Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
다세포 생물의 세포는 특정 세포에 대해 고유 될 적어도 세포의 고유 한 그룹에 속할 수 많은 개인 기능을 가지고 있습니다. 자신의 다양한 형태에 의해 입증도 배양 복제 된 세포는 각각의 특성을 보여줍니다. 또한, 셀의 개성이 분비 제품에 반영된다. 바이러스 감염의 경우, 바이러스 입자들을 생성 세포로부터 단백질을 수행 할 수있다. 예를 들어, HIV 많은 숙주 세포 단백질은 바이러스 외피에 포함되어 다른 셀들에 의해 생성 된 바이러스는 단백질 특성이 1, 2 또는 "셀 서명"을 운반 할 수있다.
심지어 감염없이, 세포는 주변 매체 작은 세포 외 소포 (전기 자동차)에 놓습니다. 이 소포 많은 경우에 그 구조의 생합성은, 바이러스의 특히 레트로 바이러스를 그 유사. 최근 몇 년 동안이 명백 해졌다초기 "혈소판 먼지"(3)로 간주 하였다 전기차는 세포 간 통신의 중요한 생리 학적 시스템을 구성하고있다. 함께 간 통신, 즉 세포 – 세포 접촉 상호 작용과 발표 수용성 분자의 두 개의 다른 시스템과, 전기 자동차 정상적인 생리를 조정하고 다양한 병리 바이러스 감염 6, 7을 포함, 4, 5로 변경된다.
발표 바이러스 입자와 세포 외 소포 모두가 매우 다양하지만, 그들은 그들의 각각의 특성이 손실되는 대량 분석에 의해 주로 특징이다. 서로 다른 표면 항원에 기초하여 세포 표현형을 유세포 유사한 방법이, 각각의 바이러스 및 바이러스 – 유사 입자를 특성화하는데 필요하다. 불행히도, 전기 자동차 또는 작은 비리 표준 플로우 사이토을 사용하여 분석 할 수없는metry 방법은 대부분의 세포 계측기가 트리거 의존하는 광 산란 신호를 생성하기에는 너무 작기 때문이다. 이 한계를 회피하기 위해, 트리거 형광 적용 할 수있다. 전기 자동차 또는 비리가 형광 항체로 염색하는 경우 그러나, 그것은 때문에 비슷한 형광과 유사한 크기의 무료 항체 및 집계 구별하기가 어렵습니다.
최근에, 우리는 규칙적인 흐름 세포 계측기 8, 9를 사용하여 각각의 작은 입자에 항원의 특성을 가능하게하는 나노 기술 기반의 높은 처리량 방법을 개발했다. 다양한 어플리케이션 10, 11, 12, 13 다른 그룹에 의해 기술 된 바와 같이 우리가 관심 immunocapture 입자에 고용 MNPS; 그러나, 우리의 새로운 기술은 개별 정시의 캡처 할 수 있습니다FIC 대상 무료 부동 항체의 간섭없이, 빛의 산란이 아닌 트리거 형광을 사용하여 유동 세포 계측법에 의해이 캡처 된 입자의 표현형 하였다. 이 방법은 광범위한 응용을 가지며, 생체 내에서 세포에 의해 생성 된 viral- 비 바이러스 작은 입자의 항원 성 조성물을 특성화하는데 사용될 수 있고 체외 표면 항원에 대한 특이 항체를 형광의 가용성을 제공 하였다. 우리는 이미 여러 생물학적 문제를 연구하는이 기술을 적용했습니다.
특히, 우리는 각각의 HIV-1 입자 9 숙주 세포 마커의 분포를 평가, 우리는 그 표면 단백질 (14)의 분석에 기초하여 개개의 뎅기 바이러스 (DENV)의 성숙을 연구 건강한 지원자 및 환자의 혈류로 방출 전기차 조사 급성 관상 동맥 증후군 (ACS)와 함께. 유사한 원리에 기초하지만,새로운 기술의 적용은 아래에 설명되어 특정 프로토콜의 개발이 필요합니다.
종래의 유동 세포 계측기 개별 레벨 (18)에 물리적, 화학적 특성에 기초하여 세포를 분석하기위한 중요한 도구가 남아있다. 흐름의 기본 원리는 계측법 개발 이후 변경되지 않았 : 레이저 빔을 통과하여 빛을 산란 세포는 세포 – 결합 형광성 항체에 의해 방출 된 형광 스펙트럼의 기록을 트리거하는 이벤트를 구성한다. 그들은 대부분 18 광 수집하지 않습니다 사이토 흐름하는 더 큰 각도에 따라 더 많은 빛을 산란으로 300 나노 미터 아래 작은 입자는 사이토의 측면 산란에 의해 감지 할 수 없습니다. 여기에 설명 된 기술은 식별 및 형광 트리거링과 기존의 유동 세포 계측기에 의한 다수의 개별 바이러스 나 전기 자동차에 여러 항원의 분석을 할 수 있습니다.
프로토콜 내의 중요한 단계는 MNPS에 대한 항체의 결합이다. 우리의 실험은 perfor했다메드 반응성기를 카르 복실 산으로 15 nm의 산화철 나노 입자를 사용하는 것은 전술 한 바와 같이 9. 제조사에 따라, 각 15 nm의 MNP 20 항체에의 최대 결합 수있다; 우리는 약 15 nm의 MNP 당 10 항체를 결합한다. 이 추정은 이전 및 이후에 결합 된 항체의 양 및 나노 입자 특성 및 크기 조정 수단에 의해 측정 된 비드 / ㎖의 수에 기초한다. 원칙적으로, 커플 링은 입자의 응집을 일으켜 바람직하지 못하다있다. 그 집계가 우리의 프로토콜 발생하지 않습니다 확인하기 위해, 우리는 나노 입자의 특성 및 크기 조정 계기로이 문제를 확인했습니다. 이 악기는 코팅 및 항체 층이 아닌 만 15 나노 코어를 포함하는 입자의 유체 역학적 직경을 측정한다. 우리는 결합 구슬의 대부분이 단일 피크에있는 것을 (73 ± 7.3 nm의 아래에있는 모든 이벤트의 90 %와 64.7 ± 4.2 nm에서 피크를 의미) 발견했다. AB-MNP 공동의 혼합오른쪽 비례 비리 또는 전기 자동차와 mplexes는 MNPS가 전기 자동차 / 비리보다 몇 배의 농도에 매우 중요하다. 이것은 하나의 전기 자동차가 / 비리 분석되어 있는지 확인하는 것이 중요합니다. 저 유량에서 사이토 실행하여 이벤트의 우연을 피하십시오. 형광의 포착을 트리거하고 캡처 엔티티의 농도를 측정 체적 컨트롤을 사용하여 확인.
그러나 MNPS는 가교하거나 같은 나노 입자에 두 개 이상의 비리의 결합에 의해 전기 자동차 나 비리를 집계 할 수 있습니다. 이를 확인하기 위해,도 4에 기재된 바와 같이 응집에 대한 테스트가 수행되어야한다. 비록 개별적으로 포착 비리 나 전기차 동시에 흐름 cytometer의 레이저 광을 입력 할 수있다. 이 두 개의 서로 다른 항원에 대한 거짓 양성을 만들 것입니다. 이를 방지하기 한 바와 같이 플로우 사이토 설정되어야하며, 제제는 희석한다. 하나는이를 사용하여 일치 일어나고 있는지 확인할 수이전 지점에 설명 된대로 전략. 또한, 일치의 부족 제제의 희석액을 분석 및 형광 염색 항원의 평균 형광 강도 모든 희석액 (도 5)에서 일정하게 유지하면서 이벤트 수가 희석 선형 적으로 감소하는 것이 증명에 의해 확인 될 수있다. 또 다른 문제는 너무 적은 바이러스 / 전기차가 포착 될 수 있다는 것이다. 이는 바이러스 /가 특정 MNPS에 의해 포착되는 항원을 수행하는 전기 자동차의 진정한 부족을 할 수 있습니다. 대안 적으로, 포획 효율은 다양한 원인 낮다 (예를 들어, MNPS,이 프로토콜을 위해 개발 된 비리 온 / 전기차에 MNPS의 비율로부터의 편차 등의 비효율적 항체 결합). 후자의 가능성을 방지하기 위해 캡처의 효율이 구체적으로 평가되어야한다. 전형적으로, 효율은도 6에서와 같이 약 90 %이어야한다.
다른 항체에 의한 방해 할 수 있습니다서로 또는 MNPS에 결합 된 항체와 입체 장해. 이 무료 부동 애비에서 이후의 분리와 AB-MNP 복합체에 의해 최초의 형광 검출 복근으로 염색해야 제 7 간단히, 비리 또는 전기 자동차에 설명하고 포착 역 캡처 프로토콜 (테스트해야합니다 발생하지 않았 음을 확인하려면 자기 열입니다.
흐름 virometry는 비리 또는 전기 자동차의 항원 성분의 분석 기존의 방법에 대하여 상당한 이점이있다. 일상적인 생화학 적 방법은 준비에서 특정 단백질의 일반적인 존재에 대해보고 있지만, 비리 또는 전기 자동차의 이질성에 관한 정보를 제공합니다. 이 대형 시중에서 판매하는 입자에 비리 또는 전기 자동차의 immunocapture을 포함한다. 이러한 입자는 직경이 수 미크론의 통상적으로 그들 각각은 비리 나 전기차의 수백 또는 수천을 포착 할 수있다. 따라서, 이후 분석 평균화 비리 / 전기 자동차의 특성하나의 입자에 의해 캡처. 대조적으로, 플로우 virometry 이벤트 중 적어도 90 %가 단일 비리 또는 단일 EV를 나타내는 직경과 설명 프로토콜 10-15 nm 인 MNPS를 사용한다.
주요 제한은 준비 비리 또는 전기 자동차의 전체 인구가 분석되지 않을 수 있다는 것입니다,하지만 그 포착되는. 따라서, 비리 나 전기차가 캡처되는 항원의 선택이 중요해진다. 또한, 다른 항원의 개수 (상이한 항원에 대한 형광 항체 수) 계측법 달리 흐름 비리 나 전기차의 작은면에 의해 제한된다. 마지막으로, 다른 항체를 입체적으로 인해 작은 (세포에 비하여) 표면에 다시 서로 간섭 할 수있다.
현재의 프로토콜들이 포착 될 수있는 특정 항체를 사용할 수 있는지, 어떠한 바이러스 나 원산지 EV 분석하도록 구성 될 수있다. 개인 비리 허가에 항원 분석의 연구자들은 바이러스 집단의 다른 분수의 발병을 해결합니다. 또한, 플라즈마에서 개별 전기 자동차의 식별이 가능한 특정 세포에 전기 자동차의 출처를 추적하고 정상 또는 병적이 세포의 조건들이 상주하는 기관에 대해보고 할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |