明度高导致更高的光线穿透的OCM成像早期蛹进行光学成像。
      1. 作为果蝇在管壁上发现,当他们变得蛹,用湿软刷除去从各个管的蛹成像在PD1,并用刷子清洗蛹如果有粘在身体的食物。
      2. 安装在一个小的玻璃载玻片果蝇直接与湿刷和保持背侧朝上( 图1a
      3. 从蝇体侧面除去过量的水。
      4. 戴上OCM系统的样品台载玻片上,保持在顶部的果蝇。发现飞心脏利用在幼虫测量描述的相同策略的A7段清晰的实时图像。
      5. 设置数据采集软件相同的参数在3.2节和图像在A7段心跳收购横向M模式和3D图像。
      6. 成像后,使用镊子与蛹载玻片放回管的连续培养。
    2. 果蝇的图像在PD2到PD5阶段
      注:由于样品变为在蛹期越来越不透明,成像系统的穿透深度将减小。
      1. 使用镊子小心地将玻璃小号立德安装有在PD2从管用于成像的飞行。在PD2,试样壳变得微黄并与PD1( 图1)的身体变得不太透明。
      2. 把滑上该OCM系统的试料台。
      3. 调整样品台到飞移动到OCM系统的成象光束的焦平面。找到具有实时剖OCM图像的心脏管的前端。移动〜50微米回来后方向找到心脏管的A1段。
        注意:此时心脏发育(PD2)的,锥形腔将很小,可能无法跳动。
      4. 收集来自A1段使用相同的方法与以前的发育阶段横M模式的数据集,以及3D数据。
      5. 把滑回管仔细进行连续培养。
        注:在PD3,在外壳试样的颜色比在PD2阶段暗。在PD4阶段,黑色条纹CAN为样品的外壳内观察。有些苍蝇会发展到这一阶段第二天的成年人,而其他人将演变成PD5。在PD5阶段,黑色条纹甚至在果蝇更为明显看到。这些苍蝇将成为第二天的成年人。
  4. 图像在果蝇成虫期
    注:在成年阶段,雌性和雄蝇可以通过身体的大小和下腹部的颜色来区分。雌成虫有较大的尺寸,而男性更小,深色的小腹。
    1. 从孵化器采取管出来的时候,果蝇发育为成年,并转移成人飞到〜45毫升空瓶。
    2. 蘸棒的吸收端(约1厘米长,〜3毫米直径)插入麻醉,把棒到小瓶,并用棉的集群堵塞管保持麻醉结束正下方插入棉花和ANESthetize飞3分钟。麻醉的持续时间取决于飞的大小,并且可以2.5 3.5分钟之间,以改变(例如:2.5 3雄性分钟,女性或3.5分钟)。
    3. 准备用一块双面胶带的载玻片。
    4. 移动飞麻醉到载玻片与背侧朝上使用软毛刷。
    5. 单独使用镊子翅膀,并坚持在显微镜下磁带上的机翼固定飞和暴露心脏区域成像。
    6. 图像从蝇心脏的A1段飞( 图1)。在实验结束时,飞可能牺牲。

4.影像学分析16

  1. 开发Matlab的方案,以与所述图像采集软件将图像文件中收集的2D和3D的二进制文件转换。
  2. 使用ImageJ的,以确定在横向M型图像的心脏管区域和魔杖算法来创造心脏部位的EA面具每个横向M模式图像。段的掩蔽区域,并使用一个峰寻找算法来识别的收缩和舒张的位置。计算从横M模式图像的时间依赖的心脏直径变化。
  3. 基于所获取的时间相关的心脏的直径,计算出心脏参数如心率,心搏周期(CAP),舒张末期内径(EDD),收缩末期内径(ESD),舒张末期面积(EDA),并结束收缩期面积(欧空局)。计算短轴缩短率(FS)与式(1)
  4. 使用ImageJ的分析3D图像OCM可视化动态心脏的结构性发展。

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Representative Results

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纵向心脏成像用的是果蝇与24B-GAL4 / +在室温下用OCM应变进行。测量在L2,L3进行的,并在从PD1 8小时间隔PD4,和成人每天1(AD1)跟踪变态处理( 表1)。幼虫,早期蛹,晚蛹和成虫蝇被安装在中所见图1A的载玻片上。的心脏对幼虫和成虫蝇的段特征在图1B中示意性表示被示出。

在这一发展的研究中,4096架是在32秒,我们的定制OCM系统来跟踪果蝇的心跳收购。为了提高测量精度,取5重复测量每一试样在各个发育阶段。三维数据,也能够获得变态期间遵守心脏结构的变化。

横向M模式和3D图像为C reated定制MATLAB程序和ImageJ的。 烯面部图像和轴向切片也从所采集的数据构成果蝇变态( 图2)中可视化心脏的重塑过程。为了量化果蝇的心脏功能,心脏地区被使用自定义的Matlab程序所有4096帧自动分割。飞心脏速率(HR)可以从横M模式OCM图像进行量化( 3a)。在蛹的阶段, 果蝇心脏停止偶尔跳动16。我们引入了一个新的心脏功能参数,心脏的活动周期(CAP)来量化的期间以心跳的总成像时间的比率( 图3b)。 EDD,防静电,EDA,ESA和FS也被用来量化果蝇发育过程中的轴向和横向尺寸的心脏腔室的变化。 16

内容“>在幼虫阶段,心脏管开始在一个更广阔的管腔后腹部A8(A5 - 图1B A8),并在较窄直径(T3 / A1的前背段A1结束- A5在图1B )该心脏腔室位于内侧和背侧和L2( 图2的a,b)和L3( 图2 C期间越长越,d)所示 。在进入PD1后,观察在心脏管在一个移动的空气的顶部轴向地运行气泡( 图2,E,F)约10 - 13小时后,气泡后puparium形成消失,宽腔成为外翻由于前心脏管腹侧位于,整个心脏管是除了在后部区域不可见。 ,心脏的被淘汰( 图2 G,H)4 - OCM图像〜后puparium形成12小时后PD2时,心脏室逐渐沿背腹后部(A8 A6)对齐,2,43。锥形室开始研制〜A1 - PD2在A4段,在规模,直到成年阶段( 图2我-米 )。

除了观察结构变化,心肌重构过程中发现了许多功能上的改变也是如此。在图3所示的M模式图像表明,心跳减缓显著从幼虫期至蛹期,然后从蛹大幅增加至成年。生命周期( 图4a)中,观察显著心率变化。此外,心脏活动周期(CAP)中的分析对所有从L2测量AD1( 图4b)的样品。如在图4中所示,HR保持每分钟在约277次(BPM)为L2和L3。在进入早期蛹的阶段有人力资源和CAP显着下降。 HR在PD1的开始降低到86±11 BPM,并继续由电子降低至26±8 BPMPD1的次终于来到一个完全停止在PD2月初。一个有趣的发现是围绕PD2阶段观察心脏活动的延长期间(〜24小时-后puparium形成48小时),简称为心脏发育diastalsis 16。在PD2的结束,缓慢间歇打浆恢复(HR 17 BPM±6的CAP 5±2)。整个PD3和PD4,人力资源和CAP增加(开始蛹期后5天),直至在成年阶段的第一天达到392±32 BPM和95±3%。

图1
图1.在不同阶段与心变态的示意图果蝇的安装。 (一)幼虫,蛹的安装和成人WT(24B-GAL4 / +)苍蝇在载玻片上。 (二)心脏变态的示意图。在幼虫和成虫schemati红色箭头c表示直到PD1 24小时的OCM M型成像位置和随后的时间点,分别为。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2. 果蝇 心脏形态学变化。 恩脸和在(A,B)L2获得WT 果蝇的轴向截面OCM图像(C,D)L3(E,F)PD1(G,H)PD2(I,L)PD4(K,M)成人阶段。从A7段得到了果蝇的心脏M型图像,直到PD1和A1段的后期阶段。在连接面和轴向截面图像表示200微米和500微米,r处的比例尺espectively。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3. 果蝇 心脏功能的变化。 (一)在示出整个生命周期的HR变化不同发育阶段的M模式图像。 (二)证明的例子心脏活动期间(CAP)计算。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4
图4.心脏功能参数的定量分析S IN WT苍蝇在不同发育阶段,包括L2,L3,在8小时的时间间隔蛹的阶段,和AD1。 (一)。HR。 (二)CAP。每一组的误差条表示标准偏差。 请点击此处查看该图的放大版本。

发育阶段
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8小时 16小时 24小时 32小时 40小时 48小时 56小时 64小时 72小时 80小时 88小时
标本号 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

表1. WT果实数苍蝇在心脏发育研究中的不同发育阶段的测量。

视频1
视频1.心跳沿时间维度的跟踪和沿z方向(轴线方向)对应的心腔直径的变化在一WT苍蝇在L2上。该心脏是在一个稳定的速率跳动相对快。 请点击此处观看该视频。 (右键点击下载)。 p>

视频2
视频2.沿着时间维度心跳的跟踪和沿z方向(轴线方向)对应的心腔直径的变化在一WT苍蝇在PD1。人力资源开始减少。 请点击此处观看该视频。 (右键点击下载)。

视频3
视频3.沿着时间维度心跳的跟踪和沿z方向(轴向方向)对应的心腔直径的变化在一WT苍蝇在PD2。心脏停止了在该时间彻底击败。 z轴直径作图的振荡是由于成像噪声。目标=“_空白”>请点击这里观看该视频。 (右键点击下载)。

视频4
视频4.沿着时间维度心跳的跟踪和沿z方向(轴向方向)对应的心腔直径的变化在一WT苍蝇在PD4。 PD2后,人力资源和CAP开始加大。 请点击此处观看该视频。 (右键点击下载)。

视频5
视频5.沿着时间维度心跳的跟踪和沿z方向(轴向方向)对应的心腔直径的变化在一WT苍蝇在AD1。人力资源是所有阶段中最高和CAP几乎达100%。rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4“目标=”_空白“>请点击这里观看该视频。(右键点击下载)。

视频6
一个苍蝇幼虫的视频6. 3D渲染结构。 请点击此处观看该视频。 (右键点击下载)。

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Discussion

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果蝇的心跳加快,大约在幼虫和成虫期400 BPM最大的人力资源,需要很高的成像速度来解决心脏diastoles和心脏收缩(根据经验不低于80帧/秒)。由于小心脏腔室的尺寸和微米尺度心脏壁的厚度(5 - 10微米),高空间分辨率(大于2μm更好)所需的解决心脏管结构。在这项研究中,高分辨率和超高速OCM系统的开发,其中,使用了用600线/毫米透射光栅的分光计和2,048像素行扫描摄像机。 20千赫的A扫描速率是由行扫描相机提供。 128帧的帧速率/ sec是足够快,以捕获果蝇心跳在多个发育阶段,包括L2,L3,PD1,PD2,PD3,PD4,PD5,和成人。光源是一个宽的带宽的超连续光源的〜800 nm和一个中心波长和带宽〜220纳米分别获得了〜在组织1.3微米的轴向分辨率。 10倍的目标是在样品臂用来实现的〜3.9微米的横向分辨率。由于果蝇的心脏管背水面以下约200微米,需要几百微米米的成像深度。一名45°棒镜可以被用来生成一个环形样品光束和扩展聚焦深度在试样44。灵敏度和3分贝滚降被确定为96 dB和600微米,分别为〜9毫瓦的样品臂功率。一个自定义的计算机程序来控制OCM系统,并进行了测量。心脏结构的图像和获得的功能参数演示使用OCM来定量表征整个生命周期整体的心脏形态和功能果蝇的可行性。

目前,其它几种技术也可用于图像的小动物的心脏的结构或功能,诸如计算机断层扫描(CT),磁共振成像(MRI)和超声。 OCM提供比这些技术的时空分辨率更高,使精细结构,并在动物心脏快速动态可视化。共聚焦显微镜是另一种广泛使用的成像技术,但其成像低渗透和成像造影剂的限制征用活体动物及其应用。相比之下,OCM使高速和小动物快速可视化心脏动力学非侵入性的无标记成像。然而,仍然有OCM的局限性。例如,由OCM提供的成像深度由光散射限于从几百微米到约1毫米的组织,同时超声具有可达10厘米的穿透深度。相比共焦显微镜,OCM具有更高的速度和更好的成像深度,但具有较低的分辨率和分子较差的对比度。此外,我们目前的OCM系统BAsed的上谱域检测系统。根据扫频源OCM 45更高的成像速度可提供快速动态特性,如心跳更鲜明的图像。

为了执行在果蝇心跳与OCM的纵向研究中,也有在协议中的几个关键步骤。苍蝇必须在实验的所有阶段非常微妙处理。管理幼虫应特别温柔,因为它很容易损坏幼虫,这可能会影响心脏结构和功能在下面的发育阶段。苍蝇必须定位在盖玻璃和非常精确地成像阶段。不良定位蝇将使它难以获得高质量的图像,并可能导致偏斜结构和功能的心脏参数值。此外,转让的成人从一个管到另一个苍蝇和堵漏棉花球应该是非常快的,以防止他们逃跑从管。

在不同的研究果蝇心脏发育可以通过修改协议来执行。在该苍蝇培养温度可以增加或从25℃降低到改变心脏基因表达水平和改变飞发展期。通过加入一些成分,如椰子油或ATR的标准食物,心脏发育可以被改变。具体研究可以在野生型或转基因果蝇进行。当纵向研究果蝇心脏发育,不同的时间间隔可被用于执行该OCM测量,例如,一个8小时间隔可能在蛹阶段使用。由于我们的OCM系统的灵敏度有限,很多均匀斑点噪声在横向M模式图像,这使得难以正确地识别心脏收缩信号用Matlab程序和减少数据分析的效率被发现。灵敏度可以通过提高该OCM系统的对准而增加。优化的滤波算法建议以除去斑点的部分。

所描述的协议已被用于研究人体生理同源,dCryDCLOCK 果蝇诱发心脏缺陷的沉默。在不同发育阶段,包括幼虫,蛹和成虫15,16观察降低小时。在心脏发育节律基因的作用被揭露,这也许可以解释心血管疾病和生理节奏有关的活动模式之间的关联。还通过分析与HFD 15喂食果蝇心脏功能变化研究高脂饮食(HFD)引起的心脏疾病。这些研究证明,不仅果蝇作为心脏结构和功能的发育研究的有力工具,也是心脏纵向研究对理解先天和出生后的人类疾病的意义。该OCM平台将使一系列未来研究的我N基因相关的人类心脏疾病。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223, (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223, (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15, (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37, (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11, (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12, (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91, (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76, (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5, (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178, (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22, (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246, (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22, (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10, (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299, (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41, (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9, (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15, (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2, (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19, (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114, (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8, (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15, (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4, (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6, (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22, (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1, (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3, (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17, (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109, (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132, (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17, (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21, (15), 18021-18033 (2013).
<em>果蝇</em>的制备及心功能<em>体内</em>使用光学相干显微镜成像纵向(OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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