Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler

doi: 10.3791/55020 Published: January 25, 2017

Introduction

Celler i flercellede organismer har mange individuelle træk, der kan være enten unik for en bestemt celle eller mindst hører til unikke grupper af celler. Selv dyrkede klonede celler viser individuelle karakteristika som det fremgår af deres forskelligartede morfologi. Desuden er en celles individualitet afspejles i de produkter, som udskiller. I tilfælde af viral infektion, kan virale partikler bære proteiner fra de celler, der producerede dem. For eksempel til HIV mange værtscelleproteiner er indlejret i den virale kappe og vira, der er genereret af forskellige celler kan bære disse karakteristiske proteiner 1, 2 eller "celle signaturer".

Selv uden infektion, celler frigiver i det omgivende medie små ekstracellulære vesikler (EVS). Biogenese af disse vesikler og deres struktur i mange tilfælde ligne vira, især retrovira. I de senere år er det blevet klartat elbiler, som i første omgang blev anset for at være "blodplade støv" 3, udgør en vigtig fysiologisk system af celle-celle kommunikation. Sammen med to andre systemer af intercellulære kommunikation, nemlig kontakt celle-celle interaktioner og udgivet opløselige molekyler, elbiler koordinere normal fysiologi og ændres i forskellige patologier 4, 5 herunder virusinfektioner 6, 7.

Selv om begge udgivet viruspartikler og ekstracellulære vesikler er meget forskellige, er de karakteriseret hovedsageligt ved bulk analyse, hvor deres individuelle egenskaber går tabt. Fremgangsmåde beslægtet med flowcytometri, som Fænotypers celler baseret på deres forskellige overfladeantigener, er nødvendig for at karakterisere individuelle virale og virale-lignende partikler. Desværre kan EVs eller små virioner ikke analyseres ved anvendelse af standard flow cytoMetry metoder, fordi de er for små til at generere den lysspredende signal, som de fleste cytometre afhængige for udløsning. For at omgå denne begrænsning, kan anvendes fluorescens udløsning. Men hvis elbiler eller virioner farves med fluorescerende antistoffer er det vanskeligt at skelne dem fra frie antistoffer og deres aggregater på grund af deres lignende fluorescens og sammenlignelige størrelser.

For nylig har vi udviklet en nanoteknologi-baserede high throughput metode, der gør det muligt for karakterisering af antigener på de enkelte små partikler ved hjælp af regelmæssig flowcytometre 8, 9. Vi beskæftiger MNP'er til immunocapture partikler af interesse, som er blevet beskrevet af andre grupper til forskellige formål 10, 11, 12, 13; men vores ny teknik giver mulighed for fangst af enkelte speciFIC mål efterfulgt af fænotypebestemmelse af disse indfangede partikler ved flowcytometri under anvendelse af fluorescens udløser snarere end lysspredning, uden indblanding fra fritflydende antistoffer. Denne fremgangsmåde har bred anvendelse og kan anvendes til at karakterisere den antigene sammensætning ifølge ethvert virus- og ikke-viral lille partikel genereret af celler in vivo og in vitro billede tilgængeligheden af specifikke fluorescerende antistoffer mod overfladeantigener. Vi har allerede anvendt denne teknik til at undersøge flere biologiske problemer.

Især vi vurderet fordelingen af værten cellemarkører på individuelle HIV-1 partikler 9, vi studerede modningen af individuelle Dengue virus (DENV) baseret på analyser af deres overfladeproteiner 14 og undersøgt elbiler frigives til blodbanen af raske frivillige og patienter med akut koronart syndrom (ACS). Selvom baseret på et lignende princip, denanvendelsen af ​​den nye teknik krævede udvikling af specifikke protokoller, der er beskrevet nedenfor.

Protocol

1. Kobling af Magnetiske nanopartikler (MNP'er)

  1. Brug kommerciel koblingsprocedure og reagenser til de par MNP'er med antistoffer (Abs) (typisk 1 mg). Jernoxid nanopartikler med carboxylsyre som reaktive grupper anvendes.
    1. Hvis antistoffer er i et volumen højere end 0,5 ml, koncentrat bruge en 100K koncentrator. Spin ved 2.000 xg i 3-5 min.
  2. Ved afslutningen af ​​proceduren, efter tilsætning af 10 pi af quenching-buffer, overføre MNP'er til et 12 mm x 75 mm rør og tilsættes 3 ml vaske / opbevaringsbuffer. Glasset anbringes i hullet i midten af ​​en magnetisk separator og efterlade natten over ved 4 ° C.
  3. Kontroller, at MNP'er har alle indsamlet til siden af ​​røret, og derefter forsigtigt pipetteres ud al væske. Tilsæt 3 ml frisk vask / opbevaringspuffer, og anbring igen magneten.
  4. Efter flere timer, kontrollere, om MNP'er opsamles til siden af ​​røret og derefter pipetteres off væsken. Brug 2 ml vaske / storage buffer tilresuspender MNP'er og opbevares ved 4 ° C.
  5. Kontroller, at Abs er koblet til MNP'er ved mærkning dem med en relevant fluorescerende Fab antistoffragment (f.eks gede anti-mus, hvis du bruger en mus monoklonalt Ab fangst- som beskrevet i afsnit 2) og køre på et flowcytometer.

2. mærkning af antistoffer koblet til MNP'er

  1. Kombiner 60 pi (3,9 x 10 12 partikler) af MNP'er (pr betingelse) og 5 pi (af en 200 ug / ml kommerciel opløsning) mærket Fab-fragmenter, der er specifikke for isotype indfangning Ab i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
  2. Der inkuberes ved stuetemperatur (RT) i 30 minutter under kontinuerlig blanding.
  3. Pre-våde en 100K koncentrator med 300 pi phosphatpufret saltvand (PBS) og centrifugering i en mikrocentrifuge ved 1.500 xg i 5 min.
  4. Oprens mærkede komplekser på 100K kolonne. Spin blandingen fra trin 2.2 i en mikrocentrifuge ved 1.500 xg i 5 minutter, vask med 200 pi PBS, og komme sig ioprindelige volumen.

3. Brug af mærket Ab-MNP komplekser til at opfange partikler interessepunkt (virus eller elbiler)

  1. Inkubér pre-mærket MNP'er 60 pi (3,9 x 10 12 partikler) med HIV (60 pi) eller EV forberedelse (100 pi).
    1. Forbered EV præparater med forskellige metoder. Her rense elbiler på sucrosegradienter, samle dem fra blodpladefattigt plasma ved hjælp exosome nedbør reagenser eller isolere direkte fra plasma 8.
      BEMÆRK: Optimale forhold skal bestemmes for hvert forsøg og er afhængige af koncentrationen af ​​virus / EV i præparatet. MNP-Ab fraktion bør være ~ 10 6 i overskud sammenlignet med koncentrationen af virus / VE fraktion.
  2. Inkuber 40 min ved 37 ° C under forsigtig blanding for virus, eller 1 time ved 4 ° C i elbiler.
  3. Tilføj 2,5% muse-IgG / humant IgG til at blokere Fc-binding, forsigtigt vortex, inkuber 3-5 minutter ved stuetemperatur.
  4. Tilføj fabrikanten anbefalede eller titrerede koncentrationer af hvert påvisning Ab'er og inkuberes i yderligere 20 minutter ved stuetemperatur.

4. Adskillelse af MNP-tilfangetagne Virioner (eller elbiler) fra Unbound Antistoffer Brug Magnetiske kolonner

  1. Forbered magnetiske separation kolonne til anvendelse ved at placere det i en separator magnet.
  2. Pre-våd søjlen med 500 pi vaskebuffer (2 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS). Tillad vaskepufferen at strømme gennem søjlen.
  3. Tilsæt MNP-virus / MNP-EV-komplekser til søjlen og tillade al væske at flyde igennem. Der tilsættes 500 pi vaskebuffer til søjlen, så hele volumenet at passere igennem.
  4. Gentag vask med vaskebuffer 2 flere gange.
  5. Fjern kolonnen fra magneten og sted i 12 mm x 75 mm rør til opsamling af de tilbageholdte MNP-virus / MNP-EV-komplekser. Lad kolonnen stå i røret fra magneten i 3 min. Tilsæt 200 pi PBS og ladperlerne flyde ned af tyngdekraften, tilføje yderligere 200 pi PBS, og fastgør med 200 pi 4% paraformaldehyd efter eluering.
    BEMÆRK: Paraformaldehyd er et mistænkt carcinogen, og skal håndteres i et ventileret hætte og handsker skal bæres.
  6. For at kvantificere enkelt virioner / elbiler bruger volumetriske indstillinger på High Throughput Sampler (HTS) eller lige før overtagelsen add godt blandet flowcytometri tæller perler.

5. Analyse af MNP'er-tilfangetagne Vira / elbiler med et flowcytometer

  1. Varm op flowcytometer i 30 min.
  2. Kør kvalitetskontrol perler.
  3. Indstil tærskel på fluorescens af enten MNP'er eller mærket virus / elbiler. Bruge 0,22 um filtreret PBS i tærskel for at mindske baggrunden "støj". Sætte tærsklen ved at justere PMT spænding på det niveau, hvor filtreret PBS giver ingen eller meget få, events.
  4. Kør prøver på lav. (Brug en ekstra 0,04 um inline filter til sheathvæske placeret i serie bagstandard 0,2 um kappe filter for yderligere at eliminere falske hændelser).

6. Evaluering af Capture Efficiency

  1. Capture fluorescensmærkede elbiler eller HIV med MNP-Abs som beskrevet i 3.1, 3.2. (Elbiler kan mærkes enten med en membran farvestof eller gennem deres last 15; HIV kan mærkes enten ved gen-kodet farvestof 16, eller med en membran farvestof 12, 17).
  2. Forbered magnetiske separation søjle som beskrevet i (4,1-4,2).
  3. Tilsæt MNP-virus / MNP-EV-komplekser til søjlen og tillade al væske at strømme gennem (gennemstrømning fraktion). Saml gennemstrømningsfraktionen i røret.
  4. Fortsæt med fraktion tilbageholdt på kolonnen, som beskrevet i (4,4-4,5).
  5. Gentag procedure fange på gennemstrømningsfraktionen fra 6,3 med efterfølgende adskillelse (4.1-4.5).
  6. Analyser de tilbageholdte fraktioner fra første capture og anden fange ved at køre dem på cytometer, der er indstillet på at udløse på fluorescerende mærke af elbiler eller HIV. For at evaluere effektiviteten, sammenligne antallet af hændelser i begge fraktioner.

7. Tilpasning af protokollen om specifikke opgaver

BEMÆRK: Når protokollen kan anvendes til analyse af HIV og elbiler som beskrevet ovenfor, til analyse af DENV bør indføres følgende modifikationer:

  1. Inkuber virioner med 1 uM Dil i mørke i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation oprense farves virus ved centrifugering i densitetsgradient medium (10%, 20%, 25% og 35%) ved 240.000 xg i 1,5 timer ved 4 ° C uden bremse. Indsamle fraktion mellem 20% og 25% densitetsgradient medium lag 14.
  2. Inkuber Dil mærkede DENV 1 x 10 7 (60 pi) med koncentrationer af detektion Ab anbefalet eller titreret producenten i nærvær af 2,5% muse-IgG i 20 minutter ved stuetemperatur.
  3. Incubspiste blanding med præ-mærkede 60 pi (3,9 x 10 12 partikler) MNP-capture Ab-komplekser i 40 minutter ved 37 ° C under forsigtig blanding.
  4. Separate resulterende komplekser fra ubundet Abs på magnetiske kolonner som beskrevet ovenfor og analysere på flowcytometer.

Representative Results

Selektiv fangst af cellulære antigener ved HIV-1 virioner

Med "flow virometry" er det nu muligt at visualisere cellulære antigener på individuelle virale partikler. Som et eksempel har vi fokuseret på to cellulære antigener båret af HIV-1, LFA-1 og HLA-DR. Tidligere disse to antigener blev identificeret i HIV-1 præparater analyseret i løs vægt 1. Vi forberedt MNP'er koblet med et af antistofferne mod Env HIV-protein, VRC01, og taget med disse MNP'er HIV-1-virioner (HIV-1 LAI.04 eller HIV-1 SF162 produceret i randområder mononukleære blodceller (PBMC'er)). Desuden har vi farves disse virioner med 2G12, et andet anti-Env-antistof. Flow virometry viste en høj heterogenitet af HIV-1-virioner vedrørende tilstedeværelsen af ​​LFA-1 og HLA-DR. I gennemsnit 16,7 ± 2,0% (n = 6) og 8,6 ± 0,3% (n = 3) af HIV-1 LAI.04 virioner udført LFA-1 og HLA-DR,henholdsvis. Kun 4,8 ± 0,6% (n = 3) af alle virioner var positive for begge antigener. På den anden HIV-1-stamme, HIV-1 SF162, disse antigener var til stede på 20,0 ± 4,4% (n = 6) og 10,8 ± 1,3% (n = 6) af virioner henholdsvis hvorimod begge antigener blev udført med 6,5 ± 0,4% (figur 1).

Fordelingen af ​​de cellulære proteiner var afhængig af de celler, der replikerede virus. HIV-inficerede Jurkat-celler producerede virioner antigent forskellige fra dem, der produceres af inficerede PBMC'er. Virioner af HIV-1 LAI 0,4 produceret af Jurkat-celler gennemføres 1,6 ± 1,4% (n = 3) og 1,6 ± 0,7% (n = 4) LFA-1 og HLA-DR hhv. For HIV-1 SF162 virioner produceret i Jurkat-celler, disse parametre var 7,2 ± 2,5% (n = 3) og 5,6 ± 2,7% af (n = 4). Således antigene makeup (mindst for HLA-DR og LFA-1) var forskellig for HIV-1 LAI.04 produceret af to forskellige celletyper (p <0,02).

Flow virometry som anvendes på evalueringen af ​​Dengue-virus

DENV modning er associeret med ekspressionen af ​​prM protein på virionerne. Vi anvendte flow virometry at vurdere, hvad brøkdel af DENV produceret i BHK-1 og i LoVo celler udgør modne virus. Virioner blev farvet med et lipid farvestof Dil. Analyse af individuelle tilfangetagne virioner afslørede prM på 48,2 ± 5,3% (n = 8) af DENVs. I modsætning hertil 84,5 ± 3,4% (n = 4) af DENV produceret i LoVo celler transporteres prM. Resten af virionerne, henholdsvis 51,8 ± 5,3% (n = 8) og 15,5 ± 3,4% (n = 4) var prM negative (figur 2). Således kan flow virometry anvendes til at skelne fuldt modne individuel DENV fra umodne (eller delvist modne) DENV virioner.

Ekstracellulære vesikler frigives i blodbanen af ​​sundefrivillige og patienter med akut koronart syndrom (ACS)

For at undersøge forskellige EV delgrupper i patienter med ACS og raske kontroller, vi fangede elbiler fra blodpladefattigt plasma (PPP) ved fluorescerende MNP'er-koblet med antistoffer mod CD31, CD41a, eller CD63. Elbiler fanget af CD31-MNP'er blev farvet for CD41a og CD63, elbiler fanget af CD41a-MNP'er blev farvet for CD31 og CD63, og elbiler fanget af CD63-MNP'er blev farvet for CD31 og CD41a (figur 3).

Mængden af ​​elbiler fanget af CD31-MNP'er og positive for en eller to af afsløring antistoffer i ACS patienter var 3359 [2328; 5.472] elbiler / pl sammenlignet med 1272 [714; 2.157] elbiler / pi hos raske frivillige (p = 0,001). Den samlede mængde elbiler fanget af CD63 i ACS patienter sammenlignet med raske frivillige var 3541 [1318; 5173] elbiler / ul vs. 806 [488; 2.112] elbiler / pi (p = 0,007). Der var 4752 [3238; 7.173] elbiler / ul i plasma af patienter med AKS fanget af CD41a-MNP'er, mens dette tal i plasma af raske frivillige var signifikant lavere, 2623 [1927; 4.188] elbiler / ul (p = 0,015). Generelt vores resultater viser, at mens EV beløbene meste blev forøget i ACS patienter, størrelsen af ​​stigningen var forskellige i forskellige sub-populationer af elbiler.

figur 1
Figur 1: Selektiv inkorporering af cellulære antigener i HIV-1-virioner at replikere i forskellige celletyper. HIV (HIV-1 LAI.04 eller HIV-1 SF162) virioner frigivet af PBMC'er eller Jurkat-celler blev fanget med VRC01-MNP'er og farvet med andet anti-gp120 antistof 2G12 og med specifikke antistoffer mod HLA-DR og LFA-1. De farvede præparater blev underkastet flow-analyse for HLA-DR (hvide søjler) og LFA-1 (sort bars). Middelværdier ± SEM af tre til seks eksperimenter 9. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2
Figur 2: Modning stat DENV virioner. DENV fremstillet i BHK-21-celler (A, B) eller i LoVo celler (C, D) blev mærket med lipid-farvestof Dil og efter ultracentrifugering i densitetsgradient medium, farvet for prM protein med 2H2 antistoffer (A, C) eller med isotypekontrol IgG2a (B, D). De mærkede virioner blev derefter optaget med 3H5-1-MNP'er og underkastet flow-analyse 14. Klik her for at se en større version af dennefigur.

Figur 3
Figur 3: Analyse af elbiler fra ACS patienter og raske kontrolpersoner. Plasma elbiler blev fanget med CD31-MNP'er, CD63-MNP'er eller CD41a-MNP'er og farvet med antistoffer mod CD41a og CD63, mod CD31 og CD41a og mod CD31 og CD63 hhv. Tilfangetagne elbiler, farves med mindst en af ​​påvisning Abs, blev visualiseret og optalt i flow analyse. Data, præsenteret som dot plot med median og interkvartile område (IQR). Grønne symboler: raske frivillige (kontroller), brune symboler: AKS patienter. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Evaluatipå af den del af strømningsbegivenheder der repræsenterer individuelle virioner. (A) HIV-1. Suspension af virioner blev delt i to dele og farves enten med gjorde (venstre panel) eller DiO (midterste panel). Efter blanding, suspension, der indeholdt to forskelligt farvede virioner, blev fanget med VRC01-MNP'er og udsat for flow virometry (højre panel). Aggregater (dual-farvede begivenheder) udgjorde mindre end 10% af de samlede hændelser. (B - D) DENV. Suspension af Dil-farvede virioner blev seriefortyndet to gange fra 1: 2 til 1: 256 og erhvervet med HTS på et flowcytometer (B). Dil-DENVs blev mærket med 2H2 antistoffer (C) eller Dil-DENVs blev fanget med 3H5-1-MNP'er (D). Præparater C og D blev derefter seriefortyndet to gange fra 1: 2 til 1: 256 og erhvervet med HTS 14. Virioner synes ikke at aggregere da i alle tilfældeer en lineær sammenhæng mellem fortyndingsfaktoren og antallet af begivenhederne. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5
Figur 5: Detektion af enkeltpartikler af flowcytometer. Dil-farvet DENV suspension blev seriefortyndet to gange fra 1: 2 til 1: 2.048 og erhvervet under anvendelse af en HTS på et flowcytometer. (A) Antal virus detekteres som en funktion af fortyndingsfaktoren. (B) Median fluorescensintensitet (MFI) af Dil mærkede DENV 14. Klik her for at se en større version af dette tal.

"Figur Figur 6: Evaluering af den del af virioner og ekstracellulære vesikler taget med MNP'er koblet til specifikke antistoffer. Mærkede HIV-1 virioner eller elbiler blev fanget med MNP'er koblet til specifikke antistoffer og underkastet flyde virometry. Efter separation på magnetiske søjler blev gennemløbet (ikke medtaget) fraktioner analyseres for tilstedeværelsen af ​​virioner eller elbiler af interesse, som blev overset i den første kørsel. (A) Mærkede HIV-1-BAL virioner blev indfanget med 2G12-MNP'er (venstre panel). Gennemløbet fraktion blev fanget igen og udsat for flow virometry (højre panel). I den første cyklus omkring 95% af virionerne af interesse blev fanget. (B) Mærkede elbiler blev indfanget med anti-CD81 MNP'er og isoleret på magnetiske kolonner (venstre panel). Gennemløbet fraktion blev igen fanget og analyseret (højre panel). I det førstecyklus omkring 99% af vesiklerne af interesse blev fanget 8. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Konventionelle flowcytometre fortsat være den vigtigste redskab til at analysere celler baseret på deres fysiske og kemiske egenskaber på et individuelt niveau 18. De grundlæggende principper for flowcytometri ikke er blevet ændret siden dens udvikling: en celle, der passerer gennem laserstrålen og spreder lys udgør en hændelse, der udløser optagelse af det fluorescerende spektre udsendes af cellebundne fluorescerende antistoffer. Ikke kan påvises mindre partikler under 300 nm ved sidespredning af et cytometer, som de spreder mere lys under større vinkler, hvor de fleste Flowcytometer ikke indsamler lys 18. Den her beskrevne teknik, muliggør identifikation og analyse af flere antigener på talrige individuelle virus eller elbiler med konventionelle flowcytometre med fluorescens udløsning.

De kritiske skridt i protokollen er koblingen af ​​antistoffer mod MNP'er. Vores eksperimenter blev forbedre præstationenwith anvendelse af 15 nm jernoxid nanopartikler med carboxylsyre som en reaktiv gruppe som beskrevet tidligere 9. Ifølge producenten, kan hver 15 nm MNP binder maksimalt 20 antistoffer; Vi binder cirka 10 antistoffer pr 15 nm MNP. Dette skøn er baseret på mængden af ​​antistoffer før og efter kobling, og antallet af perler / ml målt ved nanopartikel karakterisering og dimensionering instrumentering. I princippet kan kobling forårsage aggregering af partikler og er uønsket. For at kontrollere at sammenlægning ikke sker med vores protokol, vi verificeret dette med nanopartikel karakterisering og dimensionering instrumentering. Dette instrument måler den hydrodynamiske diameter for partiklerne, som omfatter overtrækket og antistof-lag snarere end 15 nm kerne alene. Vi fandt, at størstedelen af ​​koblede perler er placeret på en enkelt top (middel top på 64,7 ± 4,2 nm med 90% af alle hændelser under 73 ± 7,3 nm). Blandingen af ​​Ab-MNP complexes med virioner eller elbiler i det rette forhold er vigtigt, så MNP'er er i koncentrationen af ​​flere ordrer højere end EVS / virioner. Dette er kritisk for at sikre, at enkelte elbiler / virioner analyseres. Undgå sammenfald af begivenheder ved at køre cytometer ved lavt flow. Sikre at udløse erhvervelse på fluorescens og bruge volumetriske kontroller til at måle koncentrationen af ​​tilfangetagne enheder.

Dog kan MNP'er aggregere EVs eller virioner ved tværbinding eller ved binding af to eller flere virioner til samme nanopartikel. For at kontrollere dette, en test for sammenlægning, som beskrevet i figur 4 skal udføres. Selv individuelt tilfangetagne virioner eller elbiler samtidig kan indtaste laserstrålen af ​​flowcytometeret. Dette ville skabe falsk-positivitet for to forskellige antigener. For at undgå dette skal flowcytometeret indstilles som beskrevet og forberedelserne skal fortyndes. Man kan kontrollere, om tilfældighed, der sker ved anvendelse af den sammestrategi som beskrevet i det foregående punkt. Også kunne manglende sammenfald verificeres ved at analysere serielle fortyndinger af præparatet og bevise, at antallet af hændelser aftager lineært med fortyndingen medens den gennemsnitlige fluorescensintensitet af en fluorescens farvede antigen forbliver konstant i alle fortyndinger (figur 5). Et andet problem er, at for få virus / elbiler kan indfanges. Dette kan skyldes den sande knaphed af virus / elbiler, der bærer antigener, hvorigennem de indfanges af specifikke MNP'er. Alternativt effektivitet fange er lav på grund af forskellige årsager (f.eks ineffektiv kobling af antistoffer mod MNP'er, afvigelse fra forholdene mellem MNP'er til virioner / elbiler udviklet til denne protokol, etc.). For at undgå denne sidstnævnte mulighed, bør effektiviteten af ​​indfangning specifikt evalueres. Typisk bør effektiviteten være omkring 90% som i figur 6.

Forskellige antistoffer kan forstyrre grundsterisk hindring med hinanden eller med de antistoffer koblet til MNP'er. For at kontrollere, at dette ikke skete en omvendt capture-protokol skal testes (som beskrevet i afsnit 7. Kort fortalt, virioner eller elbiler skal først farves med fluorescerende påvisning Abs og derefter fanget af Ab-MNP komplekser med efterfølgende adskillelse fra gratis flydende Abs på magnetiske kolonner.

Flow virometry har betydelige fordele i forhold til eksisterende metoder til analyse af den antigene sammensætning af virioner eller elbiler. Rutinemæssige biokemiske metoder rapportere om den generelle forekomst af bestemte proteiner i forberedelserne, men giver ingen oplysninger om heterogenitet af viruspartikler eller elbiler. Dette omfatter immunocapture af virioner eller elbiler på store kommercielt tilgængelige partikler. Sådanne partikler er typisk af flere mikrometer i diameter, og hver af dem kan fange hundredvis eller tusindvis af virioner eller elbiler. Derfor eventuelle efterfølgende analyse gennemsnit egenskaberne af de virioner / elbilerfanget af en partikel. I modsætning hertil flow virometry bruger MNP'er på 10-15 nm i diameter og med den beskrevne protokol mindst 90% af begivenheder repræsentere en enkelt virion eller enkelt EV.

Den væsentligste begrænsning er, at hele populationen af ​​virioner eller elbiler i præparatet ikke kan analyseres, men kun dem, der er fanget. Således er valget af antigenet hvorigennem virioner eller elbiler indfanges bliver kritisk. Også, ulig flowcytometri antallet af forskellige antigener (antallet af fluorescerende antistoffer mod forskellige antigener) begrænset af den lille overflade af virioner eller elbiler. Endelig kan forskellige antistoffer sterisk interferere med hinanden igen på grund af den lille (sammenlignet med cellerne) overflade.

Den nuværende protokol kan tilpasses til analyse af vira eller EV af enhver oprindelse, forudsat at de specifikke antistoffer, hvorigennem de kan indfanges er tilgængelige. Analyse af antigener på individuel virioner tilladelses forskere til at løse patogenesen af ​​forskellige fraktioner af virale populationer. Endvidere kan identificere de enkelte elbiler i plasma gør det muligt at spore oprindelsen af ​​elbiler til bestemte celler og rapportere om normale eller patologiske tilstande i disse celler og organer, hvor de bor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5 M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123 count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19, (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65 (2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13, (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21, (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145, (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17, (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190, (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11, (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123, (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3, (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31, (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029 (2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159, (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79, (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).
Flow Virometry at analysere Antigen Spectra af Virioner og ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).More

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter