Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Celler i flercellede organismer har mange individuelle træk, der kan være enten unik for en bestemt celle eller mindst hører til unikke grupper af celler. Selv dyrkede klonede celler viser individuelle karakteristika som det fremgår af deres forskelligartede morfologi. Desuden er en celles individualitet afspejles i de produkter, som udskiller. I tilfælde af viral infektion, kan virale partikler bære proteiner fra de celler, der producerede dem. For eksempel til HIV mange værtscelleproteiner er indlejret i den virale kappe og vira, der er genereret af forskellige celler kan bære disse karakteristiske proteiner 1, 2 eller "celle signaturer".
Selv uden infektion, celler frigiver i det omgivende medie små ekstracellulære vesikler (EVS). Biogenese af disse vesikler og deres struktur i mange tilfælde ligne vira, især retrovira. I de senere år er det blevet klartat elbiler, som i første omgang blev anset for at være "blodplade støv" 3, udgør en vigtig fysiologisk system af celle-celle kommunikation. Sammen med to andre systemer af intercellulære kommunikation, nemlig kontakt celle-celle interaktioner og udgivet opløselige molekyler, elbiler koordinere normal fysiologi og ændres i forskellige patologier 4, 5 herunder virusinfektioner 6, 7.
Selv om begge udgivet viruspartikler og ekstracellulære vesikler er meget forskellige, er de karakteriseret hovedsageligt ved bulk analyse, hvor deres individuelle egenskaber går tabt. Fremgangsmåde beslægtet med flowcytometri, som Fænotypers celler baseret på deres forskellige overfladeantigener, er nødvendig for at karakterisere individuelle virale og virale-lignende partikler. Desværre kan EVs eller små virioner ikke analyseres ved anvendelse af standard flow cytoMetry metoder, fordi de er for små til at generere den lysspredende signal, som de fleste cytometre afhængige for udløsning. For at omgå denne begrænsning, kan anvendes fluorescens udløsning. Men hvis elbiler eller virioner farves med fluorescerende antistoffer er det vanskeligt at skelne dem fra frie antistoffer og deres aggregater på grund af deres lignende fluorescens og sammenlignelige størrelser.
For nylig har vi udviklet en nanoteknologi-baserede high throughput metode, der gør det muligt for karakterisering af antigener på de enkelte små partikler ved hjælp af regelmæssig flowcytometre 8, 9. Vi beskæftiger MNP'er til immunocapture partikler af interesse, som er blevet beskrevet af andre grupper til forskellige formål 10, 11, 12, 13; men vores ny teknik giver mulighed for fangst af enkelte speciFIC mål efterfulgt af fænotypebestemmelse af disse indfangede partikler ved flowcytometri under anvendelse af fluorescens udløser snarere end lysspredning, uden indblanding fra fritflydende antistoffer. Denne fremgangsmåde har bred anvendelse og kan anvendes til at karakterisere den antigene sammensætning ifølge ethvert virus- og ikke-viral lille partikel genereret af celler in vivo og in vitro billede tilgængeligheden af specifikke fluorescerende antistoffer mod overfladeantigener. Vi har allerede anvendt denne teknik til at undersøge flere biologiske problemer.
Især vi vurderet fordelingen af værten cellemarkører på individuelle HIV-1 partikler 9, vi studerede modningen af individuelle Dengue virus (DENV) baseret på analyser af deres overfladeproteiner 14 og undersøgt elbiler frigives til blodbanen af raske frivillige og patienter med akut koronart syndrom (ACS). Selvom baseret på et lignende princip, denanvendelsen af den nye teknik krævede udvikling af specifikke protokoller, der er beskrevet nedenfor.
Konventionelle flowcytometre fortsat være den vigtigste redskab til at analysere celler baseret på deres fysiske og kemiske egenskaber på et individuelt niveau 18. De grundlæggende principper for flowcytometri ikke er blevet ændret siden dens udvikling: en celle, der passerer gennem laserstrålen og spreder lys udgør en hændelse, der udløser optagelse af det fluorescerende spektre udsendes af cellebundne fluorescerende antistoffer. Ikke kan påvises mindre partikler under 300 nm ved sidespredning af et cytometer, som de spreder mere lys under større vinkler, hvor de fleste Flowcytometer ikke indsamler lys 18. Den her beskrevne teknik, muliggør identifikation og analyse af flere antigener på talrige individuelle virus eller elbiler med konventionelle flowcytometre med fluorescens udløsning.
De kritiske skridt i protokollen er koblingen af antistoffer mod MNP'er. Vores eksperimenter blev forbedre præstationenwith anvendelse af 15 nm jernoxid nanopartikler med carboxylsyre som en reaktiv gruppe som beskrevet tidligere 9. Ifølge producenten, kan hver 15 nm MNP binder maksimalt 20 antistoffer; Vi binder cirka 10 antistoffer pr 15 nm MNP. Dette skøn er baseret på mængden af antistoffer før og efter kobling, og antallet af perler / ml målt ved nanopartikel karakterisering og dimensionering instrumentering. I princippet kan kobling forårsage aggregering af partikler og er uønsket. For at kontrollere at sammenlægning ikke sker med vores protokol, vi verificeret dette med nanopartikel karakterisering og dimensionering instrumentering. Dette instrument måler den hydrodynamiske diameter for partiklerne, som omfatter overtrækket og antistof-lag snarere end 15 nm kerne alene. Vi fandt, at størstedelen af koblede perler er placeret på en enkelt top (middel top på 64,7 ± 4,2 nm med 90% af alle hændelser under 73 ± 7,3 nm). Blandingen af Ab-MNP complexes med virioner eller elbiler i det rette forhold er vigtigt, så MNP'er er i koncentrationen af flere ordrer højere end EVS / virioner. Dette er kritisk for at sikre, at enkelte elbiler / virioner analyseres. Undgå sammenfald af begivenheder ved at køre cytometer ved lavt flow. Sikre at udløse erhvervelse på fluorescens og bruge volumetriske kontroller til at måle koncentrationen af tilfangetagne enheder.
Dog kan MNP'er aggregere EVs eller virioner ved tværbinding eller ved binding af to eller flere virioner til samme nanopartikel. For at kontrollere dette, en test for sammenlægning, som beskrevet i figur 4 skal udføres. Selv individuelt tilfangetagne virioner eller elbiler samtidig kan indtaste laserstrålen af flowcytometeret. Dette ville skabe falsk-positivitet for to forskellige antigener. For at undgå dette skal flowcytometeret indstilles som beskrevet og forberedelserne skal fortyndes. Man kan kontrollere, om tilfældighed, der sker ved anvendelse af den sammestrategi som beskrevet i det foregående punkt. Også kunne manglende sammenfald verificeres ved at analysere serielle fortyndinger af præparatet og bevise, at antallet af hændelser aftager lineært med fortyndingen medens den gennemsnitlige fluorescensintensitet af en fluorescens farvede antigen forbliver konstant i alle fortyndinger (figur 5). Et andet problem er, at for få virus / elbiler kan indfanges. Dette kan skyldes den sande knaphed af virus / elbiler, der bærer antigener, hvorigennem de indfanges af specifikke MNP'er. Alternativt effektivitet fange er lav på grund af forskellige årsager (f.eks ineffektiv kobling af antistoffer mod MNP'er, afvigelse fra forholdene mellem MNP'er til virioner / elbiler udviklet til denne protokol, etc.). For at undgå denne sidstnævnte mulighed, bør effektiviteten af indfangning specifikt evalueres. Typisk bør effektiviteten være omkring 90% som i figur 6.
Forskellige antistoffer kan forstyrre grundsterisk hindring med hinanden eller med de antistoffer koblet til MNP'er. For at kontrollere, at dette ikke skete en omvendt capture-protokol skal testes (som beskrevet i afsnit 7. Kort fortalt, virioner eller elbiler skal først farves med fluorescerende påvisning Abs og derefter fanget af Ab-MNP komplekser med efterfølgende adskillelse fra gratis flydende Abs på magnetiske kolonner.
Flow virometry har betydelige fordele i forhold til eksisterende metoder til analyse af den antigene sammensætning af virioner eller elbiler. Rutinemæssige biokemiske metoder rapportere om den generelle forekomst af bestemte proteiner i forberedelserne, men giver ingen oplysninger om heterogenitet af viruspartikler eller elbiler. Dette omfatter immunocapture af virioner eller elbiler på store kommercielt tilgængelige partikler. Sådanne partikler er typisk af flere mikrometer i diameter, og hver af dem kan fange hundredvis eller tusindvis af virioner eller elbiler. Derfor eventuelle efterfølgende analyse gennemsnit egenskaberne af de virioner / elbilerfanget af en partikel. I modsætning hertil flow virometry bruger MNP'er på 10-15 nm i diameter og med den beskrevne protokol mindst 90% af begivenheder repræsentere en enkelt virion eller enkelt EV.
Den væsentligste begrænsning er, at hele populationen af virioner eller elbiler i præparatet ikke kan analyseres, men kun dem, der er fanget. Således er valget af antigenet hvorigennem virioner eller elbiler indfanges bliver kritisk. Også, ulig flowcytometri antallet af forskellige antigener (antallet af fluorescerende antistoffer mod forskellige antigener) begrænset af den lille overflade af virioner eller elbiler. Endelig kan forskellige antistoffer sterisk interferere med hinanden igen på grund af den lille (sammenlignet med cellerne) overflade.
Den nuværende protokol kan tilpasses til analyse af vira eller EV af enhver oprindelse, forudsat at de specifikke antistoffer, hvorigennem de kan indfanges er tilgængelige. Analyse af antigener på individuel virioner tilladelses forskere til at løse patogenesen af forskellige fraktioner af virale populationer. Endvidere kan identificere de enkelte elbiler i plasma gør det muligt at spore oprindelsen af elbiler til bestemte celler og rapportere om normale eller patologiske tilstande i disse celler og organer, hvor de bor.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |