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Biology

ショウジョウバエの調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いてin vivoで心機能の縦イメージング(OCM)

doi: 10.3791/55002 Published: December 12, 2016

Introduction

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小動物における心臓の縦断研究では、このような遺伝子関連先天性心臓欠陥1,2のようなヒトの関連心血管疾患、各種の理解に貢献しています。過去数十年、このようなマウスを3,4、アフリカツメガエル5,6、ゼブラフィッシュ7,8、9、及びショウジョウバエ10-16などの様々な動物モデルにおいて研究に関連する人間の心臓の開発を行うために使用されています。マウスモデルは広く、正常と異常な心臓の開発とヒトの心臓3,4との類似性に起因する心臓の欠陥表現型を研究するために使用されています。アフリカツメガエル胚は、その取り扱い易さと半透明5,6に対する心臓の開発の研究に特に有用です。ゼブラフィッシュモデルの胚と早期の幼虫の透明性は、心臓の開発7,8の簡単な光学観察を可能にします。鳥類のモデルは、発達心臓研究の共通の課題であるbecaus電子心は簡単に卵の殻と人間9に鳥の心の形態学的類似性を除去した後にアクセスすることができます。 ショウジョウバエモデルは、心臓の長手方向の研究を行うために最適ですいくつかのユニークな機能を備えています。まず、 ショウジョウバエの心臓管は、心臓の光アクセスおよび観察のための利便性を提供し、背側表面下〜200μmで、です。さらに、多くの分子メカニズムと遺伝的経路は、ショウジョウバエと脊椎動物の間で保存されています。ヒトの疾患遺伝子の75%以上のオルソログは、それが広く、トランスジェニックの研究11,13で使用されてきたショウジョウバエで発見されました。また、短いライフサイクルと低メンテナンスコストを有し、そして一般に発生生物学研究14-16する試料モデルとして使用されています。

以前の報告は、彼のようなショウジョウバエの心臓機能を監視するためのプロトコルを記載しましたartbeat。しかし、解剖手順は17,18を必要とされました。光学イメージングは​​、非侵襲的性質のために、動物の心臓の開発を可視化するための効果的な方法を提供します。異なる光学イメージングモダリティは、二光子顕微鏡19、共焦点顕微鏡20,21、光学シート顕微鏡22、および光コヒーレンストモグラフィー(OCT)16,23-26ように、動物の心臓の研究を行う際に適用されています。比較的、OCTは高分解能と超イメージング速度を維持しながら、生きた動物を画像化するために重要である、造影剤を使用せずに、小動物の心臓に大きなイメージング深度を提供することができます。また、OCTシステムの開発の低コストの検体の光学的イメージングのためにこの技術を普及しています。 OCTは、正常ショウジョウバエの縦断的研究のために使用されてきました。 OCTを使用して、心臓の形態学的および機能イメージングは​​FUNC、心臓の構造を研究するために行われています的な遺伝子の役割、および心臓の開発中に、変異体モデルにおける心血管の欠陥のメカニズム。例えば、年齢依存心機能の低下は、10月27日とショウジョウバエのダウンレギュレーションアンジオテンシン変換酵素関連(ACER)遺伝子と確認されました。遺伝子関連心筋症の表現型は、10月28から33を使用して ショウジョウバエで実証されました。 OCTを用いた研究はまた、 ショウジョウバエ34の中心部にある人間SOX5遺伝子の機能的役割を明らかにしました 10月と比較すると、OCMは、より良い横方向の分解能を提供するために、より高い開口数対物レンズを使用しています。過去には、オルソログ人間の概日遺伝子dCry / DCLOCKのサイレンシングによって引き起こされる心臓機能障害は、肥満誘導されたヒトを理解するために、カスタムOCMシステム15,16と同様に、 ショウジョウバエにおける心筋症に高脂肪食の効果を用いて研究されてきました心疾患。 15

ここで、第電子実験プロトコルは、第二齢(L2)でのショウジョウバエの心臓の形態学的および機能的変化の縦断的研究、三齢(L3)、蛹1日目(PD1)、蛹2日目(PD2)、蛹の3日目(PD3)のために要約されています、蛹4日目、人間関係の先天性心疾患の研究を促進するためにOCMを使用して(PD4)、蛹5日目(PD5)、および成体( 図1)。このような人事やCAPなどの心臓機能パラメータは、定量的に心臓の開発機能を明らかにするために、異なる発達段階で分析しました。

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Protocol

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ショウジョウバエ 16の光イメージングのためのOCMシステムの作製

  1. OCMシステムは、 ショウジョウバエのハートビートを解決することができるようになりますので、少なくとも80フレーム/秒のフレームレートを提供する分光器と高速ラインスキャンカメラを選択します。
  2. ショウジョウバエの心臓構造を識別するために、2μmの軸方向の分解能を確保するために、広帯域光源を使用してください。
  3. 高横分解能を得るために10倍の対物レンズを使用してください。
  4. 基準アーム光を反射し、標本に焦点深度を拡張するために、環状サンプルアーム光ビームを生成するために45°ロッドミラーを使用します。
  5. OCMシステムを制御し、測定を実行するためのカスタムコンピュータプログラムを開発します。

2. ショウジョウバエ文化

  1. 標準的なフライ食品の準備
    1. ポリスチレンバイアルに〜5ミリリットルインスタントショウジョウバエ式を置きます給紙シュートの支援を受けてチューブ。
    2. 適切に食べ物を飽和させるために数式に〜8ミリリットルの水を注ぎます。
    3. 異なる実験のための標準的なフライ食品に異なるサプリメントを追加します。実験35をペーシング光遺伝学のためのオールトランスレチナール(ATR)食品の準備をすると、100 mMのATRを抽出し、食品中の1mMのATR濃度を得るために〜8ミリリットルの水に溶解するためにピペットを使用しています。溶液を均一に混合した後、式への溶液を注ぎ、十分にそれをかき混ぜます。
    4. 電子レンジで30秒間のカップと熱で15ミリリットルの水で〜10,15ミックス、ショウジョウバエの肥満関連心機能障害を研究するための10ミリリットルの式を、高脂肪食を準備します。いくつかの有機エキストラバージンココナッツオイルは、別のカップに入れて、電子レンジで90秒のためにそれを加熱します。
    5. 7.5ミリリットルココナッツオイルを抽出し、〜30/100食品にココナツ油の重量/体積比を作るために十分に準備された式と混合し、目エキス〜2ミリリットルエン混合食品やチューブの底にそれを置きます。
    6. 媒体が完全に飽和するまで1分間待ちます。 ショウジョウバエのための生活条件を最適化するために、平らな面で慎重に食品を圧縮。準備された式に酵母の8粒、および綿のクラスタでチューブを差し込む - 6を追加します。
  2. フルーツフライ十字架と文化
    1. 準備された標準的なフライ食品とチューブを取り、差し込ま綿を削除します。慎重にチューブに(オスとメス)大人のハエを転送し、すぐに綿でチューブを差し込みます。チューブからの脱出からハエを防ぐために、綿や管壁との間に隙間がないことを確認するために綿を確認してください。
    2. 交雑育種のために25℃のインキュベーターでショウジョウバエを保管してください。遺伝子の大部分が活性であり、細胞タンパク質を25℃で36〜39で合成されます。
    3. 8手の転送Aの後にインキュベーターからチューブを取り出しdultは、実験的な制御のための同様の年齢で卵を得るために、チューブの外に飛びます。
    4. 8.5日40,41の開発期間とショウジョウバエの開発のための標準的な温度である25℃、インキュベーターに卵を培養し続けます。
      注:温度が発育期間(大人への卵)と種々の遺伝子の発現レベルに影響を与えます。

3. OCMと光イメージングの実行

  1. 光イメージングのためのマウントフライ幼虫
    注:22 ショウジョウバエのハッチの卵- 1齢幼虫(L1)に25℃で24時間。第二齢幼虫は、別の24時間後に現れます。最大の幼虫の形は、約24時間後に脱皮3齢幼虫です。幼虫の構造的特性は、それらの異なる発達段階を区別するために使用することができます。第一齢と第二齢の間の口器の大きさが異なっています。口第二齢幼虫の口のフックが大きく、構造が明確になりつつ、第1齢幼虫のフックは、非常に小さく、小さな黒点の二対のように見えます。気門は、通常、二齢と三齢を識別するために使用されています。三齢のために、前方気門が分岐され、一方で第二齢幼虫は、前方気門をこん棒ました。濃いオレンジ色のリングは3齢幼虫における後部気門の先端に表示されるようになります。
    1. きれいな顕微鏡用スライドガラスに両面テープ片を適用します。撮像中の気泡によって引き起こされる反射を回避するためにテープの下に気泡を追い出します。
    2. 幼虫の段階でインキュベーターから培養ハエとチューブの1を取り出します。
    3. クリーンな組織上の柔らかいブラシと場所でメディアから削除し、メディアに幼虫を識別します。湿った柔らかいブラシで幼虫に付着した任意の食品を削除して、組織でそれを乾燥させます。
    4. cleaneを移動広視野顕微鏡の対物レンズの下の組織に飛ぶdは。
    5. ハエのクリアな視界を見つけるために、顕微鏡の焦点を調整します。顕微鏡でその構造的特徴によって幼虫の右の発達段階を識別します。
    6. 柔らかいブラシを使用してフライを置きます。体がまっすぐに背側と背側によりスライドガラス上に装着するための準備をするために上向きにされていることを確認。顕微鏡下で、この手順を実行します。
    7. 幼虫は、テープ上にマウントする前に完全に乾燥していることを確認してください。それ以外の場合は、幼虫がテープに付着しません。
    8. 適度な圧力でスライドガラス上に両面テープに位置付けフライの背側を貼り付けます。あまりにも多くの圧力がハエを殺すことが、あまりにも少し力が撮像中の動きを飛ぶためにつながることに注意してください。
  2. OCMと幼虫期(L2とL3)でのショウジョウバエの光イメージング
    注:心管の広い内腔はfoをすることができますウント幼虫の段階でA8にA5の間のセグメントに位置する( 図1)。横OCM Mモード画像(2次元+時間)が収縮期および拡張期の分析を容易にするために、それぞれの幼虫のための心臓チューブのA7セグメントで取得しました。
    1. 対物レンズの下に上向きに背側とy軸、横方向に沿ってOCMシステムの調整可能な試料ステージ上に取り付けられた幼虫を置きます。試料ステージに小さな穴がステージ面との接触を避けるために、幼虫を配置するために必要です。
    2. 結像ビームの焦点面にミバエの心管を移動する試料ステージを調整します。簡単A7セグメントを見つけるには、リアルタイムの画像取得ソフトウェアにおける断面OCM画像と心管の後部領域を見つけます。 A7セグメントが表示されるまで、次に前方にステージを移動します。
    3. セットB-1スキャンあたり100 A-スキャン(フレーム)、100 B-スキャンする画像取得ソフトウェアのパラメータ、およびscanneR電圧〜0.28、X横方向にミリメートル、及びY横方向に0 Vをカバーします。暗い布でサンプルビーム経路を遮断することによってバックグラウンド除去のためのバックグラウンドノイズデータを取得するソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。
      注:100のフレーム3は、バックグラウンド減算のために使用することができます。
    4. 〜のx横方向に0.28ミリメートル、およびy横方向に0 VをカバーするためにB-1スキャンあたり128 A-スキャン、4096 B-スキャン、スキャナ電圧にデータ収集ソフトウェアのパラメータを設定します。約30秒間0.28 X 0.57ミリメートル2をカバーする領域の上にフライ心管のA7セグメント全体の横Mモード画像を取得するソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。
    5. 撮像光にフライ心臓の長時間暴露を避けるために、データ退避処理中に暗い布を用いた撮像光を遮断します。
    6. 心の楽しみの信頼性の高い測定を得るために、5回の測定を繰り返しますction。
    7. X-横方向に〜1.7ミリメートル、およびy横方向に〜4ミリメートルをカバーするためにB-1スキャンあたり400 A-スキャン、800 B-スキャン、スキャナ電圧に対する画像取得ソフトウェアのパラメータを設定します。全体のミバエを画像化することができる保証するために、両方の方向にステージを移動します。 3次元でショウジョウバエの画像を得るために、1つのデータセットを取得するために、ソフトウェアで「スタート」ボタンをクリックします。注:3Dフライ構造はアミラ3Dソフトウェアを使用してレンダリングすることができ
    8. 測定されたフライを湿らせ、ゆっくりとガラススライドから削除するには湿った柔らかいブラシを使用してください。継続的な発展のために別のチューブにそれを移動します。次の発達段階を経て縦断的研究のためのチューブにラベルを付けます。
  3. 画像ショウジョウバエ蛹の段階で
    注:すべてのミバエはPD1からPD5のイメージングのために取り出しました。 図1bにおける幼虫の概略図に示されるように、広範な管腔は番目のA8セグメントにA5に留まりますPD1までの電子の心管。 PD2からは、円錐形のチャンバは、A4サイズのセグメントにA1の間に開発を開始します。一貫性のある画像を取得し、心臓の分析を容易にするために、横Mモード画像は、 図1bにマークされたように、PD2後PD1でA7セグメントから、およびA1セグメントから得ました。
    1. PD1の画像ショウジョウバエ
      注: - PD1中(1時間0) ショウジョウバエは、短い時間枠の白蛹殻を持つことになります。この時間ウィンドウは、高い透明性がOCMイメージングのために、より高い光の浸透につながるため早期蛹の光学イメージングを行うための理想的です。
      1. 彼らは蛹になるとミバエが管壁に見られるように、濡れた柔らかいブラシでPD1での撮像のために個々のチューブから蛹を削除し、体に付着した食品がある場合はブラシで蛹を清掃してください。
      2. 直接濡れたブラシで、小さなガラススライド上のミバエをマウントし、上向きに背側を保つ( 図1a
      3. フライ本体の側面から過剰な水を除去します。
      4. 上にミバエを保ち、OCMシステムの試料ステージ上にスライドガラスを置きます。幼虫の測定で説明したのと同じ戦略を用いたフライ心のA7セグメントの明確なリアルタイム画像を検索します。
      5. セクション3.2のようにデータ収集ソフトウェアの同じパラメータを設定し、画像A7セグメントでのハートビートが横Mモードと3D画像を取得します。
      6. 撮影後、戻って連続培養用チューブに蛹とガラススライドを配置するためにピンセットを使用しています。
    2. PD2で画像ショウジョウバエ PD5ステージへ
      注:試料は蛹段階ますます不透明になるので、イメージングシステムの侵入深さが低減されます。
      1. 慎重にガラス秒を削除するには、ピンセットを使用して、ライドは、イメージングのための管からのPD2でフライを搭載しました。 PD2では、試料の殻、黄色になり、体がPD1( 図1)に比べて少なく透明になります。
      2. OCMシステムの試料ステージ上にスライドを置きます。
      3. OCMシステムの結像ビームの焦点面にハエを移動する試料ステージを調整します。リアルタイムの断面OCM画像と心管の前端を検索します。心管のA1セグメントを見つけるために戻って後方に〜50ミクロンを移動します。
        注:心臓の開発(PD2)のこの時点では、円錐形のチャンバは非常に小さくなり、暴行することはできません。
      4. 以前の発達段階と同様の方法を用いて、横方向のA1セグメントからMモードデータセットだけでなく、3Dデータを収集します。
      5. 連続培養のために慎重に戻ってチューブにスライドを置きます。
        注:PD3では、シェル内の試料の色は、PD2の段階ではそれよりも暗いです。 PD4の段階では、ブラックストライプは、CAn個の標本の殻の内側に観察すること。他の人がPD5に進化する一方、いくつかのハエは、次の日のこの段階から大人へと発展します。 PD5の段階では、ブラックストライプがさらに明らかにショウジョウバエで見られています。これらのハエは、次の日に大人になるだろう。
  4. 大人の段階での画像ショウジョウバエ
    注:大人の段階では、女性と男性のハエは、体の大きさや下腹部の色で区別することができます。男性は小さく、暗い色の下腹部にある間、女性の大人は、より大きなサイズを有します。
    1. ミバエが大人に発展するときにインキュベーターからチューブを取り出し、そして大人が〜45ミリリットル空のバイアルに飛ぶ移します。
    2. 、麻酔にワンドの吸収性終わり(〜1cmの長さは、〜3ミリメートルの直径)を浸しバイアルに杖を入れ、ちょうど差し込ま綿の下とに麻酔終わりを維持するために綿のクラスタでチューブを差し込みますanes3分間フライをthetize。麻酔の持続時間は、ハエの大きさに依存し、(例:2.5分間のオス、3または3.5分間メス)2.5〜3.5分の間で変化してもよいです。
    3. 両面テープの切れ端でスライドガラスを準備します。
    4. 背側を上に向け、柔らかいブラシを使用してスライドガラス上に麻酔ハエを移動します。
    5. ピンセットを使って翼を分離し、フライを修正し、イメージングのための心臓領域を露出するために、顕微鏡下でテープに翼を貼り付けます。
    6. 画像フライ心のA1セグメントからフライ( 図1)。実験の終了時に、フライを屠殺してもよいです。

4.イメージング解析16

  1. 画像ファイルへの画像取得ソフトウェアを用いて収集2Dと3Dのバイナリファイルを変換するためにMatlabのプログラムを開発します。
  2. クリートする横Mモード画像における心臓管領域と魔法の杖アルゴリズムを識別するためのImageJを使用して、各横Mモード画像用の心臓領域のEAマスク。セグメントマスクされた領域と収縮期および拡張期の位置を識別するために、ピーク発見アルゴリズムを使用しています。横Mモード画像から時間依存心径の変化を計算します。
  3. 取得した時刻依存心の直径に基づいて、このようなHR、心臓活動期間(CAP)、拡張末期径(EDD)、収縮末期径(ESD)、拡張末期面積(EDA)などの心臓パラメータを計算し、(収縮期面積を終了ESA)。短縮率(FS)とを計算します式(1)
  4. フライ心臓の構造的な発展を可視化するために、3D OCMの画像を分析するためのImageJを使用してください。

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Representative Results

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縦心臓イメージングは​​、OCMを用いて室温で24B-GAL4 / +株とショウジョウバエを用いて行きました。測定は、変態処理( 表1)を追跡するためにL2、L3であり、PD1からPD4に8時間間隔、及び成人1日目(AD1)で行いました。幼虫、早期蛹、後半蛹および成人のハエは、 図1Aに見られるようなガラススライド上にマウントしました。幼虫と大人のハエのための心のセグメントの特徴は、図1Bの概略図に示しました。

この発達研究では、4096フレームは、ショウジョウバエのハートビートを追跡するために、当社独自のOCMシステムと32秒で取得しました。測定精度を向上させるために、5反復測定は、各発達段階における各検体のために採取しました。 3Dデータは、変態の間に心臓構造の変化を観察するために得ることができます。

横Mモード及び3D画像は、CでしたカスタムMatlabのプログラムとImageJのでreated。 画像と軸部エンショウジョウバエ変態( 図2)の間の心臓のリモデリングプロセスを視覚化するために取得したデータから構築しました。ショウジョウバエの心臓機能を定量化するために、心臓領域は、自動的にすべての4096フレームからカスタムMatlabのプログラムを使用してセグメント化されました。フライ心拍数(HR)は、横MモードOCM画像から定量化することができる( 3a)。蛹段階では、 ショウジョウバエの心臓は時折16を破っ停止します。私たちは、総撮影時間( 図3b)にハートビートと期間の割合を定量化するために、新しい心臓機能パラメータ、心臓活動期間(CAP)を導入しました。 EDDは、ESD、EDA、ESA、及びFSはまた、 ショウジョウバエの開発中に、軸方向及び横方向の両方の次元における心腔の変化を定量化するために使用しました。 16

幼虫の段階でコンテンツ">、心管は、より広範なルーメン(A5 - 図1BのA8)と後部腹部A8で始まり、狭い直径(T3 / A1で前方背側セグメントA1で終了- 図1BでA5 )。心室が内側と背側に位置し、L2( 図2中に大きな成長した、b)およびL3( 図2 C、D)。PD1を入力した後、心管を移動する空気の上に軸方向に動作して観察されましたバブル( 図2 E、F)アラウンド10 - 。13時間後、気泡が蛹殻形成後消失し、前方の心管が腹側に位置していたのでなったが、裏返し広い内腔は、心臓全体のチューブは、内後部領域を除いて見えませんでした。 OCMの画像は〜蛹殻形成後12時間は、その後PD2の間、心室が徐々に背側腹部に沿って整列し、後部(A6 - A8)。心臓の排除された( 図2グラム、h)の 42,43。円錐形のチャンバーは〜A1開発に着手- PD2の間にA4のセグメントをし、大人のステージ( 図2 I -メートル )までのサイズに成長しました。

構造的な変化を観察する以外にも、多くの機能的な変化は心臓リモデリングの際にも同様に発見されました。 図3に示すMモード画像は、ハートビートが蛹に幼虫期から大幅に減速し、その後、大人にサナギから大幅に増加することを示しています。有意なHRの変化は、ライフサイクル( 図4a)の間に観察されました。さらに、心臓活動期間(CAP)は、AD1( 図4b)にL2から測定された全ての検体について分析しました。 図4に示すように、HRは、L2とL3のための分(BPM)あたり〜277拍で保持しています。早期蛹の段階に入るとHRとCAPの著しい減少があります。 HRは、PD1の開始時に86±11 BPMに減少し、eで26±8拍まで減少し続けますPD1のNDは、最終的には初期のPD2で完全に停止してきます。興味深い発見がPD2のステージの周りに認められ、心臓の非アクティブ(〜24時間-蛹殻形成後48時間)の延長期間である、心臓発達波状蠕動16と呼ばれます。 PD2の終わりに、ゆっくりと断続的な鼓動は(CAP 5±2と6±HR 17 BPM)を再開します。 PD3とPD4、HRとCAPの増加、成人期の初日で392±32 BPMと95±3%に達するまで(5日後に蛹を開始する)を通じて、。

図1
図1.さまざまな段階でショウジョウバエの取付け・ハート変態の略図。 (a)の幼虫、蛹の取り付け、および成体WT(24B-GAL4 / +)は、スライドガラス上に飛びます。 (b)は、心臓の変態の概略図。幼虫と大人の上の赤い矢印schematiC PD1 24時間まで、それぞれ次の時間点のためにOCM Mモード画像の位置を示します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図2
2. ショウジョウバエの 心臓形態変化を 及び(b)は、L2で得られたWT ショウジョウバエの軸方向断面OCM画像(C、D)、L3(E、F)PD1(G、H)、PD2(I、L)PD4及び(K、M)成人エンステージ。 ショウジョウバエの心臓のMモード画像は、PD1まで後期ためA1セグメントからA7セグメントから得ました。 とアキシャル断面画像が200μmから500μm、Rを表し、 途中でスケールバーespectively。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図3
3. ショウジョウバエ ハートの機能の変更 (a)は、ライフサイクル全体のHRの変化を示す異なる発達段階でのMモード画像。 (b)は 、心臓の活動期間(CAP)の計算を実証する例。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

図4
機能性心臓パラメータの図4.定量分析WT中のSは、L2、L3、8時間の間隔で蛹ステージ、およびAD1などの異なる発生段階、でハエ。 (a)は、HR。 (b)の CAP。各グループのエラーバーは標準偏差を表します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。

発達段階
L2 L3 PD1 PD2 PD3 PD4 AD1
8時間 16時間 24時間 32時間 40時間 48時間 56時間 64時間 72時間 80時間 88時間
標本数 21 17 13 19 19 19 19 19 19 18 17 18 9 25

心臓発達研究では様々な発達段階で測定WTのミバエの表1数。

ビデオ1
WTにおける時間的次元に沿ったハートビートのビデオ1.追跡およびZ方向(軸方向)に沿って対応するハート商工会議所の直径変化は、L2で飛びます。心が安定した速度で相対的な高速を破りました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには、右クリックします。) P>

動画2
WTにおける時間次元に沿ってハートビートのビデオ2.トラッキングおよびZ方向(軸方向)に沿って対応するハート商工会議所の直径変化は、PD1で飛びます。 HRが減少し始めました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには、右クリックします。)

ビデオ3
WTにおける時間次元に沿ってハートビートのビデオ3.追跡およびZ方向(軸方向)に沿って対応するハート商工会議所の直径変化は、PD2で飛びます。心は時間の間に完全に破って停止しました。プロットのz-直径の振動は、撮像ノイズによるものでした。ターゲット= "_空白">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには、右クリックします。)

ビデオ4
WTにおける時間次元に沿ってハートビートのビデオ4.追跡およびZ方向(軸方向)に沿って対応するハート商工会議所の直径変化は、PD4で飛びます。 PD2後、HRおよびCAPが増加し始めました。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには、右クリックします。)

ビデオ5
AD1でのWTフライで時間次元に沿ってハートビートのビデオ5.トラッキングおよびZ方向(軸方向)に沿って対応するハート商工会議所の直径変化。 HRは、すべてのステージの中で最高だったとCAPはほぼ100%でした。rce.jove.com/files/ftp_upload/55002/video5.mp4 "ターゲット=" _空白 ">このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。(ダウンロードするには、右クリックします。)

ビデオ6
幼虫ハエのビデオ6. 3D構造のレンダリング。 このビデオを見るにはこちらをクリックしてください。 (ダウンロードするには、右クリックします。)

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Discussion

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幼虫と大人の段階で400 bpmの周り最大HRとショウジョウバエの急速な心拍は、心臓diastolesとsystoles(経験に基づいていない未満80フレーム/秒)を解決するために、高い描画速度を必要とします。小さい心腔サイズおよびミクロンスケールの心臓壁の厚さ(5 - 10μm)を、高い空間分解能(2マイクロメートルよりも良好な)心管構造を解決するために必要とされます。本研究では、高解像度、超高速OCMシステムは、格子600本/ mmの送信と分光器と2048ピクセルのラインスキャンカメラを使用した場合に、開発されました。 20キロヘルツのAスキャン速度は、ラインスキャンカメラによって提供されます。 128フレーム/秒のフレームレートは、L2、L3、PD1、PD2、PD3、PD4、PD5、および成人を含む複数の発達段階、でショウジョウバエのハートビートをキャプチャするのに十分高速です。光源は〜800nmでの中心波長および帯域幅を持つ広帯域スーパーコンティニューム光源だったと〜220それぞれnmおよび組織における〜1.3ミクロンの距離分解能を得ました。 10倍の対物レンズは、3.9ミクロン〜の横断方向の分解能を実現するために、サンプルアームにおいて使用しました。 ショウジョウバエの心管は約200μmの背側表面の下にあるので、ミクロンの数百メートルのイメージング深さが必要です。 45°ロッドミラーは、環状サンプルビームを生成し、試料44に焦点深度を拡張するために利用することができます。感度との3dBロールオフはそれぞれ〜9ミリワットのサンプルアームパワーで96 dBから600μmであることが決定されました。カスタムコンピュータプログラムは、OCMシステムを制御し、測定を行うために使用されました。心臓の構造的なイメージと得られた機能のパラメータを定量的にそのライフサイクル全体を通じて、ショウジョウバエの心臓の形態と機能を特徴づけるためにOCMを使用することの実現可能性を実証します。

現在、いくつかの他の技術は、画像に小さなを使用しています動物の心臓の構造または機能、例えば、コンピュータ断層撮影(CT)、磁気共鳴イメージング(MRI)、および超音波など。 OCMは、動物の心の中に微細構造と高速ダイナミクスの可視化を可能にする、これらの技術よりも高い空間と時間分解能を提供します。共焦点顕微鏡は、他の広く使用されている撮像技術であるが、その低いイメージングの浸透とイメージング造影剤の依頼が生きている動物で、そのアプリケーションを制限します。比較的、OCMは、高速かつ小型の動物で非侵襲的に速い心臓動態を可視化するためのラベルフリーイメージングを可能にします。しかし、まだOCMの制限があります。超音波は、最大10cmの侵入深さを有している、例えば、OCMによって提供される画像化深度は、組織内に約1mmに数百ミクロンからの光散乱によって制限されます。共焦点顕微鏡と比較すると、OCMは、より高速、より良いイメージング深さを持っていますが、低解像度と貧しい分子コントラスト。また、私たちの現在のOCMシステムはBAですスペクトル領域の検出システムでのsed。 OCM 45スウェプトソースに基づいて、より高いイメージング速度は、ハートビートのような急速なダイナミクスのより明確なイメージを提供することができます。

OCMとショウジョウバエのハートビートの縦断的研究を行うために、プロトコルのいくつかの重要なステップがあります。ハエは、実験のすべての段階で非常に繊細に扱わなければなりません。幼虫を損傷することが容易であるため、幼虫の管理には、次の発達段階で、心臓の構造と機能に影響を与える可能性があり、特に穏やかでなければなりません。ハエが非常に正確にカバーガラスと撮像ステージ上に配置する必要があります。不完全に配置ハエは、それが困難な品質の画像を取得し、スキュー構造的および機能的心臓パラメータ値を引き起こす可能性があるでしょう。また、別の管から大人のハエを転送し、コットンボールを差し込むと、チューブから自分の漏れを防止することは非常に高速である必要があります。

上の異なる研究ショウジョウバエの心臓発生は、プロトコルを変更することによって行うことができます。ハエが培養される温度を増加または心臓遺伝子の発現レベルを変化させ、フライ開発期間を変更するために25°Cから減少させることができます。標準的な食品にそのようなヤシ油又はATRのようないくつかの成分を添加することにより、心臓の発達を変更することができます。特定の研究では、野生型またはトランスジェニックハエで行うことができます。長手方向に果実ハエ心臓発生を研究する際に、異なる時間間隔は、例えば、OCMの測定を実行するために使用することができ、8時間の間隔は、蛹の段階で使用することができます。我々のOCMシステムの制限された感度のために、均一なスペックルノイズの多くは、それが困難な正確MATLABプログラムを用いて心臓の収縮信号を識別し、データ解析の効率を低下させるために行うことができ、横方向Mモード画像に見られます。感度は、OCMシステムの位置合わせを改善することによって増加させることができます。最適化されたフィルタリングアルゴリズムスペックルの一部を除去することをお勧めします。

記載されているプロトコルは、人間のサーカディアンオルソログ、 ショウジョウバエdCryDCLOCK誘発された心臓の欠陥の沈黙を研究するために適用されています。 HRは、幼虫、さなぎ、および成体15,16を含む、異なる発達段階で観察された減少しました。心臓発生における概日遺伝子の役割は、心血管障害および概日リズム関連の活動パターンとの間の関連を説明する可能性がある、明らかになりました。高脂肪食(HFD)誘発性心疾患はまたHFD 15に供給されたショウジョウバエの心臓機能の変化を分析することにより検討しました。これらの研究は、心臓の構造と機能の発達研究における強力なツールだけでなく、先天性および出生後のヒトの疾患を理解する上で心臓縦断研究の意義としてだけでなく、 ショウジョウバエを実証しました。 OCMプラットフォームは、私は今後の研究の広い範囲を可能にしますn個の遺伝子はヒト心疾患に関連します。

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
Custom OCM imaging system Developed in our lab
my Temp Mini Digital Incubator Benchmark H2200-HC
Cover glass AmScope 200PCS
Cotton Ball RITE AID
Instant Drosophila Formula CAROLINA formula 4-24
Yeast ActiveDry
Microscope SONY WILD M420
Brush Loew-Cornell 245B being used to move specimens
Labview software National Instruments
ImageJ National Institutes of Health
Matlab Mathworks
Tweezer Wiha AA SA to fix the fruit fly wings
FlyNap Carolina Biological Supply Company 4,224,898
Scotch Permanent Double Sided Tape, 3 M Scotch
Pipette Fisherbrand MU18837
Organic Extra Coconut Oil Spring Valley 13183
Microscope Slide CapitolBrand M3504-E
Drosophila Vials SEOH 8401SS
All-trans-retinal Sigma-Aldrich Co. R2500

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References

  1. Liberatore, C. M., Searcy-Schrick, R. D., Yutzey, K. E. Ventricular expression of tbx5 inhibits normal heart chamber development. Dev. Biol. 223, (1), 169-180 (2000).
  2. Christoffels, V. M., et al. Chamber formation and morphogenesis in the developing mammalian heart. Dev. Biol. 223, (2), 266-278 (2000).
  3. Wessels, A., Sedmera, D. Developmental anatomy of the heart: a tale of mice and man. Physiol. Genomics. 15, (3), 165-176 (2003).
  4. Savolainen, S. M., Foley, J. F., Elmore, S. A. Histology atlas of the developing mouse heart with emphasis on E11.5 to E18.5. Toxicol. Pathol. 37, (4), 395-414 (2009).
  5. Yang, V. X. D., et al. High speed, wide velocity dynamic range Doppler optical coherence tomography (Part II): Imaging in vivo cardiac dynamics of Xenopus laevis. Opt. Express. 11, (14), 1650-1658 (2003).
  6. Yelin, R., et al. Multimodality optical imaging of embryonic heart microstructure. J. Biomed. Opt. 12, (6), 064021 (2007).
  7. Bakkers, J. Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease. Cardiovasc. Res. 91, (2), 279-288 (2011).
  8. Staudt, D., Stainier, D. Uncovering the molecular and cellular mechanisms of heart development using the zebrafish. Annu. Rev. Genet. 46, 397-418 (2012).
  9. Drake, V. J., Koprowski, S. L., Lough, J. W., Smith, S. M. Gastrulating chick embryo as a model for evaluating teratogenicity: a comparison of three approaches. Birth Defects Res. A. 76, (1), 66-71 (2006).
  10. Birse, R. T., et al. High-fat-diet-induced obesity and heart dysfunction are regulated by the TOR pathway in Drosophila. Cell Metab. 12, (5), 533-544 (2010).
  11. Bodmer, R. Heart development in Drosophila and its relationship to vertebrates. Trends in Cardiovas. Med. 5, (1), 21-28 (1995).
  12. Harvey, R. P. Nk-2homeobox genes and heart development. Dev. Biol. 178, (2), 203-216 (1996).
  13. Bodmer, R., Venkatesh, T. V. Heart development in Drosophila and vertebrates: conservation of molecular mechanisms. Dev Genet. 22, (3), 181-186 (1998).
  14. Cripps, R. M., Olson, E. N. Control of cardiac development by an evolutionarily conserved transcriptional network. Dev. Biol. 246, (1), 14-28 (2002).
  15. Men, J., et al. Optical coherence tomography for brain imaging and developmental biology. J. Sel. Top. Quantum Electron. 22, (4), 6803213 (2016).
  16. Alex, A., et al. A circadian clock gene, Cry, affects heart morphogenesis and function in Drosophila as revealed by optical coherence microscopy. PloS one. 10, (9), e0137236 (2015).
  17. Vogler, G., Ocorr, K. Visualizing the beating heart in Drosophila. J Vis Exp. (31), e1425 (2009).
  18. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. J Vis Exp. (33), e1425 (2009).
  19. Yalcin, H. C., et al. Two-photon microscopy-guided femtosecond-laser photoablation of avian cardiogenesis: noninvasive creation of localized heart defects. Am. J. Physiol. Heart C. 299, (5), H1728-H1735 (2010).
  20. Dolber, P. C., Spach, M. S. Conventional and confocal fluorescence microscopy of collagen fibers in the heart. J. Histochem. Cytochem. 41, (3), 465-469 (1993).
  21. Mao, H., Gribble, M., Pertsov, A. M., Wang, L., Shi, P. Understanding embryonic heart morphogenesis through automatic segmentation and confocal imaging with optical clearing. ISBI. 1303-1306 (2014).
  22. Bouchard, M. B., et al. Swept confocally-aligned planar excitation (SCAPE) microscopy for high-speed volumetric imaging of behaving organisms. Nat. Photonics. 9, (2), 113-119 (2015).
  23. Boppart, S. A., et al. Noninvasive assessment of the developing Xenopus cardiovascular system using optical coherence tomography. Proc. Natl. Acad. Sci. 94, (9), 4256-4261 (1997).
  24. Kagemann, L., et al. Repeated, noninvasive, high resolution spectral domain optical coherence tomography imaging of zebrafish embryos. Molecular Vision. 14, 2157-2170 (2008).
  25. Jenkins, M. W., et al. Ultrahigh-speed optical coherence tomography imaging and visualization of the embryonic avian heart using a buffered Fourier Domain Mode Locked laser. Opt. Express. 15, (10), 6251-6267 (2007).
  26. Larin, K. V., Larina, I. V., Liebling, M., Dickinson, M. E. Live imaging of early developmental processes in mammalian embryos with optical coherence tomography. J. Innov. Opt. Health Sci. 2, (03), 253-259 (2009).
  27. Liao, F. -T., Chang, C. -Y., Su, M. -T., Kuo, W. -C. Necessity of angiotensin-converting enzyme-related gene for cardiac functions and longevity of Drosophila melanogaster assessed by optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 19, (1), 011014 (2014).
  28. Wolf, M. J., et al. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 103, (5), 1394-1399 (2006).
  29. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114, (2), e35-e36 (2006).
  30. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer's disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Curr. Alzheimer Res. 8, (3), 313 (2011).
  31. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B., Tearney, G. J. Heart wall velocimetry and exogenous contrast-based cardiac flow imaging in Drosophila melanogaster using Doppler optical coherence tomography. J. Biomed. Opt. 15, (5), 056020 (2010).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Dis. Model. Mech. 4, (3), 411-420 (2011).
  33. Tsai, M. T., et al. Noninvasive imaging of heart chamber in Drosophila with dual-beam optical coherence tomography. J. Biophotonics. 6, (9), 708-717 (2013).
  34. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Hum. Mol. Genet. 22, (18), 3798-3806 (2013).
  35. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Sci. Adv. 1, (9), e1500639 (2015).
  36. Mirault, M. E., Goldschmidt-Clermont, M., Moran, L., Arrigo, A. P., Tissieres, A. The effect of heat shock on gene expression in Drosophila melanogaster. IEEE T. Med. Imaging. 42, 819-827 (1978).
  37. Boothroyd, C. E., Wijnen, H., Naef, F., Saez, L., Young, M. W. Integration of Light and Temperature in the Regulation of Circadian Gene Expression in Drosophila. PLoS Genet. 3, (4), (2007).
  38. McGuire, S. E., Roman, G., Davis, R. L. Gene expression systems in Drosophila: a synthesis of time and space. Trends Genet. 20, (8), 384-391 (2004).
  39. Ashburner, M., Bonner, J. J. The induction of gene activity in drosophila by heat shock. Cell. 17, (2), 241-254 (1979).
  40. Ashburner, M., Thompson, J. N. Jr Laboratory culture of Drosophila. 2a, Academic Press. London. 1-109 (1978).
  41. Ashburner, M. Drosophila: a laboratory handbook. Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1978).
  42. Molina, M. R., Ostia Cripps, R. M. the inflow tracts of the Drosophila heart, develop from a genetically distinct subset of cardial cells. Mech. Dev. 109, (1), 51-59 (2001).
  43. Monier, B., Astier, M., Sémériva, M., Perrin, L. Steroid-dependent modification of Hox function drives myocyte reprogramming in the Drosophila heart. Development. 132, (23), 5283-5293 (2005).
  44. Liu, L., et al. Imaging the subcellular structure of human coronary atherosclerosis using micro-optical coherence tomography. Nat. Med. 17, (8), 1010-1014 (2011).
  45. Ahsen, O. O., et al. Swept source optical coherence microscopy using a 1310 nm VCSEL light source. Opt. Express. 21, (15), 18021-18033 (2013).
<em>ショウジョウバエ</em>の調製と光コヒーレンス顕微鏡を用いて<em>in vivoで</em>心機能の縦イメージング(OCM)
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Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).More

Men, J., Jerwick, J., Wu, P., Chen, M., Alex, A., Ma, Y., Tanzi, R. E., Li, A., Zhou, C. Drosophila Preparation and Longitudinal Imaging of Heart Function In Vivo Using Optical Coherence Microscopy (OCM). J. Vis. Exp. (118), e55002, doi:10.3791/55002 (2016).

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