Summary
Denne fremgangsmåde anvender zebrafisk embryoner til effektivt teste den vaskulære invasive evne af cancerceller. Fluorescerende cancerceller injiceres i præcardielt sinus eller blommesæk af fostre. Cancercelle vaskulær invasion og ekstravasation vurderes via fluorescensmikroskopi af halen område 24 til 96 timer senere.
Introduction
Metastatisk sygdom er en væsentlig årsag til kræft dødelighed og mange mekanismer, som sætter celle formidling kræft mangler at blive opdaget 1. For at en kræftcelle med succes metastaserer, skal det først invadere gennem stroma, der omgiver en primær tumor, indtaste (intravasate) i kredsløbssygdomme, overleve i transit, exit (ekstravasatet) fra kredsløbet, og endelig etablere en levedygtig koloni ved den fjerne orgel site 2. Intravasation og ekstravasation er således afgørende skridt i den metastatiske kaskade, men hver kræftcelle er ikke i sig selv dygtige til at forstyrre og migrerer gennem endotel vejkryds 3. I virkeligheden er der en række unikke selektionstryk, der omgiver cancercelle vaskulær invasion og fremgangsmåden kan yderligere påvirkes af en række forskellige endogene og exogene 4 faktorer. Af disse grunde, teknikker, sonde den aggressive adfærd fremskreden kræft fokuserer ofte på vascular invasiv evne som et middel til at forudsige metastatisk spredning.
Forskellige modelsystemer eksisterer for at lette undersøgelsen af kræftcellen vaskulær invasion in vitro. Den mest anvendte in vitro assays involverer enten transwell systemer til vurdering kræft cellemigrering gennem en endothelial barriere 5 eller Electric Cell-Substrat Impedans Sensing (ECIS) teknologi til at overvåge realtid afbrydelse af et intakt endotel monolag af kræftceller 6. Disse assays typisk mangler de fluide dynamik og stromale faktorer, som ellers ville påvirke cancercelle fastgørelse til en endothelial væg. Dette spørgsmål er noget omgås ved perfusable vaskulære netværk, der opstår fra 3D-kultur af endotel med støtte stromale celler, og disse 3D mikrofluide systemer nu repræsenterer forkant med de nuværende in vitro optioner 7,8. Stadig, disse tilgange udelade den robuste mikromiljø af et funktionelt kredsløbssygdommeog derfor kun delvis erstatning for in vivo-modeller.
Den mest udbredte in vivo-model af vaskulær invasion er musen, i hvilken eksperimentel metastase assays almindeligvis udføres, fordi de forekommer på relativt korte tidsskalaer og har normalt indikerer metastatisk evne 9. Disse analyser involverer direkte injektion af kræftceller i omløb, og derfor modellere de endelige stadier af metastaser, nemlig ekstravasation og kræft celle kolonisering af organer. De eksperimentelle metastase analyser varierer baseret på stedet af kræftcellen indsprøjtning og organer til sidst analyseret. I den første analysetype, er kræftceller injiceret i halevenen af mus og cancercelle såning i lungerne overvåges 10,11. Det andet assay omfatter handlinger intrakardielle injektioner til direkte metastatisk podning mod knoglen mikromiljø 12-14, men også hjernen 15. I den tredje assay, kræft calen injiceres i milten for at tillade kolonisering af leveren 16 mens den fjerde tilførselsvej i carotidarterien bærer cancerceller til hjernen 17,18. Uanset kræftcellen leveringsmetode, orgel kolonisering er den accepterede eksperimentelle endpoint og er generelt bestemmes via luminescens, histologi, eller PCR-baserede teknikker. På trods af de fysiologiske fordele ved at gennemføre eksperimentelle metastase analyser inden for en muse vært, disse eksperimenter kræver stadig uger til måneder at gennemføre og analysere.
Zebrafisk (Danio rerio) model har for nylig vist sig som et nyt system til at studere udviklingen af kræft 19,20, og muliggør vurdering af cancercellen vaskulær invasion i et funktionelt kredsløbssygdomme over et meget kortere tidsrum sammenlignet med mus 21-24. Metoden anvender en gennemsigtig zebrafisk stamme, der har sin endotel mærket med en grøn reef koral fluospare- protein reporter drevet af kdrl promotoren, zebrafisk receptor for vaskulær endotel vækstfaktor 25. I assayet, er cancerceller mærket med en rød fluorescerende markør og injiceret i præcardielt sinus af 2 dage gamle embryoner. Overalt mellem 48 til 96 timer efter injektionen, kan cancerceller, der har invaderet ud af vaskulaturen og ind i kaudale område af embryoner blive scoret effektivt på et fluorescerende mikroskop. Her anvender vi en teknik til et panel af almindeligt anvendte humane brystcancer cellelinjer at påvise markante forskelle i deres vaskulære invasive evne. Endvidere viser vi, at ændre injektionsstedet til embryo blommesækken muliggør studiet af heterogene celle-interaktioner som kræft cellepopulationer kan differentielt mærket med fluorescerende farvestoffer og injiceres i zebrafisk embryoner mangler fluorescerende vaskulatur. I sidstnævnte assay, cancerceller, der har invaderet blommen og intravasated ind i vasculature er scoret i caudale region 24 til 48 timer efter injektion. På grund af den effektivitet og bekvemmelighed af denne model, er zebrafisk stigende grad anvendes til hurtigt at teste den vaskulære invasive evne af cancerceller under en fysiologisk indstilling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik Statement: zebrafisk embryoner blev genereret efter en godkendt IACUC protokol. Disse forsøg blev udført i overensstemmelse med anbefalinger fra Georgetown University Animal Care og brug Udvalg.
1. Organiser Embryoner til injektion og Opret Stock Solutions
- Generere nødvendige zebrafisk larver at vurdere kræftcelle vaskulær invasion.
- Opsæt parvis eller gruppe i-cross parring med Tg (kdrl: grcfp) Zn1, mitfa b692; ednrb1 B140 fisk.
BEMÆRK: Vi genererede Tg (kdrl: grcfp) Zn1, mitfa b692; ednrb1 B140 zebrafisk, ved at krydse Tg (kdrl: grcfp) Zn1 25, som udtrykker grønt reef koral fluorescerende protein i endotelceller, med en linje, der mangler pigment celler, mitfa b692, ednrb1 B140, udviklet på zebrafisk International Resource center. - Collect æg, ren, og fjern ubefrugtede eller deformerede fostre den næste dag 22.
- Inkuber embryoner ved 28,5 ° C, indtil klar til injektion med kræftceller, at opstå, når de zebrafisk embryoner er 2-dage efter befrugtningen (2 dpf).
- Opsæt parvis eller gruppe i-cross parring med Tg (kdrl: grcfp) Zn1, mitfa b692; ednrb1 B140 fisk.
- Foretag injektion plader.
- Smelt 25 ml 1,5% agarose i dH 2 O for hver plade.
- Hæld 12 ml af agarose i en 100 mm x 15 mm petriskål og lad det hærde.
- Re-smelte derefter hælde de resterende agarose i pladen.
- position umiddelbart en slebet glas støbeform (3 mm x 7,2 cm brede x 7,5 cm lange), således at det er i en 30 graders vinkel til agarose og placeret i midten af pladen.
BEMÆRK: Dette vil skabe en stejl 60 ° væg og en 30 ° skrå rampe. - Tape glasformen på plads og lad agarose hærde.
- Fjern forsigtigt glasset mug og være omhyggelig med ikke at rive agarose.
BEMÆRK: Forme kan opbevares i dH2O ved 4 ° C.
- Ækvilibrer injektion plade med fisk vand (0,3 g / L havsalt).
- Skyl plade to gange med destilleret vand.
- Ækvilibrering plade ved tilsætning af 10 ml af fisk vand til pladen og sted på rysteapparat i 10 min.
- Ækvilibrere plade en anden gang med fisk vand.
- Split 2-dages post-befrugtning (DPF) embryoner i injektion grupper ved at overføre dem til retter, der indeholder fisk vand 22.
- Forbered recovery retter for hver gruppe at udnytte efter injektion. Sørg for, at opsvinget parabol indeholder 10 ml fisk vand, plus penicillin (25 ug / ml) og streptomycin (50 ug / ml).
- Forbered 2x tricaine opløsning ved tilsætning af 4 ml pufret tricaine lager (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) til 50 ml fisk vand plus penicillin og streptomycin.
- Opløs 15 mg lavt smeltepunkt agarose i 10 ml 2x tricaine opløsning til udvikling af et monterings bedøvelsesmiddel medium, der vil immobilisere levende embryoner til imaging.
BEMÆRK: Montering medium består af 1,5% agarose. - Træk mikroinjektion nåle.
- Placer glas kapillarrør i en lodret pipette aftrækker. Træk længe tilspidsede pipetter anvendelse af 20 mAmp strøm og en 2-spole varmeelement.
2. Mærkning Cancer Cells med lipofil Fluorescent Dye
- Opretholde cancerceller i deres anbefalede dyrkningsbetingelser.
BEMÆRK: Disse linjer blev holdt i DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, og SK-BR-3. Disse linjer blev opretholdt i RPMI + 10% FBS: HCC 1806 og T-47D. Alle cellelinjer blev holdt ved 37 ° C og 5% CO2 under inkubation. - Generere en enkelt-cellesuspension ved at dissociere en adhærent kultur af cancerceller.
- Vask cellerne først med PBS og derefter behandle med 0,05% trypsin-EDTA-opløsning.
BEMÆRK: Trypsin eksponeringstid vil afhænge af cellelinjen. - Neutraliseres trypsin opløsning med SErom-holdige celledyrkningsmedier efter at cellerne løsnes.
- Vask cellerne først med PBS og derefter behandle med 0,05% trypsin-EDTA-opløsning.
- Centrifugeres trypsin-neutraliserede cellesuspension i 5 minutter ved 200 xg, derefter resuspender cellepelleten i frisk dyrkningsmedium til celletælling.
- Tæl cellesuspensionen anvendelse af en automatiseret tæller og forberede 1 million celler i 200 pi celledyrkningsmedier.
- Verificer cellelevedygtighed med trypanblå farveeksklusion før injektion i zebrafisk embryoer.
BEMÆRK: Kun levedygtige cellepopulationer skal injiceres i zebrafisk embryoner som injektion af døde celler vil ikke afspejle sande vaskulær invasion.
- Verificer cellelevedygtighed med trypanblå farveeksklusion før injektion i zebrafisk embryoer.
- Tilsæt 2 pi røde lipofile farvestof til cancercellen suspension for en 1: 100 fortynding, bland godt, og derefter inkuberes blandingen ved 37 ° C i 20 min.
BEMÆRK: Koncentration af farvestoffet og mærkning tid kan være nødvendigt at være optimeret til hver cellelinie. - Efter inkubation tilsættes 1 ml frisk medium til røret centrifugeres i 5 min ved200 x g.
- Vask væk resterende fluorescerende farvestof fra kræftcellerne.
- Aspirer supernatanten fra cellepelleten, pellet resuspenderes i 1 ml frisk dyrkningsmedium, og centrifugeres i 5 minutter ved 200 x g.
- Gentag vasketrinet en anden gang: udsuge supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml frisk medium og centrifugeres igen i 5 minutter ved 200 x g.
- Gentag vasketrinet tredje gang: udsuge supernatanten, resuspender cellepelleten i 1 ml frisk medium og centrifugeres igen i 5 minutter ved 200 x g.
- Aspirere supernatanten og resuspender cellepelleten indeholdende 1 million mærkede cancerceller i 500 pi frisk medium.
BEMÆRK: 0,5 mM EDTA kan føjes til medierne for at forhindre cell sammenklumpning.
3. Injektion kræft i Pre-hjerte-Sinus af zebrafisk embryoner
- Vedhæft mikroinjektion dispensere system til et trykluftkilde og slå the mikroinjektion dispensersystem strømkilde.
- Test pres ved at trykke fodpedal. En kort puls af luft bør udsende fra nåleholderen.
- Ækvilibrer injektionssted pladerne to gange med 2x tricaine opløsning.
- For hver ækvilibreringstrin, tilsættes 20 ml 2x tricaine løsning injektionspladen og sted på rysteapparat i 10 min.
- Brug plastik pipette til at overføre en gruppe af embryoner til en lille skål indeholdende 2x tricaine opløsning.
- Efterfylde mikroinjektion kanyle med kræftceller ved hjælp af en gel-loading pipettespids.
- Placer nålen i en elektrode opbevaring krukke med den spidse ende nedad, så cellerne bosætte nær spidsen.
- Overførsel 20 - 30 bedøvede embryoer til en injektion plade ved at indsamle embryoner med masser af 2x tricaine i en plastik pipette.
- Tillad embryoner at bosætte sig i spidsen af pipetten.
- Gently udvise embryoner i truget af injektionspladen, spreder embryonerne langs længden af truget.
- Juster fostre med hoved opad og maver vender den stejle væg af truget.
BEMÆRK: tricaine løsning bør dække både truget længde og den flade agarose overflade, med embryoner kun bosiddende i truget. Embryoner er nu klar til injektion.
- Injicer 50 - 100 cancerceller (2 - 5, NL) ind i præcardielt sinus af zebrafisk embryoer ved hjælp af mikroinjektion dispensersystem.
- Fastgør nålen til nålen indehaveren af en mikromanipulator.
- Placer injektionen pladen under Stereoskopet med 60 graders væg til venstre og fokus på toppen embryo på 25x forstørrelse.
- Placer mikromanipulator således at når forlænget, vil nålen trænge embryoet.
- Forlæng nålen ved øjet, indtil det er næsten rører embryoet.
- Ser under mikroskopet, justere nålen så that vil gennembore embryo på yderligere forlængelse.
- Pierce embryoet gennem blommesækken placere spidsen lige ved, men ikke i den præ-kardial sinus.
- Injicer celler ved at trykke fodpedal. Kraften af injektionen ekskluderer cellerne i hjertets sinus. Træk nålen.
- Under anvendelse højre, udvide og tilbagetrække injektionsnålen. Med den venstre hånd, foretage finjusteringer at placere næste embryo.
- Retur nålen til elektroden opbevaring jar mens opsætning at injicere en anden plade.
- Overfør embryoner til inddrivelse fadet, når hele pladen injiceres.
- Vip injektionspladen at samle embryonerne i bunden, vask eventuelle resterende embryoner ud af truget, og indsamling heraf med plastik pipette.
- Lad embryoner at bosætte sig i bunden af pipetten.
- Overfør embryoner til inddrivelse fadet i en minimal mængde af tricaine.
- Incubate recovery skål ved 28 ° C i 1 time.
- Separate levedygtige zebrafisk embryoner fra døde fostre og andet affald.
- Inkuber parabol på 33 ° C indtil den er klar til scoring, typisk 24-96 timer.
BEMÆRK: Denne temperatur bestemmes som et kompromis mellem 37 ° C, den ideelle temperatur for kræftceller, og 28,5 ° C, den ideelle temperatur for zebrafisk.
4. Scoring Ekstravasation
- Bedøver det parti embryoner skal scoret ved at placere dem i et fad med tricaine løsning.
- Placer en bedøvet larver på en depression mikroskopi dias i en dråbe tricaine.
- Orient larver lateralt for optimal billeddannelse af den kaudale region.
- Tæl antallet af cancerceller, der med succes invaderet ud af vaskulaturen ved at fokusere op og ned gennem haleregionen til klart skelne intakte celler.
BEMÆRK: Det er bedst at have mindst to personer, der er involveret i thans proces, hvor den enkelte scorer fisken er blind for den eksperimentelle tilstand, der vurderes.- Score larver på en forbindelse fluorescensmikroskop med 10x objektivlinse. Brug 20 x objektiv for eventuelle vanskelige opkald.
5. Montering Embryoner onto Slides og efterfølgende Fluorescens Imaging
- Smelt 1,5% agarose / tricaine løsning og bringe til 37 ° C.
- Anesthetize embryo, der skal afbildes ved at placere den i tricaine opløsning.
- Overfør embryo i en dråbe tricaine løsning på imaging overflade. Valgfrit bruge en glas-bund parabol eller objektglas.
- Brug et glas pipette til at fjerne den overskydende tricaine løsning, bevarer embryoet på imaging overflade.
- Overlay en dråbe smeltet agaroseopløsning over embryo.
- Hurtigt, før agarose polymeriserer, bruge en delikat værktøj, ligesom en øjenvippe børste, at orientere embryo sideværts for billedbehandling, der giver ekstra plejeat sikre embryoet er fladtrykt langs afbildningsoverfladen.
- Nedsænkes nu polymeriseret agarose dråbe under tricaine løsning.
- Emne live zebrafisk embryo til mikroskopisk billeddannelse.
6. Ændring: Injektion kræft i blommesækken af zebrafisk embryoner
- Forbered mikroinjektion dispensersystem og injektion plader som tidligere beskrevet i afsnit (3), i denne protokol.
- Label to cellepopulationer med kontrasterende fluorescerende farvestoffer som tidligere beskrevet i afsnit (2) i denne protokol.
- Injicer 5 - 10 nl af 2 x 10 ^ 7 celler / ml i blommesækken. Hold injektionsvolumen konstant at injicere identiske celleantal (100 - 200 cancer celler) fra hver cellepopulation
BEMÆRK: Man kan bruge gennemsigtige zebrafisk embryoner mangler fluorescerende vaskulatur til denne analyse. Passiv optagelse af partikler til vaskulaturen kan styres til ved injektion af fluorescerende perler (<10 um) eller, ændrenativt, en cellelinie, der ikke intravsate. - Gendan de injicerede embryoner som tidligere beskrevet i afsnit (3), i denne protokol og derefter screene for succesfulde injektioner.
- Brug en Stereoskopet at screene og overføre levedygtige embryoner, der lykkedes injiceret til en ny skål.
BEMÆRK: Alle embryoer bør have en konsekvent dimensioneret masse af celler placeret i blommen. Embryoner kasseres hvis massen afviger i størrelse, eller hvis nogen celler er placeret uden for blommen. - Overfør levedygtige embryoner til en ny skål, om kræftcellerne ses tydeligt i blommesækken.
- Brug en Stereoskopet at screene og overføre levedygtige embryoner, der lykkedes injiceret til en ny skål.
- Inkuber parabol på 33 ° C indtil den er klar til scoring, typisk 24-48 timer.
BEMÆRK: Denne temperatur bestemmes som et kompromis mellem 37 ° C, den ideelle temperatur for kræftceller, og 28,5 ° C, den ideelle temperatur for zebrafisk. - At score intravasation, følge de retningslinjer, der er beskrevet i afsnit (4), i denne protokol, men i stedet tælle antallet af cancer celler, der med succes invaderet i vaskulaturen af den kaudale region.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Her testede vi den vaskulære invasive evne almindeligt anvendte brystcancer cellelinjer i en zebrafisk embryo model (figur 1). Strenge kriterier blev anvendt i scoring ekstravasation for disse forskellige cellelinjer, hvor positive begivenheder kun blev talt, hvis kræftcellerne havde tydeligvis ekstravaseret, dette gøres hovedsageligt at begrænse eventuelle falsk-positive, der kunne opstå fra at lave cellerester.
Vores analyse afslørede markante forskelle blandt de linjer, når invasionen blev vurderet 96 timer efter injektion i præcardielt sinus (tabel 1). Af de 7 testede cellelinjer, zebrafisk embryoner injiceret med MDA-MB-231-cellelinje udviste det største antal ekstravaserede cancerceller per embryo, en konstatering, der er konsistent med den accepterede metastatisk karakter af linjen (figur 2). Vi fandt også, at BT-474 celler lettest jegnvaded i de caudale region af embryonerne, mens andre cellelinjer, såsom MCF-7, SK-BR-3 og T-47D-celler, var minimalt invasiv (figur 3). En underlig opdagelse var, at omtrent halvdelen af de zebrafisk embryoner injiceret med MDA-MB-468 celler havde ødemer i cardial region, og disse blev ikke scoret. Som følge heraf blev en række af embryoner injiceret med MDA-MB-468 celler kasseret før vi fandt nok levedygtige prøver, der kunne kvantificeres for ekstravasation. På trods af disse påståede forskelle er det bemærkelsesværdigt, at ekstravasation forekom med hver testet cancercellelinie.
Som en modifikation af præcardielt sinus assayet, udførte vi en konkurrence eksperiment hvorved to populationer af MDA-MB-231-celler, der afviger i deres vaskulære invasive evne 26 blev samtidigt injiceret i blommesækken af fostre. MDA-MB-231 celler opformeret under sammenflydende dyrkningsbetingelser forudgåendetil injektion udviste en reduktion i intravasation i kredsløbet og derfor havde en reduceret forekomst i den kaudale område af embryonerne ved scoring (figur 4).
| cellelinie | Gns. # Ekstravaseret celler pr Embryo | Rækkevidde |
| MDA-MB-231 (Subkonfluente) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0.2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Tabel 1: Sammenligning af vaskulær invasiv evne brystcancercellelinier i zebrafisk Almindeligt anvendte brystcancercellelinier blev injiceret i præcardielt sinus af 2 dage gamle zebrafisk embryoner og afsluttet 4 dage senere. Kræftceller invaderer fra vaskulaturen og ind i kaudale region blev kvantificeret i 10 embryoner pr cellelinie. Det gennemsnitlige antal ekstravaserede cancerceller er angivet langs med rækken.
Figur 1. Visuel Sammendrag af zebrafisk Cancer Cell Ekstravasation Assay. I dette assay er cancerceller mærket med et fluorescerende farvestof og injiceret i præcardielt sinus af 2 dage gamle zebrafisk embryoner, hvis vaskulaturen er markeret med en kontrastfarve fluorescerende reporter. Efter 2 - 4 ekstra dage, cancerceller, der har invaderet i de caudale region af embryoet erscorede og kan monteres i et anæstetikum agarose medium til efterfølgende billeddannelse. Hvert trin er afbildet i denne skematiske svarer til en del af protokollen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Billede Mosaic af en zebrafisk Embryo 4 dage efter injektion med MDA-MB-231-celler. Lysfelt (A) og fluorescerende (B) mosaikker vist. Fluorescerende billeder er afbildet som den maksimale projektion af en z-stak, i hvilken en grøn farve betegner vaskulaturen og en rød farve angiver kræftcellerne. Scale bar, 200 um. (C) fosterets caudale region forstørres at vise ekstravaserede kræftceller. Punktat fluorescerende mærkning ses på Magnification. Scale bar, 50 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Eksempel på eksperimentelle resultater. Her ekstravasation demonstreres i et embryo injiceret med BT-474 cancerceller, men ikke i et embryo injiceret med MCF-7, SK-BR-3 og T-47D-cancerceller. Pilespidser angiver ekstravaserede celler. Scale bar, 100 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Intravasation af MDA-MB-231 Cell Befolkninger 2 dage ofter blommesækken Injection. (A) blommesækken med grøn (invasiv) og rød (mindre invasive) mærket MDA-MB-231-celler. (B) Den caudale region med MDA-MB-231-celler, der invaderede vaskulaturen at nå halen region. (C) antallet af zebrafisk embryoner med intravasated MDA-MB-231-celler i den kaudale region 2 dage efter injektion 26. Scale barer, 250 um. Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne teknik udnytter zebrafisk model til effektivt teste den vaskulære invasive evne af cancerceller (se figur 1). Her påføres vi teknikken til et panel af brystcancer-cellelinier for at tilvejebringe en basislinie hvorpå andre forskere så kan bygge deres egne undersøgelser (se tabel 1; Figures 2 - 3). Den iagttagelse, at MDA-MB-231-celler let invaderet i den kaudale område af zebrafisk embryoner ville gøre denne cellelinie ideel til afprøvning midler der vil kunne bremse vaskulær invasion. Forholdsvis mindre invasive cellelinier, ligesom HCC1806 eller MDA-MB-468 celler for eksempel kunne anvendes til at studere faktorer, der ellers ville potensere vaskulær invasion. Hvis disse typer af eksperimenter kræver optagelse af lægemidler, så man har to forskellige administrationsveje, afhængigt af om behandlingen effekt forventes at være holdbare. Kræftcellerne kan forbehandles med stof før injektion iembryonerne eller lægemidlet kan tilsættes direkte til vandet huser embryoner hvor det vil påvirke kræftceller ved diffusion.
I vores sammenligning analyserede vi cancercelle ekstravasation i zebrafisk embryo hale 96 timer efter injektion i præcardielt sinus. På MDA-MB-231 konkurrence celle assay blev intravasation i omsætning vurderes 48 timer efter blommesækken injektion. De tidspunkter valgt til analyse kræver typisk optimering for hver cellelinie, hvor for nogle eksperimenter, kan peak ekstravasation forekomme blot 24 timer efter injektionen. Det er værd at bemærke, at de zebrafisk embryoner har et funktionelt medfødte immunsystem, når de injiceres med cancerceller 27 og dermed kan fluorescerende rester fra cancercellerne blive opslugt af immunceller såsom makrofager eller neutrofiler. Aktivitet af det medfødte immunsystem kan derfor potentielt skabe falsk-positive fluorescerende mærkning, når de forsøger at score extravasation; pleje skal gives til kun score celler, der håndfast fluorescerer i den rigtige kanal. Da nuværende cancerforskning er impliceret immunsystemet i at forbedre cancermetastase 28, kan zebrafisk embryo model giver enestående indsigt i dette område ved at tillade undersøgelse af krydstale optræder mellem cancerceller og det medfødte immunsystem. Denne idé er eksemplificeret ved et par af de seneste undersøgelser. Den første af disse undersøgelser viste, at VEGFR inhibition inden zebrafisk forbedret evne neutrofiler til at fremkalde metastatisk adfærd fra cancerceller 29. En anden undersøgelse viste, at CXCR4-CXL12 immune kemokinsignalering akse er intakt inden zebrafisk, som receptoren på humane cancerceller var i stand til registrering og reagere på zebrafisk ligand 30, og ekspressionen af CXCR4 i cancerceller korreleret med deres invasive evne i dyremodel. Endvidere blev det påvist, at zebrafisk makrofager udstillingerTed en kemotaktisk reaktion mod menneskelig CXCL12. En zebrafisk embryo stamme med fluorescensmærkede neutrofiler 31, for eksempel kunne anvendes til yderligere at undersøge kræft celle interaktioner med immunsystemet i denne model.
Et par skridt i protokollen kræver særlig opmærksomhed. For det første er det afgørende, at cancerceller dissocieres til en enkelt-cellesuspension for at forhindre tilstopning af nålen under injektion i embryoer. Cellulære aggregater kan også blokere for strømmen af blod og forstyrrer evnen af cancercellerne for at rejse i de caudale regionen og således skævvridning analysen. Cellular aggregater kan også fremkalde blodkarrene til at briste, og hvis det sker, at udføre den invasive evne levende kræftceller i disse regioner er hverken pålidelige eller anbefales. Et andet potentielt problem område vedrører mærkning kræftcellerne med det fluorescerende farvestof. I forsøg drevet af vores laboratorium har vi fundet, at lipofile farvestoffer,ligesom Dii for eksempel tendens til at producere den bedste mærkning, men dens fluorescens plan kan variere mellem cellelinier. Af denne grund bør den fluorescerende mærkning af cancerceller optimeres før injektion i embryoer for at forhindre over-mærkning. Det er kritisk, at overskydende farvestof vaskes væk fra kræftcellerne efter de er blevet mærket, og dette opnås ved de forskellige centrifugeringstrin nævnt i afsnittet af protokollen mærkning; disse trin kan synes overflødigt, men de er absolut nødvendige. For meget fluorescerende farvestof kan være toksiske for celler eller sive ind i blodbanen, fremstilling af en kunstig fluorescerende baggrund. Mange af disse spørgsmål kan omgås ved brug af cancerceller, der udtrykker fluorescerende proteiner, og det anbefales, at disse systemer anvendes i stedet for fluorescerende farvestof, når det er muligt. Endelig, når scorer de embryoner til kræft ekstravasation, er det bydende nødvendigt at anvende konsekvente kriterier for alle forhold. Vi finder that inddrage mindst to personer i scoring trin bidrager til at opretholde videnskabelig stringens: et individ har til opgave at forberede dias og registrering af resultaterne, mens den anden person gør ekstravasation dom og holdes blind for den tilstand, der evalueres. Når scorer, kan man enten kvantificere ekstravaserede kræftceller i halen region eller oprette binære kriterier for at lette sammenligning. Fluorescerende farvning kræftcellerne producerer punktformig mærkning, som kan ses på meget stor forstørrelse (figur 2c), selvom hele celler er lettere at skelne ved lavere forstørrelse (figur 3), er den sidstnævnte anbefales til scoring. At dømme mere tvetydige tilfælde af ekstravasation kan hjælpes af købet af optiske skiver på en konfokal mikroskop, hvor kvantificering ekstravasation som en procent af alle celler i halen region kan styre for ulige belastning af kræftceller i embryoet.
Den yolk sac injektion rute er forskellig fra præcardielt sinus da det giver mulighed for et højere antal celler og derfor bedre kan rumme heterogeniteten i en cellepopulation. Som vist i figur 4 kan flere differentielt mærkede cellepopulationer samtidigt sprøjtes ind i blommesækken at sammenligne deres invasive evne og mønster. Den angiogene evne injicerede celler og øget rekruttering af blodkar kan lette cancercelle indtræden i haleregionen men dette aspekt er endnu ikke blevet analyseret. Teknisk set blommesækken injektioner er lettere at udføre end en præcardielt sinus injektion imidlertid på den anden side, blommesækken er en næringsrig miljø, der kan hindre afgangen fra kræftceller. Det er også muligt, at injektion nær blodkar i blommen tidligt kan indføre kræftceller i kredsløbet, og derfor må man omhyggeligt screene for forkludrede injektioner og udelade disse embryoner fra scoring. Endelig er det vigtigt to bemærke, at blommen mikromiljø er noget kunstig, da det mangler en analog primærtumor hos mus eller mennesker.
De forskellige modelsystemer, der søger at forudsige cancermetastase er ikke uden deres fordele og ulemper, og zebrafisk ekstravasation assayet er ingen undtagelse. Som en stor fordel, denne analyse giver mulighed for vurdering af vaskulære invasive evne inden for et funktionelt kredsløbssygdomme og eksperimentelle spørgsmål kan besvares efter blot et par dage. I betragtning af den hurtige behandlingstid, kunne et sådant system anvendes til at undersøge aggressiv adfærd ikke kun etablerede cellelinier, men også frisk isolerede prøver fra patienter human cancer. Den største ulempe er, at denne model udelader de tidligste og seneste begivenheder i det metastatiske kaskade ved udelukkende at fokusere på vaskulær invasion. Desuden er de menneskelige kræftceller injiceret i disse zebrafisk embryoner naturligvis ikke opererer i en syngen miljø og nogle samspil med than stroma kan derfor tabt. På trods af disse begrænsninger, zebrafisk embryo model har en fortjent plads i både grundlæggende og translationel kræftforskning, som vi har ansat det viser en rolle for Hippo signalvejen 26 og keratin-associeret protein 5-5 32 i den vaskulære invasive evne kræft celler. Derfor er denne model har potentiale til at støtte undersøgelsen af en nøgle metastatisk kendetegnende for fremskredent stadium kræft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
- Cummings, M. C., et al. Metastatic progression of breast cancer: insights from 50 years of autopsies. Am J Path. 232, 23-31 (2014).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nat Rev Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Reymond, N., d'Água, B. B., Ridley, A. J. Crossing the endothelial barrier during metastasis. Nat Rev Cancer. 13 (12), 858-870 (2013).
- Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat Med. 19 (11), 1423-1437 (2013).
- Hooper, S., Marshall, J. F., Sahai, E. Tumor cell migration in three dimensions. Method Enzymol. 409, 625-642 (2006).
- Rahim, S., Üren, A. A real-time electrical impedance based technique to measure invasion of endothelial cell monolayer by cancer cells. J Vis Exp. (50), (2011).
- Jeon, J. S., et al. Human 3D vascularized organotypic microfluidic assays to study breast cancer cell extravasation. Proc Natl Acad Sci USA. 112 (1), 214-219 (2015).
- Shin, Y., et al. Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels. Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).
- Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. Modelling breast cancer: one size does not fit all. Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).
- Mohanty, S., Xu, L. Experimental metastasis assay. J Vis Exp. (42), (2010).
- Minn, A. J., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to lung. Nature. 436 (7050), 518-524 (2005).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. J Vis Exp. (64), e4260 (2012).
- Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow. Cancer Res. 48 (23), 6876-6881 (1988).
- Minn, A. J., et al. Distinct organ-specific metastatic potential of individual breast cancer cells and primary tumors. J Clin Invest. 115 (1), 44-55 (2005).
- Bos, P. D., et al. Genes that mediate breast cancer metastasis to the brain. Nature. 459 (7249), 1005-1009 (2009).
- Soares, K. C., et al. A preclinical murine model of hepatic metastases. J Vis Exp. (91), e51677 (2014).
- Kienast, Y., et al. Real-time imaging reveals the single steps of brain metastasis formation. Nature Med. 16 (1), 116-122 (2010).
- Hasegawa, H., Ushio, Y., Hayakawa, T., Yamada, K., Mogami, H. Changes of the blood-brain barrier in experimental metastatic brain tumors. J Neurosurg. 59 (2), 304-310 (1983).
- Amatruda, J. F., Shepard, J. L., Stern, H. M., Zon, L. I. Zebrafish as a cancer model system. Cancer Cell. 1 (3), 229-231 (2002).
- Feitsma, H., Cuppen, E. Zebrafish as a cancer model. Molecular Cancer Res. 6 (5), 685-694 (2008).
- Stoletov, K., Klemke, R. Catch of the day: zebrafish as a human cancer model. Oncogene. 27 (33), 4509-4520 (2008).
- Stoletov, K., et al. Visualizing extravasation dynamics of metastatic tumor cells. J Cell Sci. 123 (13), 2332-2341 (2010).
- Kanada, M., Zhang, J., Yan, L., Sakurai, T., Terakawa, S. Endothelial cell-initiated extravasation of cancer cells visualized in zebrafish. PeerJ. , (2014).
- Teng, Y., Xie, X., Walker, S., White, D. T., Mumm, J. S., Cowell, J. K. Evaluating human cancer cell metastasis in zebrafish. BMC Cancer. 13 (453), (2013).
- Cross, L. M., Cook, M. A., Lin, S., Chen, J. -N., Rubinstein, A. L. Rapid analysis of angiogenesis drugs in a live fluorescent zebrafish assay. Arterioscl Throm Vas. 23 (5), 911-912 (2003).
- Sharif, G. M., et al. Cell growth density modulates cancer cell vascular invasion via Hippo pathway activity and CXCR2 signaling. Oncogene. 34, 5879-5889 (2015).
- Novoa, B., Figueras, A. Zebrafish: model for the study of inflammation and the innate immune response to infectious diseases. Adv Exp Med Biol. 946, 253-275 (2012).
- Kitamura, T., Qian, B. -Z., Pollard, J. W. Immune cell promotion of metastasis. Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).
- He, S., et al. Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model. J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).
- Tulotta, C., et al. Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model. Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).
- Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).
- Berens, E. B., et al. Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion. Oncogene. , Epub ahead of print (2016).
