Summary
Cette méthode utilise des embryons de poisson zèbre pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses. les cellules cancéreuses fluorescentes sont injectées dans le sinus précardiaque ou de sac vitellin d'embryons en développement. cellule cancéreuse invasion vasculaire et une extravasation est évaluée par microscopie de fluorescence de la région de la queue 24-96 heures plus tard.
Introduction
La maladie métastatique est une cause majeure de mortalité et de nombreux mécanismes qui permettent la diffusion des cellules cancéreuses restent à découvrir 1 cancer. Pour une cellule cancéreuse à métastaser avec succès, il doit tout d'abord envahir à travers le stroma entourant la tumeur primaire, entrer (intravasate) dans le système circulatoire, à survivre dans le transit, la sortie (extravasation) à partir de la circulation, et enfin d'établir une colonie viable sur le site de l' organe distant 2. Intravasculaire et extravasation sont donc des étapes cruciales dans la cascade métastatique, mais toutes les cellules du cancer ne sont pas intrinsèquement aptes à perturber et à migrer à travers les jonctions endothéliales 3. En fait, il existe une série de pressions de sélection unique qui entourent la cellule cancéreuse une invasion vasculaire et le processus peut être encore influencée par une variété de facteurs endogènes et exogènes 4. Pour ces raisons, les techniques qui sondent le comportement agressif du cancer de stade avancé se concentrent souvent sur vasculaire capacité invasive comme un moyen de prédire la dissémination métastatique.
Divers systèmes de modèles existent pour faciliter l'étude des cellules cancéreuses envahissement vasculaire in vitro. Le plus utilisé dans des essais in vitro impliquent soit des systèmes Transwell pour évaluer la migration des cellules cancéreuses à travers une barrière endothéliale 5 ou de la technologie électrique Cell-Substrat Impedance Sensing (ECIS) pour surveiller en temps réel les perturbations d'une monocouche endothéliale intacte par les cellules cancéreuses 6. Ces dosages manquent généralement de la dynamique des fluides et des facteurs de stroma qui seraient par ailleurs une incidence sur l'attachement des cellules cancéreuses à une paroi endothéliale. Cette question est quelque peu contournée par des réseaux vasculaires irrigables qui découlent de la culture 3D de l' endothélium à l' appui des cellules stromales, et ces systèmes microfluidiques 3D représentent désormais l'avant - garde des options actuelles in vitro 7,8. Pourtant, ces approches omettent le microenvironnement robuste d'un système circulatoire fonctionnelet donc seulement en remplaçant une partie des modèles in vivo.
Le plus largement utilisé dans le modèle in vivo de l' invasion vasculaire est la souris, dans lequel des essais de métastases expérimentales sont généralement effectuées parce qu'ils se produisent sur des échelles de temps relativement courtes et sont généralement indicatives de la capacité métastatique 9. Ces essais impliquent l'injection directe de cellules cancéreuses en circulation, et donc de modéliser les étapes d'extrémité des métastases, à savoir une extravasation et une cellule cancéreuse colonisation des organes. Les essais de métastases expérimentales diffèrent en fonction du site d'injection des cellules cancéreuses et les organes finalement analysés. Dans le premier type d'essai, les cellules cancéreuses sont injectées dans la veine caudale de la souris et l' ensemencement des cellules cancéreuses dans les poumons est contrôlée 10,11. Le second test consiste à effectuer des injections intracardiaques pour semis direct métastatique vers le microenvironnement osseux 12 à 14, mais aussi le cerveau 15. Dans le troisième essai, le cancer du cells sont injectées dans la rate, afin de permettre la colonisation du foie 16 tandis que la quatrième voie de livraison dans l'artère carotide transporte des cellules cancéreuses du cerveau 17,18. Indépendamment de la méthode de distribution des cellules cancéreuses, la colonisation d'organes est le point final expérimental accepté et est généralement déterminée par luminescence, histologie, ou des techniques basées sur la PCR. Malgré les avantages physiologiques de la réalisation d'essais de métastases expérimentales dans un hôte murin, ces expériences ont encore besoin de semaines à quelques mois pour terminer et à analyser.
Le poisson zèbre (Danio rerio) modèle a récemment émergé comme un nouveau système pour étudier la progression du cancer 19,20, et permet l'évaluation de la cellule cancéreuse invasion vasculaire dans un système circulatoire fonctionnelle sur une échelle de temps beaucoup plus courte en comparaison avec des souris 21-24. Le procédé utilise une souche zebrafish transparente qui a son endothélium marqué par un fluo des récifs coralliens verterescent rapporteur de la protéine entraînée par le promoteur kdrl, le récepteur du poisson zèbre pour endothélial vasculaire facteur de croissance 25. Dans le dosage, les cellules cancéreuses sont marquées avec un marqueur fluorescent rouge et injecté dans le sinus précardiaque de 2 jours embryons âgés. Environ entre 48-96 heures après l'injection, les cellules cancéreuses qui ont envahi par les vaisseaux sanguins et dans la région caudale d'embryons peuvent être marqués de manière efficace sur un microscope à fluorescence. Ici, nous appliquons la technique à un groupe de lignes couramment utilisées cellulaires du cancer du sein humain pour démontrer des différences marquées dans leur capacité invasive vasculaire. De plus, nous démontrons que la modification du site d'injection dans le sac vitellin d'embryons permet l'étude des interactions cellulaires hétérogènes, comme des populations de cellules cancéreuses peuvent être marqués de façon différentielle avec des colorants fluorescents et injectés dans des embryons de poisson zèbre dépourvus de système vasculaire fluorescent. Dans ce dernier essai, les cellules cancéreuses qui ont envahi le jaune d'oeuf et dans le intravasated vasculature sont marqués dans la région caudale 24-48 h après l'injection. En raison de l'efficacité et de commodité de ce modèle, les poissons zèbres sont de plus en plus utilisé pour tester rapidement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses sous un paramètre physiologique.
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Protocol
Déclaration d'éthique: embryons de poisson zèbre ont été générés selon un protocole IACUC approuvé. Ces expériences ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Comité sur les soins et l'utilisation des animaux de l'Université de Georgetown.
1. Organiser Embryons pour injection et créer Stock Solutions
- Générer des larves de poisson zèbre nécessaire pour évaluer la cellule cancéreuse invasion vasculaire.
- Mettre en place par paire ou d'un groupe en croix accouplement avec Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa b692; ednrb1 b140 poissons.
NOTE: Nous avons généré Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafish, en croisant Tg (kdrl: grcfp) ZN1 25, qui expriment récif protéine fluorescente verte de corail dans les cellules endothéliales, avec une ligne qui manque des cellules pigmentaires, mitfa b692; ednrb1 b140, développé au Centre international Resource Zebrafish. - Coœufs de llect, propre, et de supprimer les embryons fécondés ou déformés , le lendemain 22.
- Incuber embryons à 28,5 ° C jusqu'au moment de l'injection avec des cellules cancéreuses, de se produire lorsque les embryons de poisson zèbre sont de 2 jours après la fécondation (2 dpf).
- Mettre en place par paire ou d'un groupe en croix accouplement avec Tg (kdrl: grcfp) ZN1; mitfa b692; ednrb1 b140 poissons.
- Faire des plaques d'injection.
- Faire fondre 25 ml de 1,5% d' agarose dans dH 2 O pour chaque plaque.
- Verser 12 ml de l'agarose dans un 100 mm x 15 mm boîte de Pétri et laisser durcir.
- Re-fondre puis verser les agarose restants dans la plaque.
- Immédiatement positionner un moule en verre découpée (3 mm x 7,2 cm de large x 7,5 cm de longueur) de sorte qu'il soit à un angle de 30 degrés par rapport à l'agarose et est positionné au centre de la plaque.
NOTE: Cela va créer une paroi abrupte de 60 ° et une rampe inclinée à 30 °. - Tape le moule en verre en place et laisser durcir agarose.
- Retirez délicatement le moule en verre et faire attention à ne pas déchirer l'agarose.
REMARQUE: Les moules peuvent être stockées dans dH2Û à 4 ° C.
- Equilibrer plaque d'injection avec de l'eau de poisson (0,3 g / L de sel de mer).
- plaque deux fois avec de l'eau distillée de rinçage.
- Equilibrer plaque en ajoutant 10 ml d'eau de poisson à la plaque et placer sur un agitateur pendant 10 min.
- Equilibrer plaque une deuxième fois avec l'eau du poisson.
- Split 2 jours après la fécondation (dpf) embryons dans des groupes d'injection en les transférant dans des boîtes contenant de l' eau du poisson 22.
- Préparer des plats de récupération pour chaque groupe à utiliser après l'injection. Assurez-vous que le bac de récupération contient de l'eau 10 ml de poisson, plus de la pénicilline (25 ug / ml) et streptomycine (50 pg / ml).
- Préparer la solution de tricaïne 2x en ajoutant 4 ml de tampon tricaïne stock (4 mg / ml, Tris 10 mM, pH 7) à 50 ml d'eau du poisson plus de la pénicilline et de la streptomycine.
- Dissoudre 15 mg bas point de fusion d'agarose dans 10 ml de solution de tricaïne 2x pour générer un milieu anesthésique de montage qui immobilisera embryons vivants pour imaging.
NOTE: Montage milieu est constitué de 1,5% d'agarose. - Tirez des aiguilles de microinjection.
- Placer un tube capillaire en verre dans une pipette de traction verticale. Tirez pipettes à long coniques en utilisant 20 courant mAmp et un élément chauffant 2-bobine.
2. Les cellules cancéreuses Étiquetage avec lipophile Fluorescent Dye
- Maintenir les cellules cancéreuses dans leurs conditions de culture recommandées.
REMARQUE: Ces lignes ont été maintenues dans du DMEM + 10% de FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468 et SK-BR-3. Ces lignes ont été maintenues dans RPMI + 10% de FBS: HCC 1806 et T-47D. Toutes les lignées cellulaires ont été maintenues à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant l' incubation. - Générer une suspension monocellulaire en dissociant une culture adhérente des cellules cancéreuses.
- Laver les cellules d'abord avec du PBS, puis traiter avec une solution de trypsine-EDTA 0,05%.
REMARQUE: le temps d'exposition trypsine dépendra de la lignée cellulaire. - Neutraliser la solution de trypsine avec soirhum contenant des milieux de culture cellulaire après que les cellules se détachent.
- Laver les cellules d'abord avec du PBS, puis traiter avec une solution de trypsine-EDTA 0,05%.
- Centrifuger la suspension cellulaire trypsine neutralisée pendant 5 min à 200 x g, puis remettre en suspension le culot cellulaire dans un milieu de culture frais pour le comptage des cellules.
- Compter la suspension cellulaire en utilisant un compteur automatique et préparer 1 million de cellules dans 200 ul de milieu de culture cellulaire.
- Vérifier la viabilité des cellules avec trypan exclusion de colorant bleu avant l'injection dans des embryons de poisson zèbre.
NOTE: Les populations cellulaires seulement viables devraient être injectées dans des embryons de poisson zèbre, comme l'injection de cellules mortes ne reflétera pas vrai invasion vasculaire.
- Vérifier la viabilité des cellules avec trypan exclusion de colorant bleu avant l'injection dans des embryons de poisson zèbre.
- Ajouter 2 pi de colorant lipophile rouge à la suspension de cellules de cancer pour une dilution de 1: 100, bien mélanger, puis incuber le mélange à 37 ° C pendant 20 min.
REMARQUE: La concentration du temps de colorant et le marquage peut avoir besoin d'être optimisé pour chaque lignée cellulaire. - Après l'incubation, ajouter 1 ml de milieu frais dans le tube et puis centrifuger pendant 5 min à200 x g.
- Laver le colorant fluorescent résiduel des cellules cancéreuses.
- Aspirer le surnageant du culot cellulaire, remettre en suspension le culot dans 1 ml de milieu de culture frais, et centrifuger pendant 5 min à 200 x g.
- Répétez l'étape de lavage une seconde fois: aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu frais, puis centrifuger à nouveau pendant 5 min à 200 x g.
- Répétez l'étape de lavage troisième fois: aspirer le surnageant, resuspendre le culot cellulaire dans 1 ml de milieu frais, puis centrifuger à nouveau pendant 5 min à 200 x g.
- Aspirer le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire contenant 1 million de cellules cancéreuses marquées dans 500 pi de milieu frais.
NOTE: 0,5 mM d'EDTA peut être ajouté aux médias pour empêcher l'agglutination des cellules.
3. Les cellules cancéreuses Injecter dans le Sinus pré-cardiaque d'embryons de poissons zèbres
- Fixer le système de distribution de micro-injection à une source d'air sous pression et tourner sur ee microinjection source d'alimentation du système de distribution.
- Pression d'essai en appuyant sur la pédale. Une brève impulsion d'air doit émettre à partir du porte-aiguille.
- Equilibrer les plaques d'injection à deux reprises avec la solution 2x tricaïne.
- Pour chaque étape d'équilibration, ajouter 20 ml de solution de tricaïne 2x à la plaque d'injection et le placer sur agitateur pendant 10 min.
- Utilisez la pipette en plastique pour transférer un groupe d'embryons à un petit plat contenant la solution 2x tricaïne.
- Remblayer l'aiguille d'injection de microinjection avec les cellules cancéreuses à l'aide d'une pipette gel-chargement.
- Placez l'aiguille dans un bocal de stockage d'électrode à l'extrémité pointue vers le bas afin cellules se déposent près de la pointe.
- Transférer 20 - 30 embryons anesthésiés à une plaque d'injection, en recueillant les embryons avec beaucoup de tricaïne 2x dans une pipette en plastique.
- Autoriser les embryons à régler dans la pointe de la pipette.
- gentlemanly expulse les embryons dans le creux de la plaque d'injection, l'étalement des embryons sur toute la longueur de la goulotte.
- Aligner les embryons avec des têtes tournées vers le haut et le ventre face à la paroi abrupte de l'auge.
NOTE: solution de Tricaine devrait couvrir à la fois la longueur de l'auge et la surface d'agarose plat, avec des embryons ne résidant dans l'auge. Embryons sont maintenant prêts pour l'injection.
- Injecter 50 - 100 cellules cancéreuses (2 - 5 nl) dans le sinus précardiaque des embryons de poisson zèbre à l'aide du système de micro-injection de distribution.
- Fixer l'aiguille au support d'aiguille d'un micromanipulateur.
- Positionner la plaque d'injection sous le stéréoscope avec la paroi de 60 degrés vers la gauche et se concentrer sur l'embryon supérieure à 25x grossissement.
- Positionner le micromanipulateur de telle sorte que, lorsqu'il est étendu, l'aiguille percera l'embryon.
- Prolongez l'aiguille à l'oeil jusqu'à ce qu'il soit presque toucher l'embryon.
- Regarder sous le microscope, aligner l'aiguille de sorte tchapeau, il percera l'embryon après prolongation.
- Pierce l'embryon à travers le sac vitellin plaçant la pointe juste au, mais pas dans le sinus pré-cardiaque.
- Injecter des cellules en appuyant sur la pédale. La force de l'injection expulse les cellules dans le sinus cardiaque. Dégager l'aiguille.
- Utilisation de la main droite, étendre et rétracter l'aiguille d'injection. Avec la main gauche, effectuer des réglages fins à la position suivante embryon.
- Retour de l'aiguille dans le pot de stockage de l'électrode lors de la configuration pour injecter une autre plaque.
- Transférer les embryons dans le plat de récupération une fois que la totalité de la plaque est injectée.
- Inclinez la plaque d'injection pour mettre en commun les embryons au fond, le lavage des embryons restants sur l'auge, et la collecte à la pipette en plastique.
- Laisser les embryons se déposer dans le fond de la pipette.
- Transférer les embryons au bac de récupération dans un volume minimal de tricaïne.
- incubate bac de récupération à 28 ° C pendant 1 heure.
- Séparer les embryons de poisson zèbre viables à partir d'embryons morts et d'autres débris.
- Incuber plat à 33 ° C jusqu'au moment de la notation, typiquement 24-96 h.
REMARQUE: Cette température est déterminée comme un compromis entre 37 ° C, la température idéale pour les cellules cancéreuses, et à 28,5 ° C, la température idéale pour le poisson zèbre.
4. La notation extravasation
- Anesthésier le lot d'embryons à être marqué en les plaçant dans un plat avec une solution de tricaïne.
- Placer une larve anesthésiés sur une lame de microscope à dépression dans une goutte de tricaïne.
- larves Orient latéralement pour l'imagerie optimale de la région caudale.
- Comptez le nombre de cellules cancéreuses qui ont envahi avec succès de la vascularisation en se concentrant de haut en bas à travers la région de la queue de discerner clairement les cellules intactes.
NOTE: Il est préférable d'avoir au moins deux personnes impliquées dans tson processus, où l'individu en marquant le poisson est aveugle à la condition expérimentale en cours d'évaluation.- Score des larves sur un microscope à fluorescence composé avec l'objectif 10x. Utilisez l'objectif 20x pour les appels difficiles.
5. Embryons de montage sur des lames et ultérieure Fluorescence Imaging
- Faire fondre la solution d'agarose / de tricaïne 1,5% et porter à 37 ° C.
- Anesthésier l'embryon à imager en le plaçant dans une solution de tricaïne.
- Le transfert de l'embryon dans une goutte de solution de tricaïne à la surface d'imagerie. Vous pouvez éventuellement utiliser un plat ou lame de microscope à fond de verre.
- Utiliser une pipette de verre pour éliminer la solution en excès tricaïne, tout en conservant l'embryon sur la surface d'imagerie.
- Superposez une goutte de solution d'agarose fondu sur l'embryon.
- Rapidement, avant l'agarose polymérise, utilisez un outil délicat, comme une brosse à cils, pour orienter l'embryon latéralement pour l'imagerie, en donnant des soins supplémentairespour assurer l'embryon est aplatie le long de la surface d'imagerie.
- Immerger la goutte d'agarose maintenant polymérisé sous solution de tricaïne.
- Soumettre l'embryon de poisson zèbre en direct à l'imagerie microscopique.
6. Modification: Injecter cellules cancéreuses dans le jaune Sac de Zebrafish Embryons
- Préparer le système et d'injection plaques microinjection de se passer comme décrit précédemment dans la section (3) de ce protocole.
- Etiqueter deux populations cellulaires contrastant avec des colorants fluorescents comme décrit précédemment dans la section (2) de ce protocole.
- Injecter 5 à 10 nl de 2 x 10 ^ 7 cellules / ml dans le sac vitellin. Maintenir constant le volume d'injection pour injecter le nombre de cellules identiques (100 - 200 cellules cancéreuses) de chaque population cellulaire
NOTE: On peut utiliser des embryons de poisson zèbre transparent manquant vasculature fluorescent pour cet essai. entrée passive de particules dans le système vasculaire peut être contrôlé par l'injection des perles fluorescentes (<10 um) ou, modifiernativement, une lignée cellulaire qui n'intravsate pas. - Récupérer les embryons injectés comme décrit précédemment dans la section (3) de ce protocole, puis l'écran pour injections réussies.
- Utilisez un stéréoscope à l'écran et le transfert des embryons viables qui ont été injectés avec succès à un nouveau plat.
NOTE: Tous les embryons doivent avoir une masse de taille constante des cellules situées dans le jaune. Embryons sont rejetées si la taille de masse diffère ou si des cellules sont situées en dehors du jaune. - Transférer les embryons viables à un nouveau plat si les cellules cancéreuses sont clairement visibles dans le sac jaune.
- Utilisez un stéréoscope à l'écran et le transfert des embryons viables qui ont été injectés avec succès à un nouveau plat.
- Incuber plat à 33 ° C jusqu'au moment de la notation, typiquement 24-48 h.
REMARQUE: Cette température est déterminée comme un compromis entre 37 ° C, la température idéale pour les cellules cancéreuses, et à 28,5 ° C, la température idéale pour le poisson zèbre. - Pour marquer intravasation, suivez les instructions décrites dans la section (4) de ce protocole, mais au lieu de compter le nombre de cANCER cellules qui ont envahi avec succès dans le système vasculaire de la région caudale.
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Representative Results
Ici nous avons testé la capacité invasive vasculaire des lignées cellulaires de cancer du sein couramment utilisés dans un modèle d'embryon de poisson zèbre (figure 1). critères rigoureux ont été utilisés dans la notation extravasation pour ces différentes lignées cellulaires, où les événements positifs ont été seulement comptés si les cellules cancéreuses avaient clairement extravasation, cet être fait surtout de limiter les faux positifs qui pourraient découler de marquer les débris cellulaires.
Notre analyse a révélé des différences marquées entre les lignes quand l' invasion a été évaluée 96 h après injection dans le sinus précardiaque (tableau 1). Sur les 7 lignées cellulaires testées, les embryons de poisson zèbre injectés avec la lignée cellulaire MDA-MB-231 ont présenté le plus grand nombre de cellules cancéreuses extravasation par embryon, une conclusion qui est compatible avec la nature métastatique accepté de la ligne (figure 2). Nous avons également constaté que BT-474 cellules facilement invaded dans la région caudale des embryons, alors que d' autres lignées cellulaires telles que les cellules MCF-7, des cellules SK-BR-3 et T-47D, ont été très peu invasive (figure 3). Une découverte curieuse est que près de la moitié des embryons de poisson zèbre injectées avec des cellules MDA-MB-468 avait un œdème dans la région du cardia et ceux-ci n'a pas été marqué. En conséquence, un certain nombre d'embryons injectés avec MDA-MB-468 cellules ont été éliminés avant de trouver suffisamment de spécimens viables qui pourraient être quantifiée par extravasation. Malgré ces différences ostensible, il est notable que l'extravasation est produite à chaque ligne de cellules cancéreuses testées.
En tant que modification du dosage précardiaque des sinus, nous avons réalisé une expérience de compétition dans lequel deux populations de cellules MDA-MB-231 cellules qui diffèrent dans leur capacité invasive vasculaire 26 sont injectées simultanément dans le sac vitellin d'embryons en développement. cellules MDA-MB-231 propagées dans des conditions de culture confluente avantl'injection présentait une réduction intravasculaire dans la circulation sanguine et donc une présence réduite dans la région caudale des embryons à marquer (figure 4).
| Ligne cellulaire | Moy. # Cellules extravasés par Embryo | Gamme |
| MDA-MB-231 (subconfluentes) | 4 | 0-9 |
| BT-474 | 1.5 | 0-4 |
| MDA-MB-468 | 0,7 | 0-6 |
| MCF-7 | 0,6 | 0-2 |
| T-47D | 0,3 | 0-2 |
| HCC1806 | 0,2 | 0-1 |
| SK-BR-3 | 0,1 | 0-1 |
Tableau 1: Comparaison de la capacité invasive vasculaire des lignées cellulaires de cancer du sein en Zebrafish couramment utilisés lignées de cellules de cancer du sein ont été injectés dans le sinus précardiaque de 2 jours anciens embryons de poisson zèbre et a reçu 4 jours plus tard. Les cellules cancéreuses envahissent le système vasculaire et dans la région caudale ont été quantifiés en 10 embryons par la lignée cellulaire. Le nombre moyen de cellules cancéreuses extravasation est indiqué ainsi que la gamme.
Figure 1. visuelle Résumé du Cancer Cell Zebrafish extravasation Assay. Dans cet essai, les cellules cancéreuses sont marquées avec un colorant fluorescent et injecté dans le sinus précardiaque de 2 jours anciens embryons de poisson zèbre, dont la vascularisation est marquée par un fluorescent reporter contrastante. À la suite de 2 - 4 jours supplémentaires, les cellules cancéreuses qui ont envahi dans la région caudale de l'embryon sontmarqué et peut être monté dans un milieu d'agarose anesthésique pour l'imagerie ultérieure. Chaque étape représentée dans cette correspond schématiques à une section du protocole. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Mosaïque d' images d'un embryon de poisson zèbre 4 jours après injection avec MDA-MB-231 cellules. Brightfield (A) et (B) fluorescentes mosaïques représentées. des images fluorescentes sont représentées par la projection maximale d'une pile en Z, dans lequel une couleur verte représente la vasculature et une couleur rouge indique que les cellules cancéreuses. Barre d'échelle, 200 um. (C) région caudale de l'embryon est amplifié pour montrer les cellules cancéreuses extravasation. Punctate marquage fluorescent est visible sur magnification. Barre d'échelle, 50 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Exemple de résultats expérimentaux. Ici , l' extravasation est démontrée dans un embryon injecté avec des cellules cancéreuses BT-474 , mais non dans un embryon injecté avec MCF-7, SK-BR-3 des cellules cancéreuses, et T-47D. Arrowheads désignent les cellules extravasation. Barre d'échelle, 100 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4. intravasculaire de MDA-MB-231 populations de cellules 2 jours after Yolk Sac Injection. (A) Yolk sac vert (invasive) et rouge (moins invasive) étiqueté MDA-MB-231 cellules. (B) La région caudale avec MDA-MB-231 cellules qui ont envahi la vasculature pour atteindre la queue région. (C) le nombre d'embryons de poisson zèbre avec intravasated MDA-MB-231 cellules dans la région caudale 2 jours après l' injection 26. Les barres d'échelle, 250 um. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Cette technique utilise le modèle zebrafish pour tester efficacement la capacité invasive vasculaire des cellules cancéreuses (voir Figure 1). Ici , nous avons appliqué la technique à un panel de lignées cellulaires de cancer du sein, afin de fournir une base sur laquelle d' autres chercheurs peuvent alors construire leurs propres études (voir le tableau 1, figures 2 - 3). L'observation que MDA-MB-231 cellules facilement envahi dans la région caudale d'embryons de poisson zèbre rendrait cette lignée cellulaire idéal pour les agents qui pourraient inhiber l'invasion vasculaire test. lignées cellulaires Comparativement moins invasives, comme HCC1806 ou MDA-MB-468 cellules par exemple, pourraient être utilisées pour étudier les facteurs qui seraient autrement potentialiser l'invasion vasculaire. Si ces types d'expériences exigent l'inclusion de médicaments, alors on a deux voies distinctes de livraison, selon que l'effet attendu de traitement pour être durable. Les cellules cancéreuses peuvent être prétraitées avec le médicament avant l'injection dansles embryons et le médicament peuvent être directement ajoutés à l'eau logeant les embryons où il aura un impact des cellules cancéreuses par diffusion.
Dans notre comparaison, nous avons analysé l'extravasation des cellules cancéreuses dans l'embryon de queue de poisson zèbre 96 h après injection dans le sinus précardiaque. Pour le test de compétition de cellules MDA-MB-231, intravasation en circulation a été évaluée 48 heures après l'injection du sac vitellin. Les timepoints choisis pour l'analyse nécessitent généralement l'optimisation pour chaque lignée cellulaire où, pour certaines expériences, le pic extravasation peut se produire seulement 24 heures après l'injection. Il convient de noter que les embryons de poisson zèbre ont un système immunitaire inné fonctionnelle lorsqu'elles sont injectées avec des cellules cancéreuses 27 et, par conséquent, les débris de fluorescence à partir des cellules cancéreuses peut être englouties par les cellules immunitaires telles que les macrophages ou les cellules neutrophiles. L'activité du système immunitaire inné peut donc potentiellement créer un étiquetage fluorescent faux positif lors d'une tentative de marquer extravasation; il faut prendre soin de ne marquer que les cellules fluorescentes robuste dans le canal approprié. Puisque la recherche sur le cancer en cours est impliquant le système immunitaire dans le renforcement de métastases du cancer 28, le modèle d'embryon de poisson zèbre peut fournir des aperçus uniques dans ce domaine en permettant l' examen de la diaphonie se produisant entre les cellules cancéreuses et le système immunitaire inné. Cette idée est illustrée par un couple d'études récentes. La première de ces études ont démontré que l' inhibition du VEGFR à l'intérieur du poisson zèbre a amélioré la capacité des neutrophiles à obtenir un comportement métastatique de cellules cancéreuses 29. Une seconde étude a montré que la chimiokine immunitaire CXCR4 CXL12 axe de signalisation est intact à l'intérieur du poisson zèbre, comme le récepteur sur des cellules cancéreuses humaines a été capable de détecter et de répondre au ligand du poisson zèbre 30, et l'expression de CXCR4 dans les cellules cancéreuses en corrélation avec leur capacité invasive dans le modèle animal. En outre, il a été démontré que les macrophages de poisson zèbre exposited une Réponse chimiotactique vers CXCL12 humaine. Une souche d'embryon de poisson zèbre avec les neutrophiles marqués par fluorescence 31, par exemple, pourrait être utilisée pour explorer davantage les interactions de cellules cancéreuses avec le système immunitaire dans ce modèle.
Quelques étapes du protocole nécessitent une attention particulière. Tout d'abord, il est essentiel que les cellules cancéreuses être dissociées en une suspension monocellulaire afin d'empêcher le colmatage de l'aiguille lors de l'injection dans des embryons. agrégats cellulaires peuvent également bloquer la circulation du sang et interférer avec la capacité des cellules cancéreuses de se déplacer dans la région caudale, faussant ainsi l'analyse. agrégats cellulaires peuvent également induire des vaisseaux sanguins à la rupture et, si cela se produit, marquant la capacité invasive des cellules cancéreuses vivantes dans ces régions est ni fiable ni recommandé. Un autre problème potentiel concerne le marquage des cellules cancéreuses avec le colorant fluorescent. Dans les expériences gérées par notre laboratoire, nous avons constaté que les colorants lipophiles,comme Dil par exemple, ont tendance à produire le meilleur étiquetage, mais son niveau de fluorescence peut varier entre les lignées cellulaires. Pour cette raison, le marquage fluorescent des cellules cancéreuses doivent être optimisées avant l'injection dans les embryons afin d'éviter une sur-étiquetage. Il est essentiel que le colorant en excès est éliminé par lavage des cellules cancéreuses après avoir été marqué, ce qui est réalisé par les différentes étapes de centrifugation décrites dans la section d'étiquetage du protocole; ces étapes peuvent sembler superflue, mais elles sont absolument nécessaires. Trop colorant fluorescent peut être toxique pour les cellules ou une fuite dans la circulation sanguine, la production d'un fond fluorescent artifactual. Beaucoup de ces problèmes peuvent être contournés par l'utilisation de cellules cancéreuses exprimant des protéines fluorescentes, et il est recommandé que ces systèmes soient utilisés en lieu et place du colorant fluorescent lorsque cela est possible. Enfin, lors de la notation des embryons pour extravasation de cancer, il est impératif d'appliquer des critères uniformes pour toutes les conditions. Nous trouvons eà impliquer au moins deux personnes dans l'étape de notation contribue à maintenir la rigueur scientifique: une personne est chargée de préparer les diapositives et l'enregistrement des résultats, tandis que l'autre personne rend le verdict de extravasation et est maintenu aveugle à l'état en cours d'évaluation. Lors de l'évaluation, on peut soit quantifier les cellules cancéreuses extravasation dans la région de queue ou de créer des critères binaires pour faciliter la comparaison. Fluorescence teindre les cellules cancéreuses produit étiquetage punctate qui sera visible à très fort grossissement (figure 2c), bien que les cellules entières sont plus faciles à discerner à faible grossissement (figure 3), ce dernier qui est recommandé pour la notation. A en juger les cas les plus ambiguës de l'extravasation peut être facilité par l'acquisition de tranches optiques sur un microscope confocal, où l'extravasation quantifiant comme un pour cent de toutes les cellules dans la région de la queue peut contrôler une charge inégale des cellules cancéreuses dans l'embryon.
Le yolk sac voie d'injection est différent du sinus précardiaque car elle permet un plus grand nombre de cellules et donc une meilleure recevant l'hétérogénéité au sein d'une population cellulaire. Comme on le voit sur la figure 4, plusieurs populations de cellules marquées de façon différentielle peuvent être injectés simultanément dans le sac vitellin de comparer leur capacité invasive et le motif. La capacité angiogénique des cellules injectées et d'améliorer le recrutement des vaisseaux sanguins peuvent faciliter l'entrée des cellules cancéreuses dans la région de la queue, mais cet aspect n'a pas encore été analysés. Techniquement, le jaune injections sac sont plus faciles à réaliser que d'une injection précardiaque des sinus si, d'autre part, la vésicule ombilicale est un environnement riche en nutriments qui peuvent entraver la sortie des cellules cancéreuses. Il est également possible que l'injection à proximité de vaisseaux sanguins dans le jaune peut prématurément introduire des cellules cancéreuses dans la circulation et, par conséquent, il faut soigneusement dépister les injections bâclées et d'omettre ces embryons de marquer. Enfin, il est important de to noter que le microenvironnement jaune est quelque peu artificielle, car il manque un site primaire analogue chez les souris ou les humains.
Les divers systèmes de modèles visant à prédire les métastases cancéreuses ne sont pas sans leurs avantages et inconvénients, et le dosage de l'extravasation du poisson zèbre ne fait pas exception. Comme un avantage majeur, ce test permet d'évaluer la capacité invasive vasculaire dans un système circulatoire fonctionnel et peut répondre à des questions expérimentales après seulement quelques jours. Compte tenu du temps de réponse rapide, un tel système pourrait être utilisé pour sonder le comportement agressif des lignées cellulaires établies, non seulement, mais aussi des échantillons provenant de patients atteints de cancer humain fraîchement isolés. L'inconvénient majeur est que ce modèle omet les événements les plus anciens et les plus récentes de la cascade métastatique en se concentrant uniquement sur l'invasion vasculaire. En outre, les cellules cancéreuses humaines injectées dans ces embryons de poisson zèbre sont évidemment ne fonctionnent pas dans un milieu syngénique et certaines interactions avec til stroma peut par conséquent être perdu. Malgré ces limites, le modèle d'embryon de poisson zèbre a une place méritée dans la recherche fondamentale et translationnelle du cancer, comme nous l' avons utilisé le montrer un rôle pour l'Hippo voie de signalisation 26 et de la kératine protéine associée 5-5 32 dans la capacité invasive vasculaire du cancer cellules. Par conséquent, ce modèle a le potentiel pour aider l'enquête sur une caractéristique métastatique clé du cancer de stade avancé.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Life Technologies | 25300-054 | |
| 100 mm Dishes | Corning Incorporated | 3160-100 | |
| 5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass | Fisher Brand | 13-678-20B | |
| 60 mm Dish | Corning Incorporated | 3160-60 | |
| Agarose, Low Melting | Fisher | BP165-25 | |
| Agarose, Molecular Grade | Bioline | BIO-41026 | |
| Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" | A-M Systems, Inc | 627000 | |
| David Kopf 700C Vertical Pipette Puller | Hofstra Group | 3600 | |
| DMEM | Life Technologies | 11995-065 | |
| Electrode Storage Jar, 1.0 mm | World Precision Instruments, Inc | E210 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) | Fluka | A5040 | |
| Eyelash Brush | Ted Pella, Inc | 113 | |
| Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated | Omega Scientific | FB-12 | |
| Fisherbrand Transfer Pipettes | ThermoFisher Scientific | 13-711-7M | |
| Gel Loading Pipet Tips | Fisher Brand | 02-707-181 | |
| Glass Bottom Dishes (12.0 mm) | ThermoFisher Scientific | 150680 | |
| Glass Depression Slide | VWR | 470005-634 | |
| Instant Ocean Salt, Sea Salt | Pentair | IS50 | |
| Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 | Heathrow Scientific | HS20622B | |
| SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| Micromanipulator | Narishige | ||
| Eclipse E600 | Nikon | ||
| PBS | Life Technologies | 10010-023 | |
| Penicillin-G Potassium | Fisher Biotech | BP914-100 | |
| Petri Plates, 100 mm x 15 mm | Fisher Brand | FB0875713 | |
| Picospritzer II | General Valve Corporation | ||
| RPMI 1640 Medium | Life Technologies | 11875-093 | |
| Streptomycin Sulfate | Fisher Biotech | BP910-50 | |
| Vybrant DiI | ThermoFisher Scientific | V22885 | |
| Vybrant DiO | ThermoFisher Scientific | V22886 | |
| Zebrafish | Georgetown Zebrafish Shared Resources | ||
| Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS. |
References
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