Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Celler i flercellede organismer har mange individuelle funksjoner som enten kan være unik for en bestemt celle eller i det minste hører til spesielle grupper av celler. Selv dyrkede klonede celler viser individuelle egenskaper som gjenspeiles av deres mangfoldig morfologi. Dessuten er en celle individualitet reflekteres i produktene utskiller. I tilfelle av viral infeksjon, kan viruspartikler bære proteinene fra cellene som produserte dem. For eksempel, for HIV mange vertscelleproteiner er innebygd i viral konvolutt og virus som er generert av forskjellige celler kan bære disse karakteristiske proteiner 1, 2 eller "celle signaturer".
Selv uten infeksjon, celler slipper inn i de omkringliggende medie små ekstracellulære vesikler (EVS). Biogenesis av disse vesikler og deres struktur i mange tilfeller ligne virus, spesielt retrovirus. I de senere årene har det blitt klartdet EV, som opprinnelig ble ansett å være "blodplate-støv" 3, utgjør en viktig fysiologisk system for celle-celle-kommunikasjon. Sammen med to andre systemer for interkommunikasjon, nemlig celle-celle kontakt interaksjoner og utgitt løselige molekyler, elbiler koordinere normal fysiologi og endres i ulike patologier 4, 5 inkludert virusinfeksjoner 6, 7.
Selv om begge utgitt viruspartikler og ekstracellulære vesikler er svært mangfoldig, de er preget hovedsakelig av bulk analyse der deres individuelle egenskaper går tapt. En fremgangsmåte beslektet med flowcytometri, som fenotyper celler basert på deres forskjellige overflateantigener, er nødvendig for å karakterisere individuelle virus og viruslignende partikler. Dessverre kan elbiler eller små viruspartikler ikke bli analysert ved hjelp av standard flyt CYTOMetry metoder fordi de er for små til å generere den lysspredningssignalet som de fleste fotometere avhengige for å utløse. For å omgå denne begrensningen, kan fluorescens utløser brukes. Imidlertid, hvis el-biler eller virioner er farget med fluoriserende antistoffer er det vanskelig å skille dem fra frie antistoffer og deres aggregater på grunn av deres tilsvarende fluorescens og sammenlignbare størrelser.
Nylig har vi utviklet en nanoteknologi-baserte high throughput metode som gjør det mulig for karakterisering av antigener på enkelte små partikler som bruker vanlig flowcytometere 8, 9. Vi benytter MNPS til immunocapture partikler av interesse, som har blitt beskrevet av andre grupper for forskjellige programmer 10, 11, 12, 13; Men gjør vårt ny teknikk for fangst av enkelte spFIC mål fulgt av fenotyping av disse fanget partiklene ved strømningscytometri ved å bruke fluorescens utløser heller enn lysspredning, uten innblanding fra frittflytende antistoffer. Denne fremgangsmåte har brede anvendelser og kan brukes til å karakterisere antigene sammensetning ifølge ethvert Virus-og ikke-viral liten partikkel generert av celler in vivo og in vitro gitt tilgjengeligheten av spesifikke fluoriserende antistoffer mot overflateantigener. Vi har allerede brukt denne teknikken til å studere flere biologiske problemer.
Spesielt vi evaluert fordelingen av vertscellemarkører på enkelt HIV-1 partikler 9, studerte vi modningen av individuelle Dengue virus (DENV) basert på analyse av deres overflateproteiner 14 og undersøkt elbiler slippes ut i blodet hos friske frivillige og pasienter med akutt koronarsyndrom (ACS). Selv basert på et lignende prinsipp,anvendelse av den nye teknikk som kreves utvikling av spesifikke protokoller som er beskrevet nedenfor.
Konvensjonelle flowcytometere forbli den viktigste verktøy for å analysere celler basert på deres fysiske og kjemiske egenskaper på individuelt nivå 18. De grunnleggende prinsippene for flowcytometri ikke har blitt endret siden sin utvikling: en celle som passerer gjennom laserstrålen og sprer lys utgjør en hendelse som utløser opptak av fluorescerende spektra slippes ut av cellebundet fluorescerende antistoffer. Mindre partikler under 300 nm kan ikke oppdages ved side scatter av en cytometer som de sprer mer lys under større vinkler som mest Flowcytometer samler ikke lys 18. Teknikken som er beskrevet her, muliggjør identifisering og analyse av multiple antigener på en rekke individuelle virus eller el-biler ved konvensjonelle væskestrømsfotometere med fluorescens utløser.
De kritiske trinnene i protokollen er koblingen av antistoffer mot MNPS. Våre eksperimenter ble PERFORMed hjelp av 15 nm jernoksid nanopartikler med karboksylsyre som en reaktiv gruppe som beskrevet tidligere 9. Ifølge produsenten, kan hver 15 nm MNP binde maksimalt 20 antistoffer; vi binder cirka 10 antistoffer per 15 nm MNP. Dette anslaget er basert på mengden av antistoffer før og etter kobling og antallet kuler / ml som målt ved nanopartikkel karakterisering og dimensjonering instrumentering. I prinsippet kan kopling forårsake aggregering av partikler og er uønsket. For å sjekke at aggregering ikke skjer med vår protokoll, vi bekreftet dette med nanopartikkel karakterisering og dimensjonering instrumentering. Dette instrument måler den hydrodynamiske diameter til partiklene, som inneholder belegget og antistoff sjikt i stedet for 15 nm kjerne bare. Vi fant at flertallet av kombinert perler er plassert på en enkel topp (gjennomsnittlig topp på 64,7 ± 4,2 nm med 90% av alle hendelser under 73 ± 7,3 nm). Blandingen av Ab-MNP complexes med viruspartikler eller elbiler i riktig forhold er viktig slik at MNPS er i konsentrasjonen av flere bestillinger høyere enn EVS / viruspartikler. Dette er avgjørende for å sikre at enkelt elbiler / virions analyseres. Unngå tilfeldigheter av hendelsene ved å kjøre cytometer ved lav vannføring. Sørg for å utløse kjøpet på fluorescens og bruke volumetriske kontroller for å måle konsentrasjonen av de fangede enheter.
Imidlertid kan MNPS aggregere el-biler eller virioner ved tverrbinding, eller ved binding av to eller flere virioner til den samme nanopartikkel. For å sjekke dette, har en test for aggregering som beskrevet i figur 4 som skal utføres. Selv individuelt tatt viruspartikler eller elbiler samtidig kan gå inn i laserstrålen av strømningscytometeret. Dette ville skape falsk-positivitet for to forskjellige antigener. For å unngå dette, bør strømningscytometeret settes som beskrevet og forberedelsene bør fortynnes. Man kan kontrollere om tilfeldighet som skjer ved hjelp av den sammestrategi som er beskrevet i det foregående punkt. Dessuten kan den manglende samsvar verifiseres ved analyse av seriefortynninger av preparatet, og beviser at det antall hendelser avtar lineært med fortynningen mens den midlere fluorescensintensitet av et fluorescensmerket farget antigen forblir konstant i alle fortynninger (figur 5). En annen sak er at for få virus / elbiler kan fanges. Dette kan være på grunn av den sanne knapphet på virus / elbiler som bærer antigener der de blir tatt til fange av spesifikke MNPS. Alternativt, er effektiviteten av fangst lav på grunn av ulike årsaker (f.eks ineffektiv kobling av antistoffer mot MNPS, avvik fra prosenter av MNPS til Virioner / elbiler utviklet for denne protokollen, etc.). For å unngå den sistnevnte mulighet, bør effektiviteten av fangst være spesielt evaluert. Typisk bør effektivitet være omtrent 90% som i figur 6.
Ulike antistoffer kan forstyrre grunnsterisk hindring med hverandre eller med antistoffer koblet til MNPS. For å sjekke at dette ikke skjedde en omvendt-fangst protokollen må testes (som beskrevet i § 7. Kort oppsummering, viruspartikler eller elbiler bør først farget med fluorescerende deteksjon Abs og deretter tatt til fange av Ab-MNP komplekser med påfølgende separasjon fra frittflytende Abs på magnetiske kolonner.
Flow virometry har betydelige fordeler med hensyn til eksisterende metoder for analyse av antigene sammensetningen av viruspartikler eller elbiler. Rutine biokjemiske metoder rapportere om den generelle tilstedeværelsen av bestemte proteiner i forberedelsene, men gir ingen informasjon om heterogenitet av viruspartikler eller elbiler. Dette inkluderer immunocapture av viruspartikler eller elbiler på store kommersielt tilgjengelige partikler. Slike partikler er vanligvis av flere mikron i diameter, og hver av dem kan ta hundrevis eller tusenvis av viruspartikler eller EV. Derfor eventuelle senere analyse gjennomsnitt egenskapene til viruspartikler / elbilerfanget av en partikkel. I motsetning til dette, benytter strømnings virometry MNPS på 10-15 nm i diameter og med den beskrevne protokoll i det minste 90% av hendelser som representerer en enkelt virion eller enkelt EV.
Den største begrensningen er at hele befolkningen i viruspartikler eller elbiler i utarbeidelsen kanskje ikke analysert, men bare de som er fanget. Dermed blir valget av antigenet gjennom hvilke virioner eller EV fanges kritisk. Dessuten er i motsetning flowcytometri antall forskjellige antigener (antallet fluorescerende antistoffer mot forskjellige antigener) er begrenset av den lille overflate av virioner eller el-biler. Endelig kan forskjellige antistoffer sterisk forstyrre hverandre igjen på grunn av de små (sammenlignet med cellene) overflate.
Den nåværende protokollen kan tilpasses for analyse av virus eller EV av hvilken som helst opprinnelse, forutsatt at de spesifikke antistoffer som de kan fanges er tilgjengelige. Analyse av antigener på enkelte viruspartikler tillatelses forskere til å ta patogenesen av ulike fraksjoner av virus populasjoner. Videre kan identifisering av enkelt elbiler i plasma gjør det mulig å spore opprinnelsen til elbiler til bestemte celler og rapportere om normale eller patologiske tilstander av disse cellene og organene der de bor.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |