Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات

doi: 10.3791/55020 Published: January 25, 2017

Introduction

الخلايا في الكائنات الحية متعددة الخلايا لديها العديد من الميزات الفردية التي قد تكون إما فريدة من نوعها لخلية معينة أو على الأقل ينتمون إلى مجموعة فريدة من الخلايا. حتى الخلايا المستنسخة مثقف تظهر الخصائص الفردية كما يتضح من التشكل متنوعة. أيضا، وينعكس الفردية خلية في المنتجات التي تفرز. في حالة التهاب فيروسي، يمكن أن الجسيمات الفيروسية تحمل البروتينات من الخلايا التي تنتج منها. على سبيل المثال، لفيروس نقص المناعة البشرية هي جزء لا يتجزأ العديد من البروتينات الخلية المضيفة في المغلف الفيروسية والفيروسات التي يتم إنشاؤها من قبل خلايا مختلفة قد تحمل هذه البروتينات المميزة 1 أو 2 أو "التوقيعات خلية".

حتى من دون العدوى، تطلق الخلايا في وسائل الإعلام المحيطة بها الحويصلات خارج الخلية الصغيرة (السيارات الكهربائية). نشوء حيوي من هذه الحويصلات وبنيتها في كثير من الحالات أن تشبه الفيروسات، وخاصة الفيروسات القهقرية. في السنوات الأخيرة أصبح واضحاأن المركبات الكهربائية، والتي كانت تعتبر في البداية أن يكون "الغبار الصفائح الدموية" تشكل نظام الفسيولوجية المهم التواصل خلية خلية. جنبا إلى جنب مع اثنين من الأنظمة الأخرى من الاتصالات بين الخلايا، وهي التفاعلات خلية خلية الاتصال والجزيئات القابلة للذوبان صدر، المركبات الكهربائية تنسق علم وظائف الأعضاء الطبيعي وغيرت في مختلف الأمراض 4 و 5 منها الالتهابات الفيروسية 6 و 7.

على الرغم من أن كل من الجسيمات الفيروسية صدر والحويصلات خارج الخلية متنوعة للغاية، وتتميز أنها في الغالب عن طريق تحليل بالجملة في التي فقدت خصائصها الفردية. وهناك طريقة أقرب إلى التدفق الخلوي، التي الظواهر الخلايا استنادا المستضدات السطحية المختلفة، وهناك حاجة لتوصيف الجسيمات الفيروسية ومثل الفيروسية الفردية. للأسف، المركبات الكهربائية أو virions الصغيرة لا يمكن تحليلها باستخدام خلوي تدفق قياسيأساليب التناظر لأنها صغيرة جدا لتوليد إشارة تشتت الضوء الذي معظم cytometers تعتمد لتحريك. للتحايل على هذا القيد، يمكن تطبيق مضان اثار. ومع ذلك، إذا هي ملطخة المركبات الكهربائية أو virions مع الأجسام المضادة الفلورسنت فمن الصعب تمييزها عن الأجسام المضادة حرة والمجاميع الخاصة بهم بسبب مضان بهم مماثلة والأحجام المماثلة.

مؤخرا، قمنا بتطوير طريقة الإنتاجية العالية القائم على تكنولوجيا النانو التي تسمح للتوصيف مستضدات على جزيئات صغيرة الفردية باستخدام أجهزة قياس التدفق الخلوي العادي 9. نحن نوظف MNPs إلى جزيئات immunocapture المصالح، كما وصفت من قبل جماعات أخرى لتطبيقات متنوعة 10، 11، 12، 13؛ ومع ذلك، لدينا تقنية جديدة تسمح للقبض على SPECI الفرديةأهداف المرورية تليها phenotyping من هذه الجسيمات التي استولت عليها التدفق الخلوي باستخدام مضان اثار بدلا من تشتت الضوء، دون تدخل من الأجسام المضادة التعويم الحر. هذا الأسلوب له تطبيقات واسعة، ويمكن استخدامها لتوصيف التركيب الأنتيجين من أي الجسيمات الصغيرة viral- وغير الفيروسية التي تولدها الخلايا في الجسم الحي، وقدم في المختبر توافر الأجسام المضادة الفلورسنت محددة ضد المستضدات السطحية. نحن بالفعل بتطبيق هذه التقنية لدراسة العديد من المشاكل البيولوجية.

على وجه الخصوص، قمنا بتقييم توزيع علامات الخلية المضيفة على الفردية HIV-1 الجسيمات درسنا نضوج فيروسات حمى الضنك الفردية (DENV) بناء على تحليل البروتينات سطحها 14 والتحقيق المركبات الكهربائية التي تطلق في مجرى الدم من المتطوعين الأصحاء والمرضى مع متلازمة الشريان التاجي الحادة (ACS). على الرغم من أن تقوم على مبدأ مماثل، فيتطبيق تقنية جديدة تتطلب وضع بروتوكولات محددة الموضحة أدناه.

Protocol

1. اقتران من النانوية المغناطيسية (MNPs)

  1. استخدام إجراء اقتران التجاري والكواشف لMNPs زوجين مع الأجسام المضادة (عبس) (عادة 1 ملغ). يتم استخدام الحديد النانوية أكسيد مع حمض الكربوكسيلية مجموعات على النحو المتفاعلة.
    1. إذا الأجسام المضادة هي في حجم أعلى من 0.5 مل، والتركيز باستخدام مكثف 100K. تدور في 2000 x ج لمدة 3-5 دقائق.
  2. في نهاية هذا الإجراء، بعد إضافة 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت التبريد، نقل MNPs إلى 12 مم أنبوب × 75 مم وإضافة عازلة / تخزين 3 مل غسل. وضع أنبوب في حفرة وسط فاصل المغناطيسي وترك بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  3. تحقق من أن MNPs يكون كل جمعها إلى جانب الأنبوب، ثم بعناية الماصة من كل السائل. إضافة 3 مل من غسل العازلة / تخزين جديدة، والمكان مرة أخرى في المغناطيس.
  4. بعد عدة ساعة، معرفة ما اذا كان يتم جمع MNPs إلى جانب الأنبوب ثم الماصة قبالة السائل. استخدام 2 مل من غسل العازلة / التخزين لresuspend وMNPs وتخزين عند 4 درجات مئوية.
  5. تحقق من أن تقترن عبس إلى MNPs التي وصفها لهم الفلورسنت جزء الأجسام المضادة القوات المسلحة البوروندية ذات الصلة (مثل الماعز المضادة للماوس في حالة استخدام وحيدة النسيلة الماوس أب لالتقاط كما هو موضح في قسم 2)، وتعمل على تدفق عداد الكريات.

2. وضع العلامات الأجسام المضادة إلى جانب لMNPs

  1. الجمع بين 60 ميكرولتر (3.9 × 10 12 الجسيمات) من MNPs (في حالة) و 5 ميكرولتر (من حل تجاري / مل 200 ميكروغرام) المسمى شظايا فاب، محددة لنمط إسوي من القبض على أب في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. يحضن في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 دقيقة مع خلط مستمر.
  3. قبل الرطب مكثف 100K مع 300 ميكرولتر من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) وتدور في microcentrifuge في 1500 x ج لمدة 5 دقائق.
  4. مجمعات تنقي المسمى على 100K عمود. تدور خليط من الخطوة 2.2 في microcentrifuge في 1500 x ج لمدة 5 دقائق، ويغسل مع 200 ميكرولتر PBS، وينتعش فيحجم الأولي.

3. استخدام إعتبر أب-MNP مجمعات لالتقاط الجزيئات المهمة (الفيروسات أو المركبات الكهربائية)

  1. احتضان المسمى قبل MNPs 60 ميكرولتر (3.9 × 10 12 الجسيمات) مع فيروس نقص المناعة البشرية (60 ميكرولتر) أو إعداد EV (100 ميكرولتر).
    1. إعداد التحضيرات EV باستخدام أساليب مختلفة. هنا، تنقية المركبات الكهربائية على التدرجات السكروز، وجمع لهم من سوء البلازما الصفائح الدموية باستخدام الكواشف exosome هطول الأمطار أو عزل مباشرة من البلازما 8.
      ملاحظة: تحتاج النسب المثلى يتم تحديدها لكل تجربة وتعتمد على تركيز الفيروس / EV في التحضير. وينبغي أن تكون حركة الأشخاص الطبيعيين-أب جزء ~ 10 6 تزيد بالمقارنة مع تركيز جزء فيروس / EV.
  2. احتضان 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الخلط لطيف للبحث عن الفيروسات، أو 1 ساعة عند 4 درجة مئوية لمدة المركبات الكهربائية.
  3. إضافة 2.5٪ مفتش الماوس / مفتش الإنسان لمنع التيسير ملزمة، بلطف دوامة، واحتضان 3-5 دقيقة في RT.
  4. إضافة تركيزات المصنعة الموصى بها أو titered كل عبس كشف واحتضان إضافي 20 دقيقة في RT.

4. الفصل بين Virions استولت حركة الأشخاص الطبيعيين (أو المركبات الكهربائية) من غير منضم الأجسام المضادة باستخدام الأعمدة المغناطيسي

  1. إعداد عمود الفصل المغناطيسي للاستخدام عن طريق وضعها في المغناطيس الفاصل.
  2. قبل الرطب العمود مع 500 ميكرولتر من غسل العازلة (2 حمض ملي Ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 0.5٪ زلال المصل البقري (BSA) في برنامج تلفزيوني). السماح للغسل العازلة لتدفق من خلال العمود.
  3. إضافة المجمعات حركة الأشخاص الطبيعيين الفيروسات / MNP-EV إلى العمود والسماح لجميع السائل بالتدفق من خلال. إضافة 500 ميكرولتر من غسل العازلة إلى العمود، والسماح للحجم كله بالمرور.
  4. تكرار غسل غسل العازلة 2 مرات أكثر.
  5. إزالة عمود من المغناطيس وقعت في 12 مم × 75 مم أنبوب لجمع المجمعات حركة الأشخاص الطبيعيين الفيروسات / MNP-EV الاحتفاظ بها. السماح للعمود الوقوف في أنبوب خارج المغناطيس لمدة 3 دقائق. إضافة 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني، والسماححبات تتدفق عن طريق الجاذبية، إضافة 200 ميكرولتر آخر من برنامج تلفزيوني، وإصلاح مع 200 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ بعد شطف.
    ملاحظة: لامتصاص العرق هو مادة مسرطنة المشتبه بهم ويجب أن يتم التعامل معها في غطاء التهوية ويجب ارتداء القفازات.
  6. لتحديد virions واحدة / المركبات الكهربائية تستخدم إعدادات الحجمي على إنتاجية عالية عينات (HTS) أو قبيل اكتساب إضافة تدفق تمتزج جيدا الخلوي الخرز العد.

5. تحليل الفيروسات القبض MNPs / المركبات الكهربائية مع عداد الكريات تدفق

  1. الاحماء الكريات تدفق لمدة 30 دقيقة.
  2. تشغيل حبات مراقبة الجودة.
  3. عتبة تعيين على مضان إما MNPs أو المسمى الفيروسات / المركبات الكهربائية. استخدام 0.22 ميكرون تصفية برنامج تلفزيوني لعتبة لتقليل الخلفية "ضجيج". تعيين عتبة عن طريق ضبط الجهد PMT في المستوى الذي يعطي تصفيتها برنامج تلفزيوني لا، أو عدد قليل جدا، والأحداث.
  4. عينات تشغيل منخفضة. (استخدام فلتر 0.04 ميكرون مضمنة إضافي للسوائل غمد وضعها في سلسلة وراء0.2 ميكرون معيار تصفية غمد لمواصلة قضاء الأحداث كاذبة).

6. تقييم الكفاءة لقطة

  1. التقاط المركبات الكهربائية fluorescently المسمى أو فيروس نقص المناعة البشرية مع حركة الأشخاص الطبيعيين-عبس كما هو موضح في 3.1، 3.2. (المركبات الكهربائية يمكن أن يكون المسمى إما مع صبغة غشاء أو من خلال حمولتها 15؛ فيروس نقص المناعة البشرية يمكن أن يكون المسمى إما عن طريق صبغ ترميز الجين 16، أو مع صبغة غشاء 12، 17).
  2. إعداد عمود الفصل المغناطيسي كما هو موضح في (4،1-4،2).
  3. إضافة المجمعات حركة الأشخاص الطبيعيين الفيروسات / MNP-EV إلى العمود والسماح لجميع السائل بالتدفق من خلال (التدفق من خلال الكسر). جمع التدفق من خلال الكسر في أنبوب.
  4. المضي قدما في جزء المحتجزة في العمود كما هو موضح في (4،4-4،5).
  5. إجراءات القبض كرر على تدفق من خلال جزء من 6.3 مع فصل لاحق (4،1-4،5).
  6. تحليل الكسور المدورة من كاليفورنيا الأولىومن المقرر pture والتقاط الثاني تشغيلها على الكريات أنه في التسبب في التسمية الفلورسنت من المركبات الكهربائية أو فيروس نقص المناعة البشرية. لتقييم الكفاءة، مقارنة عدد من الأحداث في كل من الكسور.

7. التكيف التابع لبروتوكول لأداء مهام محددة

ملاحظة: على الرغم من أن البروتوكول يمكن تطبيقها على تحليل فيروس نقص المناعة البشرية والمركبات الكهربائية كما هو موضح أعلاه، لتحليل DENV ينبغي إدخال التعديلات التالية:

  1. احتضان virions مع 1 ميكرومتر الجاذبة في الظلام لمدة 30 دقيقة في RT. بعد مرور فترة الحضانة تنقية فيروس الملون بواسطة الطرد المركزي في كثافة متوسطة الانحدار (10٪، 20٪، 25٪ و 35٪) على 240000 x ج لمدة 1.5 ساعة عند 4 درجات مئوية مع عدم وجود فرامل. جمع جزء ما بين 20٪ و 25٪ كثافة طبقات المتوسطة 14 التدرج.
  2. احتضان الجاذبة المسمى DENV 1 × 10 7 (60 ميكرولتر) مع الشركة المصنعة الموصى بها أو titered تركيزات كشف أب في وجود 2.5٪ مفتش الماوس لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. Incubأكل خليط مع المسمى قبل 60 ميكرولتر (3.9 × 10 12 الجسيمات) المجمعات أب حركة الأشخاص الطبيعيين التقاط لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الخلط لطيف.
  4. المجمعات الناتجة منفصلة عن القيمة المطلقة غير منضم على أعمدة المغناطيسي كما هو موضح أعلاه وتحليلها على تدفق عداد الكريات.

Representative Results

القبض الانتقائي للمستضدات الخلوية التي كتبها HIV-1 virions

مع "virometry تدفق" أصبح من الممكن الآن لتصور مولدات المضادات الخلوية على الجسيمات الفيروسية الفردية. وكمثال على ذلك، ركزنا على اثنين من مولدات المضادات الخلوية التي يحملها HIV-1، LFA-1 و HLA-DR. في وقت سابق وقد تم تحديد هذه المستضدات اثنين في HIV-1 الاستعدادات التي تم تحليلها في معظم 1. ونحن على استعداد MNPs جانب واحد من الأجسام المضادة ضد بروتين أظرف فيروس نقص المناعة البشرية، VRC01، والتي تم التقاطها باستخدام هذه virions MNPs HIV-1 (HIV-1 LAI.04 أو HIV-1 SF162 تنتج في الخلايا وحيدة النواة الدموية المحيطية (PBMCs)). وبالإضافة إلى ذلك، فإننا الملون هذه virions مع 2G12، وآخر الأضداد المضادة للبيئية. أظهرت تدفق virometry لعدم التجانس عالية من HIV-1 virions بشأن وجود LFA-1 و HLA-DR. في المتوسط 16.7 ± 2.0٪ (ن = 6) و 8.6 ± 0.3٪ (ن = 3) من HIV-1 LAI.04 virions قامت LFA-1 و HLA-DR،على التوالي. فقط 4.8 ± 0.6٪ (ن = 3) من كل virions كانت ايجابية لكل من المستضدات. من جهة أخرى HIV-1 سلالة، HIV-1 SF162، وكانت هذه المستضدات الموجودة على 20.0 ± 4.4٪ (ن = 6) و 10.8 ± 1.3٪ (ن = 6) من virions، على التوالي، في حين نفذت كل من المستضدات بنسبة 6.5 ± 0.4٪ (الشكل 1).

تم توزيع البروتينات الخلوية تعتمد على الخلايا التي تتكرر الفيروس. خلايا Jurkat المنتجة virions مختلفة مستضديا من تلك التي تنتجها PBMCs المصابة بفيروس نقص المناعة البشرية المصابة. قامت Virions من HIV-1 لاي 0.4 تنتجها الخلايا Jurkat 1.6 ± 1.4٪ (ن = 3) و 1.6 ± 0.7٪ (ن = 4) LFA-1 و HLA-DR على التوالي. لHIV-1 SF162 virions تنتج في الخلايا Jurkat، وكانت هذه المعلمات 7.2 ± 2.5٪ (ن = 3) و 5.6 ± 2.7٪ من (ن = 4). وهكذا، كان ماكياج الأنتيجين (على الأقل بالنسبة HLA-DR وLFA-1) مختلف عن HIV-1 LAI.04 التي تنتجها اثنين مختلفة من الخلاياأنواع (ع <0.02).

تدفق virometry كما هو مطبق في تقييم فيروس حمى الضنك

ويرتبط نضوج DENV مع التعبير عن بروتين PRM على virions. طبقنا virometry تدفق لتقييم ما جزء من DENV المنتجة في BHK-1 وفي الخلايا لوفو يشكل الفيروسات الناضجة. كانت ملطخة Virions مع صبغ شحمي الجاذبة. تحليل virions القبض الفردية كشف PRM على 48.2 ± 5.3٪ (ن = 8) من DENVs. في المقابل، 84.5 ± 3.4٪ (ن = 4) من DENV إنتاجها في خلايا وفو تقوم PRM. بقية virions على التوالي 51.8 ± 5.3٪ (ن = 8) و 15.5 ± 3.4٪ (ن = 4) كانت PRM السالب (الشكل 2). وهكذا، وتدفق virometry يمكن أن تستخدم لتمييز DENV الفردية ناضجة تماما من غير ناضجة (أو ناضجة جزئيا) virions DENV.

الحويصلات خارج الخلية تطلق في مجرى الدم من صحيةالمتطوعين والمرضى الذين يعانون من متلازمة الشريان التاجي الحادة (ACS)

من أجل التحقيق في مجموعات فرعية EV مختلفة في المرضى الذين يعانون من ACS والضوابط الصحية، وألقينا القبض على المركبات الكهربائية من الفقراء البلازما الصفائح الدموية (PPP) من خلال الفلورسنت MNPs يقترن مع الأجسام المضادة ضد CD31، CD41a، أو CD63. كانت ملطخة المركبات الكهربائية التي استولت عليها CD31-MNPs لCD41a وCD63، كانت ملطخة المركبات الكهربائية التي استولت عليها CD41a-MNPs لCD31 و CD63، وكانت ملطخة المركبات الكهربائية التي استولت عليها CD63-MNPs لCD31 وCD41a (الشكل 3).

وكانت كمية المركبات الكهربائية التي استولت عليها CD31-MNPs وايجابية واحد أو اثنين من الأجسام المضادة كشف في المرضى الذين يعانون ACS 3359 [2328. 5472] المركبات الكهربائية / ميكرولتر في مقارنة مع 1،272 [714؛ 2157] المركبات الكهربائية / ميكرولتر على متطوعين أصحاء (ع = 0.001). وبلغ مجموع المركبات الكهربائية التي استولت عليها CD63 في المرضى الذين يعانون ACS بالمقارنة مع المتطوعين الأصحاء 3541 [1318. 5173] المركبات الكهربائية / ميكرولتر مقابل 806 [488. 2112] المركبات الكهربائية / ميكرولتر (ع = 0.007). كان هناك 4752 [3238. 7173] المركبات الكهربائية / ميكرولتر في بلازما المرضى الذين يعانون من ACS التي استولت عليها CD41a-MNPs، في حين أنه في البلازما من المتطوعين الأصحاء كان هذا الرقم أقل من ذلك بكثير، 2623 [1927. 4188] المركبات الكهربائية / ميكرولتر (ع = 0.015). بشكل عام، تشير نتائجنا أنه على الرغم من زيادة كميات EV معظم المرضى ACS، كان حجم الزيادة مختلفة في مختلف السكان فرعية من المركبات الكهربائية.

شكل 1
الشكل 1: التأسيس الانتقائي للمستضدات الخلوية في HIV-1 virions تكرار في أنواع مختلفة من الخلايا. تم القبض على فيروس نقص المناعة البشرية (HIV-1 LAI.04 أو HIV-1 SF162) virions الصادرة عن PBMCs أو خلايا Jurkat مع VRC01-MNPs وملطخة الثاني الأجسام المضادة لمكافحة gp120 2G12 ومع الاجسام المضادة المحددة ضد HLA-DR وLFA-1. تعرضت استعدادات الملون في التدفق تحليل لHLA-DR (أشرطة بيضاء) وLFA-1 (با الأسودروبية). يعني ± SEM من 3-6 التجارب 9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2
الشكل 2: حالة نضوج virions DENV. وصفت DENV المنتجة في BHK-21 خلايا (A، B) أو في الخلايا لوفو (C، D) مع الصبغة شحمي الجاذبة، وبعد تنبيذ فائق الكثافة المتوسطة الانحدار، ملون للبروتين PRM مع 2H2 الأجسام المضادة (A، C) أو مع IgG2a isotype السيطرة (B، D). ثم تم القبض على virions المسمى مع 3H5-1-MNPs وتعرض لتحليل تدفق 14. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذاالشكل.

الشكل (3)
الشكل 3: تحليل المركبات الكهربائية من المرضى ACS والاصحاء. تم القبض على المركبات الكهربائية البلازما مع CD31-MNPs، CD63-MNPs أو CD41a-MNPs وملطخة الأجسام المضادة ضد CD41a وCD63، CD31 ضد وCD41a وضد CD31 و CD63، على التوالي. المركبات الكهربائية القبض عليه، ملطخة واحد على الأقل من القيمة المطلقة الكشف، وتصور وتعداد في تحليل التدفق. قدمت البيانات ومؤامرة نقطة مع متوسط ​​والمجال بين الشرائح الربعية (الربعية). رموز الخضراء: متطوعين أصحاء (الضوابط)، والرموز البني: المرضى ACS. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل 4: Evaluatiعلى الكسر من الأحداث تدفق التي تمثل virions الفردية. (A) HIV-1. تم تقسيم تعليق virions إلى قسمين وملطخة إما مع فعل (اللوحة اليسرى) أو ديو (لوحة المتوسطة). بعد الاختلاط، وتعليق، والتي تحتوي على اثنين من virions الملون تفاضلي، اعتقل مع VRC01-MNPs وتعرض لتدفق virometry (اللوحة اليمنى). المجاميع (الأحداث المزدوجة الملونة) تمثل أقل من 10٪ من إجمالي الأحداث. (B - D) DENV. تعليق virions الملون الجاذبة-تم تخفيفه بشكل متسلسل اثنين أضعاف من 1: 2-1: 256 واكتسب مع HTS على تدفق عداد الكريات (B). وصفت الجاذبة-DENVs مع 2H2 الأجسام المضادة (C) أو الجاذبة-DENVs تم القبض مع 3H5-1-MNPs (D). الاستعدادات C و D ثم تم تخفيفه بشكل متسلسل اثنين أضعاف من 1: 2-1: 256 والمكتسبة مع HTS 14. لا يبدو Virions لتجميع لأنه في جميع الحالات هناكهو علاقة خطية بين عامل التخفيف وعدد من الأحداث. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5
الرقم 5: الكشف عن جزيئات واحدة عن طريق قياس التدفق الخلوي. كانت ملطخة الجاذبة-تعليق DENV المخفف متسلسل اثنين أضعاف من 1: 2-1: 2048 واكتسبت باستخدام HTS على تدفق عداد الكريات. (أ) عدد من الفيروسات الكشف عن وظيفة عامل التخفيف. (ب) وسيطة كثافة مضان (MFI) من الجاذبة المسمى DENV 14. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 6: تقييم جزء من virions والحويصلات خارج الخلية التي تم التقاطها باستخدام MNPs بالإضافة إلى أجسام مضادة محددة. تم القبض على المسمى HIV-1 virions أو المركبات الكهربائية مع MNPs بالإضافة إلى أجسام مضادة محددة وتعرضوا لتدفق virometry. بعد الانفصال على أعمدة المغناطيسية، تم تحليل من خلال تدفق (لا يتم الاحتفاظ) الكسور لوجود virions أو المركبات الكهربائية من الفائدة التي تم تفويتها في الجولة الأولى. (أ) تم القبض إعتبر virions HIV-1 بال مع 2G12-MNPs (اللوحة اليسرى). واستعاد جزء التدفق من خلال وتعرض لتدفق virometry (اللوحة اليمنى). في المرحلة الأولى تم القبض على حوالي 95٪ من virions من الفائدة. تم القبض على (ب) المركبات الكهربائية إعتبر مع anti-CD81 MNPs ومعزولة على أعمدة المغناطيسية (اللوحة اليسرى). أعيد القبض-جزء التدفق من خلال وتحليلها (اللوحة اليمنى). في الاولتم القبض على دورة حوالي 99٪ من الحويصلات من الفائدة 8. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

لا تزال أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية الأداة الرئيسية لتحليل الخلايا على أساس الخصائص الفيزيائية والكيميائية على المستوى الفردي 18. المبادئ الأساسية للالتدفق الخلوي لم تتغير منذ تطوره: خلية التي يمر شعاع الليزر وينثر الضوء تشكل حدثا الذي يقوم بتشغيل تسجيل أطياف الفلورية المنبعثة من الأجسام المضادة الفلورسنت محددة الخلية. جسيمات أصغر أقل من 300 نانومتر لا يمكن الكشف عن مبعثر الجانب من الكريات كما مبعثر مزيد من الضوء تحت زوايا أكبر في أي أكثر تدفق الكريات لا نجمع ضوء 18. تقنية الموضحة هنا، يسمح بتحديد وتحليل مستضدات متعددة على العديد من الفيروسات الفردية أو المركبات الكهربائية عن طريق أجهزة قياس التدفق الخلوي التقليدية مع مضان اثار.

الخطوات الحاسمة في البروتوكول هي اقتران الأجسام المضادة لMNPs. وادائها تجاربناميد باستخدام 15 جزيئات أكسيد الحديد نانومتر مع حمض الكربوكسيلية كمجموعة رد الفعل كما هو موضح سابقا 9. وفقا لالصانع، يمكن لكل 15 نانومتر حركة الأشخاص الطبيعيين ربط بحد أقصى 20 الأجسام المضادة. نحن ربط حوالي 10 الأجسام المضادة في 15 نانومتر حركة الأشخاص الطبيعيين. ويستند هذا التقدير على كمية من الأجسام المضادة قبل وبعد اقتران وعدد من حبات / مل مقاسا توصيف جسيمات متناهية الصغر والتحجيم الأجهزة. من حيث المبدأ، قد يتسبب اقتران تجميع الجسيمات وغير مرغوب فيها. للتأكد من أن التجميع لا يحدث مع بروتوكول لدينا، ونحن التحقق من ذلك مع توصيف جسيمات متناهية الصغر والتحجيم الأجهزة. يقيس هذا الصك قطر الهيدروديناميكية للجسيمات، والتي تشمل طلاء والأجسام المضادة طبقات بدلا من جوهر 15 نانومتر فقط. لقد وجدنا أن الغالبية العظمى من الخرز يقترن تقع في ذروة واحدة (يعني ذروة 64.7 ± 4.2 نانومتر مع 90٪ من جميع الأحداث دون 73 ± 7.3 نانومتر). اختلاط أب-MNP التعاونmplexes مع virions أو المركبات الكهربائية في نسبة الصحيح من الأهمية بمكان بحيث MNPs هي في تركيز عدة أوامر أعلى من المركبات الكهربائية / virions. هذا أمر بالغ الأهمية لضمان أن المركبات الكهربائية واحدة / ويتم تحليل virions. تجنب الصدف للأحداث عن طريق تشغيل عداد الكريات في التدفق المنخفض. ضمان لتحريك عملية الاستحواذ على مضان واستخدام عناصر التحكم الحجمي لقياس تركيز الكيانات التي تم التقاطها.

ومع ذلك، يمكن MNPs تجميع المركبات الكهربائية أو virions من يشابك أو عن طريق الربط بين اثنين أو أكثر virions لنفس جسيمات متناهية الصغر. للتأكد من ذلك، وهو اختبار لتجميع كما هو موضح في الشكل (4) لابد من القيام بها. virions أو المركبات الكهربائية حتى القبض على حدة قد تدخل في وقت واحد شعاع الليزر لقياس التدفق الخلوي. وهذا من شأنه خلق كاذبة الإيجابية لمدة مستضدات مختلفة. لتجنب هذا، يجب تعيين عداد الكريات تدفق كما هو موضح ويجب تخفيفه التحضيرات. يمكن للمرء أن تحقق ما إذا كان من قبيل المصادفة يحدث باستخدام نفساستراتيجية كما هو موضح في النقطة السابقة. أيضا، لعدم وجود صدفة يمكن التحقق من خلال تحليل التخفيفات المسلسل من إعداد وتثبت أن عدد الأحداث يقلل خطيا مع التخفيف في حين تبقى كثافة مضان يعني وجود مستضد الملون fluorescently ثابتة في جميع التخفيفات (الشكل 5). وثمة مسألة أخرى هي أن عدد قليل جدا من الفيروسات / المركبات الكهربائية يمكن التقاط. هذا يمكن أن يكون بسبب ندرة حقيقية من الفيروسات / المركبات الكهربائية التي تحمل مستضدات التي يتم من خلالها القبض عليهم من قبل MNPs محددة. بدلا من ذلك، وكفاءة التقاط منخفضة لأسباب مختلفة (على سبيل المثال، واقتران فعالة من الأجسام المضادة لMNPs، الانحراف عن نسب MNPs إلى virions / المركبات الكهربائية وضعت لهذا البروتوكول، وما إلى ذلك). لتجنب احتمال الأخيرة، وكفاءة التقاط ينبغي تقييم على وجه التحديد. عادة، يجب أن تكون الكفاءة حوالي 90٪ كما في الشكل (6).

يمكن أن الأجسام المضادة المختلفة تتداخل نظرا لالإعاقة الفراغية مع بعضها البعض أو مع الأجسام المضادة بالإضافة إلى MNPs. للتأكد من أن هذا لم يحدث يجب أن يتم اختبار بروتوكول القبض العكسي (كما هو موضح في القسم 7. فترة وجيزة، virions أو المركبات الكهربائية يجب أن تكون ملطخة أولا مع عبس الكشف الفلوري ومن ثم استولت عليها المجمعات أب-MNP مع فصل لاحق من عبس التعويم الحر على أعمدة المغناطيسية.

تدفق virometry له مزايا كبيرة فيما يتعلق بأساليب القائمة من تحليل تركيبة الأنتيجين من virions أو المركبات الكهربائية. وتفيد وسائل البيوكيميائية الروتينية على وجود العام للبروتينات معينة في التحضير، ولكن توفر أي معلومات عن عدم تجانس virions أو المركبات الكهربائية. وهذا يشمل immunocapture من virions أو المركبات الكهربائية على الجزيئات الكبيرة المتاحة تجاريا. هذه الجسيمات هي عادة من عدة ميكرون في القطر، ولكل واحد منهم يمكن التقاط مئات أو آلاف من virions أو المركبات الكهربائية. ولذلك، فإن أي المتوسطات تحليل لاحقة خصائص virions / المركبات الكهربائيةاستولت عليها جسيم واحد. في المقابل، يستخدم تدفق virometry MNPs من 10-15 نانومتر في القطر ومع بروتوكول صفها لا يقل عن 90٪ من الأحداث تمثل الفيريون واحد أو EV واحد.

القيد الرئيسي هو أن سكان virions أو المركبات الكهربائية في إعداد قد لا يتم تحليلها، ولكن فقط تلك التي يتم التقاطها. وهكذا، فإن اختيار مستضد يتم من خلالها القبض على virions أو المركبات الكهربائية يصبح بالغ الأهمية. أيضا، وتدفق خلافا الخلوي عدد مستضدات مختلفة (عدد الأجسام المضادة الفلورسنت ضد مستضدات مختلفة) يقتصر من قبل على سطح صغير من virions أو المركبات الكهربائية. وأخيرا، قد الأجسام المضادة المختلفة تتداخل sterically مع بعضها البعض مرة أخرى نظرا لمساحة صغيرة (مقارنة مع الخلايا).

ويمكن تكييف البروتوكول الحالي لتحليل أي فيروس أو EV من أي منشأ، شريطة أن الأجسام المضادة المحددة التي من خلالها يمكن الحصول عليها متوفرة. تحليل المستضدات على تصريح virions الفرديةالصورة الباحثين لمعالجة التسبب في كسور مختلفة من السكان الفيروسية. وعلاوة على ذلك، وتحديد المركبات الكهربائية الفردية في البلازما قد تجعل من الممكن لتتبع أصل المركبات الكهربائية لخلايا معينة وتقديم تقرير حول ظروف طبيعية أو مرضية من هذه الخلايا والأجهزة التي يقيمون فيها.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5 M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123 count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19, (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65 (2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13, (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21, (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145, (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17, (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190, (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11, (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123, (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3, (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31, (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029 (2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159, (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79, (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).
تدفق Virometry لتحليل الأنتيجين أطياف Virions وخارج الخلية الحويصلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).More

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter