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Cancer Research

परीक्षण संवहनी इनवेसिव (Zebrafish में कैंसर कोशिकाओं की क्षमता doi: 10.3791/55007 Published: November 3, 2016

Summary

इस विधि को कुशलता से कैंसर की कोशिकाओं की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए zebrafish भ्रूण का इस्तेमाल करता है। फ्लोरोसेंट कैंसर की कोशिकाओं को विकसित भ्रूण के precardiac साइनस या जर्दी थैली में इंजेक्ट कर रहे हैं। कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण और परिस्त्राव 24 करने के लिए 96 घंटा के बाद में पूंछ क्षेत्र के प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मूल्यांकन किया है।

Introduction

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Metastatic रोग कैंसर से मृत्यु और कई तंत्र है कि कैंसर कोशिका प्रसार सक्षम 1 की खोज की जा करने के लिए रहने का एक प्रमुख कारण है। एक कैंसर सेल के लिए आदेश में सफलतापूर्वक metastasize करने के लिए, यह पहली बार है कि एक स्ट्रोमा प्राथमिक ट्यूमर के चारों ओर, (intravasate) दर्ज संचार प्रणाली में के माध्यम से आक्रमण करना होगा, प्रचलन से पारगमन, बाहर निकलें (बहना) में जीवित है, और अंत में एक व्यवहार्य कॉलोनी की स्थापना दूर के अंग साइट पर 2। Intravasation और परिस्त्राव इस प्रकार मेटास्टेटिक झरना में महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं, फिर भी हर कैंसर कोशिका में खलल न डालें और endothelial जंक्शनों 3 के माध्यम से पलायन पर स्वाभाविक रूप से दक्ष नहीं है। वास्तव में, वहाँ अद्वितीय चयन दबाव है कि कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण के चारों ओर और आगे की प्रक्रिया 4 अंतर्जात और exogenous कारकों की एक किस्म से प्रभावित किया जा सकता है की एक श्रृंखला रहे हैं। इन कारणों के लिए, तकनीक है कि उन्नत चरण के कैंसर के आक्रामक व्यवहार की जांच अक्सर वी पर ध्यान केंद्रितमेटास्टेटिक प्रसार भविष्यवाणी करने के लिए एक साधन के रूप में आक्रामक क्षमता ascular।

विभिन्न मॉडल प्रणाली इन विट्रो में कैंसर सेल संवहनी आक्रमण के अध्ययन की सुविधा के लिए मौजूद हैं। सबसे विट्रो assays में इस्तेमाल कैंसर की कोशिकाओं को 6 से एक अक्षुण्ण endothelial monolayer के वास्तविक समय व्यवधान की निगरानी के लिए एक endothelial बाधा 5 या इलेक्ट्रिक सेल सब्सट्रेट मुक़ाबला सेंसिंग (ECIS) तकनीक के माध्यम से कैंसर सेल प्रवास का आकलन करने के लिए या तो शामिल transwell सिस्टम। ये assays आम तौर पर तरल गतिकी और stromal कारक है कि अन्यथा एक endothelial दीवार से कैंसर सेल लगाव प्रभाव होगा की कमी है। यह समस्या कुछ हद तक perfusable संवहनी नेटवर्क है कि stromal कोशिकाओं के समर्थन के साथ endothelia के 3 डी संस्कृति से उठता रोका जाता है, और इन 3 डी सिस्टम microfluidic अब वर्तमान में इन विट्रो विकल्प 7.8 के मामले में सबसे आगे प्रतिनिधित्व करते हैं। फिर भी, इन तरीकों एक कार्यात्मक संचार प्रणाली के मजबूत microenvironment न आनाऔर इसलिए केवल इन विवो मॉडल के लिए भाग स्थानापन्न में।

सबसे व्यापक रूप से संवहनी आक्रमण के vivo मॉडल में इस्तेमाल माउस, जिसमें प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays आमतौर पर प्रदर्शन कर रहे हैं, क्योंकि वे अपेक्षाकृत कम timescales पर होते हैं और मेटास्टेटिक क्षमता 9 के आम तौर पर संकेत कर रहे है। ये assays संचलन में कैंसर कोशिकाओं के प्रत्यक्ष इंजेक्शन शामिल है और इसलिए मेटास्टेसिस, अंगों की अर्थात् परिस्त्राव और कैंसर कोशिका उपनिवेशवाद का अंत चरणों मॉडल। प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays कैंसर सेल इंजेक्शन के स्थल के आधार पर अलग और अंगों अंततः का विश्लेषण किया। पहली परख प्रकार में, कैंसर की कोशिकाओं को फेफड़ों में चूहों और कैंसर सेल बोने की पूंछ नस में इंजेक्शन हैं 10,11 नजर रखी है। दूसरी परख हड्डी microenvironment 12-14 की ओर मेटास्टेटिक बोने को निर्देशित करने के intracardiac इंजेक्शन प्रदर्शन शामिल है, लेकिन यह भी मस्तिष्क 15। तीसरे परख में, कैंसर गएल आदेश जबकि मन्या धमनी में चौथे वितरण मार्ग मस्तिष्क 17,18 करने के लिए कैंसर की कोशिकाओं को किया जाता है जिगर 16 के औपनिवेशीकरण की अनुमति के लिए में तिल्ली में इंजेक्ट कर रहे हैं। कैंसर कोशिका वितरण पद्धति के चाहे, अंग बसाना स्वीकार कर लिया प्रयोगात्मक समापन बिंदु है और आम तौर पर luminescence, ऊतक विज्ञान, या पीसीआर आधारित तकनीक के माध्यम से निर्धारित किया जाता है। एक murine मेजबान के भीतर प्रायोगिक मेटास्टेसिस assays के संचालन के शारीरिक लाभ के बावजूद, इन प्रयोगों अभी भी सप्ताह महीने तक पूरा करने और विश्लेषण करने की आवश्यकता होती है।

Zebrafish (Danio rerio) मॉडल ने हाल ही में कैंसर की प्रगति 19,20 अध्ययन करने के लिए एक नई प्रणाली के रूप में उभरा है, और जब चूहों 21-24 के साथ तुलना में एक बहुत छोटा timescale पर एक कार्यात्मक संचार प्रणाली के भीतर कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण के आकलन के लिए अनुमति देता है। विधि एक पारदर्शी zebrafish तनाव है कि एक हरे रंग की चट्टान मूंगा Fluo के साथ टैग अपने endothelia गया है इस्तेमालrescent प्रोटीन संवाददाता kdrl प्रमोटर, संवहनी endothelial वृद्धि कारक 25 zebrafish रिसेप्टर द्वारा संचालित। परख में, कैंसर की कोशिकाओं को एक लाल फ्लोरोसेंट मार्कर के साथ लेबल और 2 दिन पुराने भ्रूण के precardiac साइनस में इंजेक्ट कर रहे हैं। 48 से 96 घंटा के बीच कहीं भी इंजेक्शन के बाद, कैंसर कोशिकाओं है कि वाहिका के बाहर और भ्रूण की दुम क्षेत्र में आक्रमण किया है एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप पर कुशलता से रन बनाए जा सकते हैं। यहाँ हम उनकी नाड़ी आक्रामक क्षमता में निरा मतभेद प्रदर्शित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल मानव स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल के लिए तकनीक लागू होते हैं। इसके अलावा, हम दिखाना है कि भ्रूण की जर्दी थैली को इंजेक्शन साइट बदलते विषम सेल बातचीत के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, के रूप में कैंसर सेल आबादी विभिन्न फ्लोरोसेंट रंगों के साथ लेबल किया जा सकता और फ्लोरोसेंट वाहिका कमी zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया। इस बाद परख में, कैंसर कोशिकाओं है कि जर्दी पर आक्रमण किया है और vasculatur में intravasatedई इंजेक्शन के बाद 48 घंटे के लिए दुम क्षेत्र में 24 रन बनाए हैं। प्रभावशीलता और इस मॉडल की सुविधा की वजह से, zebrafish तेजी से तेजी से एक शारीरिक सेटिंग के तहत कैंसर की कोशिकाओं की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए कार्यरत हैं।

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Protocol

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आचार कथन: zebrafish भ्रूण एक अनुमोदित IACUC प्रोटोकॉल के अनुसार उत्पन्न किया गया। इन प्रयोगों जॉर्ज टाउन विश्वविद्यालय के पशु की देखभाल और उपयोग समिति की सिफारिशों के अनुपालन में किया गया।

1. इंजेक्शन के लिए भ्रूण को व्यवस्थित करें और शेयर समाधान बनाने

  1. कैंसर कोशिका संवहनी आक्रमण का आकलन करने के लिए अपेक्षित zebrafish लार्वा उत्पन्न करता है।
    1. Mitfa b692; ednrb1 b140 मछली: (grcfp kdrl) zn1 टीजी के साथ जोड़ी वार या समूह में पार संभोग सेट करें।
      नोट: हम टीजी उत्पन्न (kdrl: grcfp) zn1; mitfa b692; ednrb1 b140 zebrafish, टीजी (kdrl: grcfp) पार करके zn1 25 है, जो endothelial कोशिकाओं में हरे रंग की चट्टान मूंगा फ्लोरोसेंट प्रोटीन एक्सप्रेस, एक पंक्ति है कि वर्णक कोशिकाओं का अभाव है, mitfa साथ b692; ednrb1 b140, zebrafish अंतर्राष्ट्रीय संसाधन केंद्र में विकसित किया है।
    2. सहllect अंडे, स्वच्छ, और unfertilized या विकृत भ्रूण 22 अगले दिन हटा दें।
    3. कैंसर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन के लिए तैयार है जब तक 28.5 डिग्री सेल्सियस पर भ्रूण सेते हैं, तब हो सकता है जब zebrafish भ्रूण 2-दिन हैं बाद निषेचन (2 DPF)।
  2. इंजेक्शन प्लेटों बनाओ।
    1. एक थाली के लिए DH 2 हे में 1.5% agarose के 25 मिलीलीटर पिघला।
    2. एक 100 मिमी x 15 मिमी पेट्री डिश में agarose की 12 मिलीलीटर डालो और यह कड़ा करते हैं।
    3. पुनः पिघल तो थाली में शेष agarose डालो।
    4. इसके तत्काल बाद एक कट ग्लास ढालना (3 मिमी x 7.2 सेमी चौड़ा x 7.5 सेमी लंबे) की स्थिति तो यह है कि यह agarose करने के लिए एक 30 डिग्री के कोण पर है और थाली के केंद्र में तैनात।
      नोट: यह एक तेजी से 60 डिग्री की दीवार और एक 30 डिग्री ढलान का रैंप का निर्माण करेगा।
    5. जगह में कांच ढालना टेप और agarose कठोर करते हैं।
    6. धीरे गिलास मोल्ड हटाने और agarose आंसू नहीं सावधान रहना होगा।
      नोट: Molds 4 डिग्री सेल्सियस पर DH 2 हे में संग्रहित किया जा सकता है।
  3. मछली पानी (0.3 ग्राम / एल समुद्री नमक) के साथ इंजेक्शन थाली संतुलित करना।
    1. कुल्ला प्लेट आसुत जल के साथ दो बार।
    2. 10 मिनट के लिए प्लेट और शेखर पर जगह पर मछली पानी की 10 मिलीलीटर जोड़कर प्लेट संतुलित करना।
    3. प्लेट संतुलित करना मछली पानी के साथ एक दूसरी बार।
  4. उन्हें मछली पानी 22 से युक्त व्यंजन में स्थानांतरित द्वारा इंजेक्शन समूहों में 2 दिन बाद निषेचन (DPF) भ्रूण विभाजित।
  5. इंजेक्शन के बाद का उपयोग करने के लिए प्रत्येक समूह के लिए वसूली व्यंजन तैयार करें। सुनिश्चित करें कि वसूली पकवान 10 मिलीलीटर पानी मछली, प्लस पेनिसिलिन (25 माइक्रोग्राम / एमएल) और स्ट्रेप्टोमाइसिन (50 माइक्रोग्राम / एमएल) शामिल हैं।
  6. मछली पानी के साथ साथ पेनिसिलिन और स्ट्रेप्टोमाइसिन के 50 मिलीलीटर के लिए बफर स्टॉक tricaine (4 मिलीग्राम / एमएल, 10 मिमी Tris, पीएच 7) के 4 मिलीलीटर जोड़कर 2x tricaine समाधान तैयार है।
  7. 2x tricaine समाधान के 10 मिलीलीटर में 15 मिलीग्राम कम पिघलने बिंदु agarose भंग एक बढ़ते संवेदनाहारी माध्यम है कि कल्पना के लिए जीना भ्रूण स्थिर होगा उत्पन्न करने के लिएजी।
    नोट: बढ़ते मध्यम 1.5% agarose के होते हैं।
  8. microinjection सुइयों खींचो।
    1. एक ऊर्ध्वाधर पिपेट खींचने में कांच केशिका ट्यूबिंग रखें। 20 MAMP वर्तमान और एक 2-तार हीटिंग तत्व का उपयोग लंबे पतला pipettes खींचो।

2. lipophilic फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल कैंसर कोशिकाओं

  1. उनकी सिफारिश संस्कृति की स्थिति में कैंसर की कोशिकाओं को बनाए रखें।
    नोट: इन लाइनों DMEM में 10% FBS बनाए रखा गया: BT-474, MCF 7, एमडीए MB-231, एमडीए MB-468, और एस-BR-3। इन लाइनों RPMI + 10% FBS में बनाए रखा गया: एचसीसी 1806 और टी-47D। सभी सेल लाइनों ऊष्मायन के दौरान 37 सी और 5% सीओ 2 में बनाए रखा गया।
  2. कैंसर कोशिकाओं के एक पक्षपाती संस्कृति अलग से एक एकल कोशिका निलंबन उत्पन्न करता है।
    1. पीबीएस के साथ पहली बार कोशिकाओं को धो लें और फिर 0.05% trypsin EDTA समाधान के साथ व्यवहार करते हैं।
      ध्यान दें: ट्रिप्सिन जोखिम समय सेल लाइन पर निर्भर करेगा।
    2. एसई के साथ trypsin समाधान बेअसररम युक्त सेल संस्कृति मीडिया कोशिकाओं को अलग करने के बाद।
  3. 200 XG पर 5 मिनट के लिए trypsin-निष्प्रभावी सेल निलंबन अपकेंद्रित्र, तो सेल गिनती के लिए ताजा संस्कृति मीडिया में सेल गोली resuspend।
  4. सेल निलंबन गणना एक स्वचालित काउंटर का उपयोग और सेल संस्कृति मीडिया के 200 μl में 1 लाख कोशिकाओं को तैयार।
    1. zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन से पहले trypan नीले रंग की डाई बहिष्कार के साथ सेल व्यवहार्यता की जाँच करें।
      नोट: केवल व्यवहार्य सेल आबादी मृत कोशिकाओं के इंजेक्शन सच संवहनी आक्रमण को प्रतिबिंबित नहीं करेगा के रूप में, zebrafish भ्रूण में इंजेक्ट किया जाना चाहिए।
  5. , 100 कमजोर पड़ने मिश्रण अच्छी तरह से, और फिर 20 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रण सेते एक 1: के लिए कैंसर सेल निलंबन के लिए लाल lipophilic डाई के 2 μl जोड़ें।
    नोट: डाई और लेबलिंग समय की एकाग्रता प्रत्येक कोशिका लाइन के लिए अनुकूलित किया जाना पड़ सकता है।
  6. ऊष्मायन के बाद, ट्यूब के लिए ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ने और फिर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र200 x जी।
  7. कैंसर की कोशिकाओं से अवशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक दूर धो लें।
    1. महाप्राण सेल गोली से सतह पर तैरनेवाला, 200 x जी पर 5 मिनट के लिए ताजा संस्कृति मीडिया के 1 मिलीलीटर में गोली, और सेंट्रीफ्यूज resuspend।
    2. सेंट्रीफ्यूज फिर 200 x जी पर 5 मिनट के लिए सतह पर तैरनेवाला aspirate, ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और उसके बाद: वाशिंग चरण को दोहराएँ एक दूसरी बार।
    3. 200 x जी पर 5 मिनट के लिए फिर से सतह पर तैरनेवाला अपकेंद्रित्र aspirate, ताजा मीडिया के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend और उसके बाद: दोहराएँ धोने कदम तीसरी बार।
  8. सतह पर तैरनेवाला Aspirate और ताजा मीडिया के 500 μl में 1 लाख लेबल कैंसर कोशिकाओं से युक्त सेल गोली resuspend।
    नोट: 0.5 मिमी EDTA सेल clumping को रोकने के लिए मीडिया को जोड़ा जा सकता है।

3. zebrafish भ्रूण की पूर्व हृदय साइनस में इंजेक्शन लगाने कैंसर कोशिकाओं

  1. एक दबाव हवा के स्रोत के लिए microinjection बांटना प्रणाली देते हैं और वें पर बारीई microinjection बांटना प्रणाली शक्ति का स्रोत है।
    1. पैर पेडल निराशाजनक द्वारा टेस्ट दबाव। हवा का एक संक्षिप्त पल्स सुई धारक से फेंकना चाहिए।
  2. 2x tricaine समाधान के साथ दो बार इंजेक्शन प्लेटों संतुलित करना।
    1. प्रत्येक संतुलन कदम के लिए, 10 मिनट के लिए एक प्रकार के बरतन पर इंजेक्शन की थाली और जगह पर 2x tricaine समाधान के 20 मिलीलीटर जोड़ें।
  3. 2x tricaine समाधान युक्त एक छोटी सी डिश के लिए भ्रूण के एक समूह के हस्तांतरण करने के लिए प्लास्टिक पिपेट का प्रयोग करें।
  4. एक जेल लोडिंग pipet टिप का उपयोग कर कैंसर कोशिकाओं के साथ microinjection इंजेक्शन सुई backfill।
    1. अंत बताया नीचे का सामना करना पड़ इतने कोशिकाओं टिप के पास बसने के साथ एक इलेक्ट्रोड भंडारण जार में सुई रखें।
  5. स्थानांतरण 20 - 30 एक प्लास्टिक पिपेट में 2x tricaine के बहुत से भ्रूण को इकट्ठा करके एक इंजेक्शन की थाली के लिए anesthetized भ्रूण।
    1. भ्रूण पिपेट की नोक में बसने की अनुमति दें।
    2. सज्जनLy इंजेक्शन थाली के गर्त में भ्रूण को निष्कासित, गर्त की लंबाई के साथ भ्रूण फैल गया।
    3. गर्त की खड़ी दीवार का सामना करना पड़ सामना करना पड़ रहा सिर और पेट के साथ भ्रूण संरेखित करें।
      नोट: Tricaine समाधान भ्रूण केवल गर्त में रहने के साथ, दोनों गर्त लंबाई और फ्लैट agarose सतह को कवर करना चाहिए। भ्रूण अब इंजेक्शन के लिए तैयार हैं।
  6. microinjection बांटना प्रणाली का उपयोग zebrafish भ्रूण की precardiac साइनस में - (5 nl 2) 100 कैंसर की कोशिकाओं - 50 इंजेक्षन।
    1. एक micromanipulator की सुई धारक के लिए सुई संलग्न।
    2. बाईं ओर 60 डिग्री दीवार के साथ स्टिरियोस्कोप के तहत इंजेक्शन थाली स्थिति और 25x बढ़ाई शीर्ष भ्रूण पर ध्यान केंद्रित।
    3. micromanipulator स्थिति इतनी है कि, जब बढ़ाया, सुई भ्रूण पियर्स होगा।
    4. जब तक यह लगभग भ्रूण को छू रहा है आंखों से सुई बढ़ाएँ।
    5. माइक्रोस्कोप के नीचे देख, इसलिए टी सुई संरेखितटोपी इसे आगे विस्तार पर भ्रूण पियर्स होगा।
    6. पियर्स बस टिप रखने की जर्दी थैली के माध्यम से भ्रूण, लेकिन नहीं, पूर्व हृदय साइनस।
    7. पैर पेडल निराशाजनक द्वारा कोशिकाओं इंजेक्षन। इंजेक्शन के बल हृदय साइनस में कोशिकाओं expels। सुई वापस लेना।
    8. दाहिने हाथ का उपयोग, विस्तार और इंजेक्शन सुई वापस लेना। बाएं हाथ के साथ, अगले भ्रूण की स्थिति के लिए ठीक समायोजन करें।
    9. की स्थापना, जबकि एक अन्य प्लेट इंजेक्षन करने के लिए इलेक्ट्रोड भंडारण जार करने के लिए सुई लौटें।
  7. वसूली डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण एक बार पूरी थाली इंजेक्ट किया जाता है।
    1. तल पर भ्रूण पूल करने के लिए, गर्त से बाहर किसी भी शेष भ्रूण धोने, और उन्हें प्लास्टिक विंदुक के साथ एकत्रित इंजेक्शन थाली झुकाएँ।
    2. भ्रूण पिपेट के तल में व्यवस्थित करने के लिए अनुमति दें।
    3. tricaine की एक न्यूनतम मात्रा में वसूली डिश के लिए भ्रूण स्थानांतरण।
  8. Incuba1 घंटे के लिए 28 डिग्री सेल्सियस पर ते वसूली पकवान।
    1. मृत भ्रूण और अन्य मलबे से अलग व्यवहार्य zebrafish भ्रूण।
  9. 96 घंटा -, स्कोरिंग के लिए तैयार आम तौर पर 24 तक 33 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं।
    नोट: यह तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के बीच, कैंसर की कोशिकाओं के लिए आदर्श तापमान, और 28.5 डिग्री सेल्सियस, zebrafish के लिए आदर्श तापमान एक समझौते के रूप में चुना गया है।

4. स्कोरिंग परिस्त्राव

  1. असंवेदनता भ्रूण के बैच उन्हें tricaine समाधान के साथ एक थाली में रखकर रन बनाए किया जाना है।
  2. एक अवसाद माइक्रोस्कोपी स्लाइड पर एक anesthetized लार्वा tricaine की एक बूंद में रखें।
    1. दुम क्षेत्र का इष्टतम इमेजिंग के लिए ओरिएंट लार्वा laterally।
  3. कैंसर की कोशिकाओं को सफलतापूर्वक पूंछ क्षेत्र के माध्यम से ऊपर और नीचे ध्यान केंद्रित स्पष्ट रूप से बरकरार कोशिकाओं विचार करने से वाहिका से बाहर आक्रमण किया है की संख्या की गणना।
    नोट: यह सबसे अच्छा है कम से कम दो टी में शामिल व्यक्तियों के लिए हैउसकी प्रक्रिया है, जहां व्यक्ति मछली स्कोरिंग प्रयोगात्मक हालत के लिए अंधा होता है का आकलन किया जा रहा है।
    1. 10x उद्देश्य लेंस के साथ एक यौगिक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी पर लार्वा स्कोर। किसी भी मुश्किल कॉल के लिए 20x उद्देश्य का उपयोग करें।

5. स्लाइड और इसके बाद प्रतिदीप्ति इमेजिंग पर बढ़ते भ्रूण

  1. 1.5% agarose / tricaine समाधान पिघला और 37 डिग्री सेल्सियस तक लाने के लिए।
  2. भ्रूण anesthetize tricaine समाधान में रखकर imaged किया जाना है।
  3. इमेजिंग सतह के लिए tricaine समाधान की एक बूंद में भ्रूण स्थानांतरण। वैकल्पिक रूप से एक गिलास नीचे डिश या खुर्दबीन स्लाइड का उपयोग करें।
  4. अतिरिक्त tricaine समाधान निकालने के लिए, इमेजिंग सतह पर भ्रूण को बनाए रखना एक गिलास पिपेट का प्रयोग करें।
  5. भ्रूण पर पिघल agarose समाधान की एक बूंद ओवरले।
  6. जल्दी, इससे पहले agarose polymerizes, एक नाजुक उपकरण, एक बरौनी ब्रश की तरह, का उपयोग इमेजिंग के लिए laterally भ्रूण ग्रहण करने के लिए, अतिरिक्त ध्यान दे रही हैभ्रूण सुनिश्चित करने के लिए इमेजिंग सतह के साथ चपटा है।
  7. tricaine समाधान के तहत अब polymerized agarose ड्रॉप डूब।
  8. सूक्ष्म इमेजिंग के लिए जीना zebrafish भ्रूण अधीन।

6. संशोधन: इंजेक्शन zebrafish भ्रूण की जर्दी थैली में कैंसर की कोशिकाओं

  1. जैसा कि पहले इस प्रोटोकॉल की धारा (3) में वर्णित microinjection बांटना प्रणाली और इंजेक्शन प्लेटों की तैयारी।
  2. फ्लोरोसेंट रंगों विषम के रूप में पहले इस प्रोटोकॉल की धारा (2) में वर्णित के साथ दो सेल आबादी लेबल।
  3. जर्दी थैली में 2 x 10 ^ 7 कोशिकाओं / एमएल के 10 NL - 5 इंजेक्षन। इंजेक्शन की मात्रा स्थिर रखने के समान सेल नंबर इंजेक्षन करने के लिए - प्रत्येक सेल की आबादी से (100 से 200 कैंसर कोशिकाओं)
    नोट: एक इस परख के लिए फ्लोरोसेंट वाहिका कमी पारदर्शी zebrafish भ्रूण का उपयोग कर सकता है। वाहिका में कणों का निष्क्रिय प्रवेश फ्लोरोसेंट मोती (<10 माइक्रोन) या इंजेक्शन लगाने के द्वारा नियंत्रित किया जा सकता, परिवर्तननेटिव रूप में, एक सेल लाइन है कि intravsate नहीं है।
  4. जैसा कि पहले खंड में वर्णित (3) इस प्रोटोकॉल के लिए और फिर सफल इंजेक्शन के लिए स्क्रीन इंजेक्शन भ्रूण की वसूली।
    1. स्क्रीन और व्यवहार्य भ्रूण कि सफलतापूर्वक एक नई डिश के लिए इंजेक्शन थे हस्तांतरण करने के लिए एक त्रिविमदर्शी का प्रयोग करें।
      नोट: सभी भ्रूण की जर्दी में स्थित कोशिकाओं के एक लगातार आकार में बड़े पैमाने पर होनी चाहिए। भ्रूण खारिज कर रहे हैं बड़े पैमाने पर आकार भिन्न है या किसी कोशिकाओं की जर्दी के बाहर स्थित हैं यदि।
    2. एक नई डिश के लिए व्यवहार्य भ्रूण स्थानांतरण यदि कैंसर की कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से जर्दी थैली में देखा जाता है।
  5. 48 घंटा -, स्कोरिंग के लिए तैयार आम तौर पर 24 तक 33 डिग्री सेल्सियस पर पकवान सेते हैं।
    नोट: यह तापमान 37 डिग्री सेल्सियस के बीच, कैंसर की कोशिकाओं के लिए आदर्श तापमान, और 28.5 डिग्री सेल्सियस, zebrafish के लिए आदर्श तापमान एक समझौते के रूप में चुना गया है।
  6. intravasation स्कोर करने के लिए दिशा निर्देशों का पालन करें खंड में वर्णित (4) इस प्रोटोकॉल की, लेकिन इसके बजाय ग की संख्या गिनतीancer कोशिकाओं है कि सफलतापूर्वक दुम क्षेत्र की वाहिका में आक्रमण किया है।

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Representative Results

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यहाँ हम (चित्रा 1) एक zebrafish भ्रूण मॉडल में आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण किया। कठोर मापदंड, यह जा रहा मुख्यतः किया किसी भी झूठी सकारात्मक है कि स्कोरिंग सेलुलर मलबे से पैदा हो सकता है सीमित करने के लिए इन अलग सेल लाइनों, जहां सकारात्मक घटनाओं केवल गिना रहे थे, तो कैंसर की कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से extravasated था के लिए स्कोरिंग परिस्त्राव में कार्यरत थे।

हमारे विश्लेषण लाइनों के बीच मतभेद स्टार्क पता चला जब आक्रमण 96 घंटे precardiac साइनस (तालिका 1) में इंजेक्शन के बाद मूल्यांकन किया गया था। 7 सेल का परीक्षण किया लाइनों की, zebrafish एमडीए MB-231 सेल लाइन के साथ इंजेक्शन भ्रूण भ्रूण प्रति extravasated कैंसर की कोशिकाओं की सबसे बड़ी संख्या है, एक खोज है कि रेखा के स्वीकृत मेटास्टेटिक प्रकृति (चित्रा 2) के साथ संगत है का प्रदर्शन किया। हम यह भी पाया है कि बीटी-474 कोशिकाओं आसानी से मैंभ्रूण की दुम क्षेत्र में nvaded, जबकि इस तरह के एमसीएफ-7 के रूप में अन्य सेल लाइनों, एसके-BR-3, और टी-47D कोशिकाओं, न्यूनतम इनवेसिव (चित्रा 3) थे। एक जिज्ञासु खोज की है कि एमडीए MB-468 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन zebrafish भ्रूण का लगभग आधा cardial क्षेत्र में शोफ था और ये रन बनाए थे नहीं था। एक परिणाम के रूप में, इससे पहले कि हम पर्याप्त रूप से व्यवहार्य नमूनों कि परिस्त्राव के लिए quantitated किया जा सकता पाया एमडीए MB-468 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन भ्रूण के एक नंबर खारिज कर दिया गया था। इन प्रकट मतभेद के बावजूद, यह है कि परिस्त्राव प्रत्येक कैंसर कोशिका का परीक्षण लाइन के साथ हुई उल्लेखनीय है।

Precardiac साइनस परख के लिए एक संशोधन के रूप में, हम एक प्रतियोगिता प्रयोग जिससे एमडीए MB-231 कोशिकाओं है कि उनकी नाड़ी आक्रामक क्षमता 26 में मतभेद की दो आबादी के साथ-साथ विकासशील भ्रूण की जर्दी थैली में इंजेक्ट किया गया प्रदर्शन किया। एमडीए MB-231 मिला हुआ संस्कृति की स्थिति से पहले के तहत प्रचारित कोशिकाओंइंजेक्शन के लिए संचलन में intravasation में कमी का प्रदर्शन किया है और इसलिए स्कोरिंग पर भ्रूण की दुम क्षेत्र में एक कम उपस्थिति (चित्रा 4) था।

कोशिका की परत औसत। # भ्रूण प्रति Extravasated प्रकोष्ठों रेंज
एमडीए MB-231 (Subconfluent) 4 0-9
बीटी-474 1.5 0-4
एमडीए MB-468 0.7 0-6
MCF 7 0.6 0-2
टी-47D 0.3 0-2
HCC1806 0.2 0-1
SK-बीआर -3 0.1 0-1

तालिका 1: आमतौर पर इस्तेमाल स्तन कैंसर कोशिका लाइनों 2 दिन पुराने zebrafish भ्रूण की precardiac साइनस में इंजेक्शन और 4 दिन बाद रन बनाए थे Zebrafish में स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के संवहनी आक्रामक क्षमता की तुलना। वाहिका से और दुम क्षेत्र में हमलावर कैंसर की कोशिकाओं को सेल लाइन प्रति 10 भ्रूण में quantitated थे। extravasated कैंसर की कोशिकाओं की औसत संख्या श्रृंखला के साथ साथ संकेत दिया है।

आकृति 1
चित्रा 1. Zebrafish कैंसर सेल परिस्त्राव परख के दृश्य सारांश। इस परख में, कैंसर की कोशिकाओं को एक फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल और 2 दिन पुराने zebrafish भ्रूण की precardiac साइनस, जिसका वाहिका एक विषम फ्लोरोसेंट रिपोर्टर द्वारा चिह्नित है में इंजेक्ट कर रहे हैं। 2 फ़ॉलो - 4 अतिरिक्त दिनों, कैंसर की कोशिकाओं है कि भ्रूण की दुम क्षेत्र में आक्रमण कर रहे हैंरन बनाए और बाद इमेजिंग के लिए एक संवेदनाहारी agarose माध्यम में रखा जा सकता है। हर कदम प्रोटोकॉल के एक वर्ग को यह योजनाबद्ध मेल खाती में दर्शाया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
एक zebrafish भ्रूण 4 दिन एमडीए MB-231 कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन के बाद चित्रा 2. छवि मोजाइक। Brightfield (ए) और फ्लोरोसेंट (बी) मोज़ाइक दिखाया गया है। फ्लोरोसेंट छवियों को एक जेड ढेर के अधिकतम प्रक्षेपण, जिसमें एक हरे रंग वाहिका को दर्शाता है और एक लाल रंग के कैंसर की कोशिकाओं को इंगित करता है के रूप में चित्रित कर रहे हैं। स्केल पट्टी, 200 माइक्रोन। (सी) भ्रूण की दुम क्षेत्र extravasated कैंसर की कोशिकाओं को दिखाने के लिए बढ़ाया है। कबरा फ्लोरोसेंट लेबलिंग magnifica पर देखा जाता हैtion। स्केल बार, 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. प्रायोगिक परिणामों का उदाहरण है। यहां परिस्त्राव एक भ्रूण बीटी 474 कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ, लेकिन एक भ्रूण MCF 7, एस-BR-3, और टी-47D कैंसर की कोशिकाओं को इंजेक्शन के साथ में नहीं में प्रदर्शन किया है। तीर extravasated कोशिकाओं निरूपित। स्केल पट्टी, 100 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. एमडीए MB-231 सेल आबादी के intravasation 2 दिनों वायुसेनाआतंकवाद की जर्दी थैली इंजेक्शन। (ए) ग्रीन (आक्रामक) और लाल (कम आक्रामक) के साथ की जर्दी थैली लेबल एमडीए MB-231 कोशिकाओं। (बी) कि वाहिका पर आक्रमण पूंछ तक पहुंचने के लिए एमडीए MB-231 कोशिकाओं के साथ दुम क्षेत्र क्षेत्र। (सी) दुम क्षेत्र में intravasated एमडीए MB-231 कोशिकाओं के साथ zebrafish भ्रूण की संख्या 2 दिन इंजेक्शन 26 के बाद। स्केल सलाखों, 250 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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इस तकनीक zebrafish मॉडल कुशलता से कैंसर की कोशिकाओं (चित्रा 1 देखें) की नाड़ी आक्रामक क्षमता का परीक्षण करने के लिए इस्तेमाल करता है। (; - 3 आंकड़े 2 1 टेबल देखें) यहाँ हम क्रम में एक आधारभूत पर जो अन्य जांचकर्ताओं तो अपने स्वयं के अध्ययन का निर्माण कर सकते हैं प्रदान करने के लिए स्तन कैंसर कोशिका लाइनों के एक पैनल के लिए तकनीक लागू होता है। अवलोकन है कि एमडीए MB-231 कोशिकाओं आसानी से zebrafish भ्रूण की दुम क्षेत्र में आक्रमण एजेंटों कि नाड़ी आक्रमण को बाधित कर सकता है परीक्षण के लिए इस सेल लाइन आदर्श बनाना होगा। तुलनात्मक रूप से कम आक्रामक सेल लाइनों, उदाहरण के लिए HCC1806 या एमडीए MB-468 कोशिकाओं की तरह, कारक है कि अन्यथा नाड़ी आक्रमण शक्ति प्रदान करेगा अध्ययन करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। प्रयोगों के इन प्रकार की दवाओं के शामिल किए जाने की आवश्यकता है, तो एक प्रसव के दो अलग-अलग मार्गों, पर उपचार प्रभाव टिकाऊ होने की उम्मीद कर रहा है कि क्या निर्भर करता है। कैंसर की कोशिकाओं को दवा इंजेक्शन से पहले में साथ pretreated किया जा सकताभ्रूण या दवा सीधे पानी भ्रूण जहां यह प्रसार द्वारा कैंसर की कोशिकाओं को प्रभावित करेगा के आवास के लिए जोड़ा जा सकता है।

हमारी तुलना में, हम 96 घंटे precardiac साइनस में इंजेक्शन के बाद zebrafish भ्रूण पूंछ में कैंसर सेल परिस्त्राव का विश्लेषण किया। एमडीए MB-231 सेल प्रतियोगिता परख के लिए, संचलन में intravasation जर्दी थैली इंजेक्शन के बाद 48 घंटा मूल्यांकन किया गया था। timepoints विश्लेषण के लिए चुना आम तौर पर प्रत्येक कोशिका लाइन जहां, कुछ प्रयोगों के लिए, शिखर परिस्त्राव सिर्फ 24 इंजेक्शन के बाद मानव संसाधन हो सकता है के लिए अनुकूलन की आवश्यकता है। यह ध्यान देने योग्य है कि zebrafish भ्रूण एक कार्यात्मक सहज प्रतिरक्षा प्रणाली जब वे कैंसर की कोशिकाओं को 27 और इसके परिणामस्वरूप, कैंसर की कोशिकाओं से फ्लोरोसेंट मलबे मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल तरह प्रतिरक्षा कोशिकाओं से घिरा हुआ जा सकता है के साथ इंजेक्शन कर रहे हैं लायक है। जब स्कोर करने के लिए प्रयास करने से extravasat सहज प्रतिरक्षा प्रणाली की गतिविधि इसलिए संभावित झूठी सकारात्मक फ्लोरोसेंट लेबलिंग बना सकते हैंआयन; देखभाल केवल कोशिकाओं है कि मजबूती के साथ उचित चैनल में प्रतिदीप्ति स्कोर करने के लिए दिया जाना चाहिए। चूंकि वर्तमान कैंसर अनुसंधान कैंसर मेटास्टेसिस 28 को बढ़ाने में प्रतिरक्षा प्रणाली को फंसाने है, zebrafish भ्रूण मॉडल crosstalk कैंसर की कोशिकाओं और सहज प्रतिरक्षा प्रणाली के बीच होने वाली परीक्षा के लिए अनुमति देकर इस क्षेत्र में अद्वितीय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है। यह विचार हाल ही के अध्ययन के एक जोड़े द्वारा उदाहरण है। इन अध्ययनों के पहले प्रदर्शन किया zebrafish भीतर VEGFR निषेध कैंसर की कोशिकाओं को 29 से मेटास्टेटिक व्यवहार बटोर न्यूट्रोफिल की क्षमता को बढ़ाया है। एक दूसरे अध्ययन से पता चला है कि CXCR4-CXL12 प्रतिरक्षा केमोकाइन अक्ष संकेत zebrafish भीतर बरकरार है, के रूप में मानव कैंसर की कोशिकाओं पर रिसेप्टर संवेदन और zebrafish ligand 30 का जवाब है, और उनके आक्रामक क्षमता के साथ सहसंबद्ध कैंसर की कोशिकाओं में CXCR4 की अभिव्यक्ति के लिए सक्षम था पशु मॉडल के भीतर। इसके अलावा, यह exhibi प्रदर्शन किया गया है कि zebrafish मैक्रोफेजटेड मानव CXCL12 की दिशा में एक कीमोटैक्टिक प्रतिक्रिया। Fluorescently लेबल न्यूट्रोफिल 31 के साथ एक zebrafish भ्रूण तनाव, उदाहरण के लिए, आगे इस मॉडल में प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ कैंसर सेल बातचीत का पता लगाने के लिए उपयोग किया जा सकता है।

प्रोटोकॉल में कुछ कदम विशेष रूप से ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, यह है कि कैंसर की कोशिकाओं को आदेश भ्रूण में इंजेक्शन के दौरान सुई clogging रोकने के लिए एक एकल कोशिका निलंबन में अलग किया जा आवश्यक है। सेलुलर समुच्चय भी रक्त के प्रवाह को ब्लॉक और दुम क्षेत्र में यात्रा करने के लिए, इस प्रकार के विश्लेषण skewing कैंसर की कोशिकाओं की क्षमता के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं। सेलुलर समुच्चय भी रक्त वाहिकाओं टूटना करने के लिए प्रेरित कर सकते हैं और अगर ऐसा होता है, इन क्षेत्रों में रहते हैं कैंसर की कोशिकाओं की आक्रामक क्षमता स्कोरिंग न विश्वसनीय और न ही सिफारिश की है। एक अन्य संभावित समस्या क्षेत्र फ्लोरोसेंट डाई के साथ कैंसर की कोशिकाओं लेबलिंग से संबंधित है। हमारी प्रयोगशाला द्वारा चलाए जा रहे प्रयोगों में, हमने पाया है कि lipophilic रंगों,उदाहरण के लिए DiI की तरह, अच्छी लेबलिंग का उत्पादन करते हैं, फिर भी इसकी प्रतिदीप्ति स्तर सेल लाइनों के बीच भिन्न हो सकते हैं। इस कारण से, कैंसर की कोशिकाओं की फ्लोरोसेंट लेबलिंग के आदेश पर लेबलिंग को रोकने के लिए भ्रूण में इंजेक्शन से पहले अनुकूलित किया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है कि अतिरिक्त डाई कैंसर कोशिकाओं से दूर धोया जाता है के बाद वे चिह्नित किया गया है, और इस प्रोटोकॉल की लेबलिंग अनुभाग में संकेत विभिन्न centrifugation कदम से हासिल की है; इन चरणों का ज़रूरत से ज़्यादा लग सकता है, लेकिन वे पूरी तरह से जरूरी हैं। बहुत ज्यादा फ्लोरोसेंट रंजक कोशिकाओं को विषाक्त हो या खून में रिसाव, एक artifactual फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि का निर्माण कर सकते हैं। इन मुद्दों में से कई फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कैंसर कोशिकाओं के उपयोग के माध्यम से धोखा दिया जा सकता है, और यह सिफारिश की है जब संभव है कि इन प्रणालियों फ्लोरोसेंट रंजक के एवज में नियोजित किया। अंत में, जब कैंसर परिस्त्राव के लिए भ्रूण स्कोरिंग, यह जरूरी सभी शर्तों को लगातार मानदंड लागू करने के लिए है। हम वें मिल, एक व्यक्ति स्लाइड तैयार करने और परिणामों की रिकॉर्डिंग के साथ काम सौंपा गया है, जबकि अन्य व्यक्ति परिस्त्राव फैसले renders और हालत को अंधा मूल्यांकन किया जा रहा रखा जाता है: स्कोरिंग कदम में कम से कम दो व्यक्तियों को शामिल में मदद करता है वैज्ञानिक कठोरता बनाए रखें। जब स्कोरिंग, एक या तो पूंछ क्षेत्र में extravasated कैंसर की कोशिकाओं को quantitate या तुलना में आसानी के लिए द्विआधारी मानदंड बना सकते हैं। Fluorescently कैंसर की कोशिकाओं को रंगाई, कबरा लेबलिंग कि बहुत उच्च बढ़ाई (चित्रा 2 सी) में दिखाई जाएगी पैदा करता है, हालांकि पूरे कोशिकाओं कम बढ़ाई (चित्रा 3) पर विचार करने के लिए आसान कर रहे हैं, जिनमें से बाद स्कोरिंग के लिए सिफारिश की है। परिस्त्राव की अधिक अस्पष्ट मामलों को देखते हुए एक confocal खुर्दबीन, जहां पूंछ क्षेत्र के सभी कक्षों की एक प्रतिशत के रूप में तरल पदार्थ का स्त्राव quantitating भ्रूण में कैंसर कोशिकाओं के असमान लोड करने के लिए नियंत्रित कर सकते हैं पर ऑप्टिकल स्लाइस के अधिग्रहण के द्वारा सहायता प्राप्त की जा सकती है।

योके रूप में यह कोशिकाओं के एक उच्च संख्या के लिए अनुमति देता है और इसलिए बेहतर एक सेल आबादी के भीतर विविधता accommodates इंजेक्शन मार्ग थैली लालकृष्ण precardiac साइनस से अलग है। के रूप में चित्रा 4 में दिखाया गया है, कई विभिन्न लेबल सेल आबादी के साथ-साथ उनकी आक्रामक क्षमता और पैटर्न की तुलना करने की जर्दी थैली में इंजेक्ट किया जा सकता है। इंजेक्शन कोशिकाओं की एन्जियोजेनिक क्षमता और रक्त वाहिकाओं का बढ़ाया भर्ती पूंछ क्षेत्र में कैंसर सेल प्रविष्टि सुविधा हो सकती है लेकिन इस पहलू अभी तक विश्लेषण नहीं किया गया है। तकनीकी तौर पर, जर्दी थैली इंजेक्शन हालांकि एक precardiac साइनस इंजेक्शन की तुलना में प्रदर्शन करने के लिए आसान कर रहे हैं, दूसरी ओर, जर्दी थैली एक पोषक तत्वों से भरपूर वातावरण है कि कैंसर की कोशिकाओं के बाहर निकलने में बाधा हो सकती है। यह भी संभव है कि जर्दी में रक्त वाहिकाओं के पास इंजेक्शन समय से पहले ही संचलन में कैंसर की कोशिकाओं को पेश हो सकता है और इसलिए, एक को ध्यान से कच्ची इंजेक्शन के लिए स्क्रीन चाहिए और स्कोरिंग से इन भ्रूण न आना। अंत में, यह महत्वपूर्ण है टीओ ध्यान दें कि जर्दी microenvironment कुछ हद तक कृत्रिम है, के रूप में यह चूहों या मानव में एक अनुरूप प्राथमिक साइट का अभाव है।

विभिन्न मॉडल प्रणाली है कि कैंसर मेटास्टेसिस भविष्यवाणी करने के लिए की तलाश अपने फायदे और नुकसान के बिना नहीं कर रहे हैं, और zebrafish परिस्त्राव परख कोई अपवाद नहीं है। एक प्रमुख लाभ के रूप में, इस परख एक कार्यात्मक संचार प्रणाली के भीतर संवहनी आक्रामक क्षमता के आकलन के लिए अनुमति देता है और प्रयोगात्मक सवाल बस कुछ ही दिनों के बाद जवाब दिया जा सकता है। तेजी से बदलाव समय को देखते हुए, एक ऐसी प्रणाली न केवल स्थापित सेल लाइनों के आक्रामक व्यवहार की जांच के लिए उपयोग किया जा सकता है, लेकिन यह भी हौसले से पृथक मानव कैंसर रोगियों से नमूने हैं। बड़ा नुकसान है कि इस मॉडल संवहनी आक्रमण पर पूरी तरह ध्यान केंद्रित करके मेटास्टेटिक झरना का जल्द से जल्द और नवीनतम घटनाओं को छोड़ देता है। इसके अलावा, मानव कैंसर इन zebrafish भ्रूण में इंजेक्शन कोशिकाओं स्पष्ट रूप से एक syngeneic परिवेश और टी के साथ कुछ परस्पर क्रिया में सक्रिय नहीं हैंवह स्ट्रोमा फलस्वरूप खो दिया जा सकता है। इन सीमाओं के बावजूद, zebrafish भ्रूण मॉडल, दोनों बुनियादी और translational कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में एक लायक जगह नहीं है के रूप में हम यह हिप्पो के लिए एक भूमिका दिखाने के कैंसर की नाड़ी आक्रामक क्षमता में मार्ग 26 और केरातिन जुड़े प्रोटीन 5-5 32 सिगनल कार्यरत है कोशिकाओं। इसलिए, इस मॉडल संभावित उन्नत चरण के कैंसर का एक प्रमुख मेटास्टेटिक बानगी की जांच में सहायता करने के है।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.05% Trypsin-EDTA Life Technologies 25300-054
100 mm Dishes Corning Incorporated 3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass Fisher Brand 13-678-20B
60 mm Dish Corning Incorporated 3160-60
Agarose, Low Melting Fisher BP165-25
Agarose, Molecular Grade Bioline BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4" A-M Systems, Inc 627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller Hofstra Group 3600
DMEM Life Technologies 11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0 mm World Precision Instruments, Inc E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222) Fluka A5040
Eyelash Brush Ted Pella, Inc 113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated Omega Scientific FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes ThermoFisher Scientific 13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips Fisher Brand 02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm) ThermoFisher Scientific 150680
Glass Depression Slide VWR 470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt Pentair IS50
Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72 Heathrow Scientific HS20622B
SP8 Confocal Microscope Leica
Micromanipulator Narishige
Eclipse E600 Nikon
PBS Life Technologies 10010-023
Penicillin-G Potassium Fisher Biotech BP914-100
Petri Plates, 100 mm x 15 mm Fisher Brand  FB0875713
Picospritzer II General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium  Life Technologies 11875-093
Streptomycin Sulfate Fisher Biotech BP910-50
Vybrant DiI ThermoFisher Scientific V22885
Vybrant DiO ThermoFisher Scientific V22886
Zebrafish  Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.

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परीक्षण संवहनी इनवेसिव (Zebrafish में कैंसर कोशिकाओं की क्षमता<em&gt; Danio rerio</em&gt;)
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Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).More

Berens, E. B., Sharif, G. M., Wellstein, A., Glasgow, E. Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio). J. Vis. Exp. (117), e55007, doi:10.3791/55007 (2016).

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