Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler

doi: 10.3791/55020 Published: January 25, 2017

Introduction

Celler i flercellede organismer har mange individuelle funksjoner som enten kan være unik for en bestemt celle eller i det minste hører til spesielle grupper av celler. Selv dyrkede klonede celler viser individuelle egenskaper som gjenspeiles av deres mangfoldig morfologi. Dessuten er en celle individualitet reflekteres i produktene utskiller. I tilfelle av viral infeksjon, kan viruspartikler bære proteinene fra cellene som produserte dem. For eksempel, for HIV mange vertscelleproteiner er innebygd i viral konvolutt og virus som er generert av forskjellige celler kan bære disse karakteristiske proteiner 1, 2 eller "celle signaturer".

Selv uten infeksjon, celler slipper inn i de omkringliggende medie små ekstracellulære vesikler (EVS). Biogenesis av disse vesikler og deres struktur i mange tilfeller ligne virus, spesielt retrovirus. I de senere årene har det blitt klartdet EV, som opprinnelig ble ansett å være "blodplate-støv" 3, utgjør en viktig fysiologisk system for celle-celle-kommunikasjon. Sammen med to andre systemer for interkommunikasjon, nemlig celle-celle kontakt interaksjoner og utgitt løselige molekyler, elbiler koordinere normal fysiologi og endres i ulike patologier 4, 5 inkludert virusinfeksjoner 6, 7.

Selv om begge utgitt viruspartikler og ekstracellulære vesikler er svært mangfoldig, de er preget hovedsakelig av bulk analyse der deres individuelle egenskaper går tapt. En fremgangsmåte beslektet med flowcytometri, som fenotyper celler basert på deres forskjellige overflateantigener, er nødvendig for å karakterisere individuelle virus og viruslignende partikler. Dessverre kan elbiler eller små viruspartikler ikke bli analysert ved hjelp av standard flyt CYTOMetry metoder fordi de er for små til å generere den lysspredningssignalet som de fleste fotometere avhengige for å utløse. For å omgå denne begrensningen, kan fluorescens utløser brukes. Imidlertid, hvis el-biler eller virioner er farget med fluoriserende antistoffer er det vanskelig å skille dem fra frie antistoffer og deres aggregater på grunn av deres tilsvarende fluorescens og sammenlignbare størrelser.

Nylig har vi utviklet en nanoteknologi-baserte high throughput metode som gjør det mulig for karakterisering av antigener på enkelte små partikler som bruker vanlig flowcytometere 8, 9. Vi benytter MNPS til immunocapture partikler av interesse, som har blitt beskrevet av andre grupper for forskjellige programmer 10, 11, 12, 13; Men gjør vårt ny teknikk for fangst av enkelte spFIC mål fulgt av fenotyping av disse fanget partiklene ved strømningscytometri ved å bruke fluorescens utløser heller enn lysspredning, uten innblanding fra frittflytende antistoffer. Denne fremgangsmåte har brede anvendelser og kan brukes til å karakterisere antigene sammensetning ifølge ethvert Virus-og ikke-viral liten partikkel generert av celler in vivo og in vitro gitt tilgjengeligheten av spesifikke fluoriserende antistoffer mot overflateantigener. Vi har allerede brukt denne teknikken til å studere flere biologiske problemer.

Spesielt vi evaluert fordelingen av vertscellemarkører på enkelt HIV-1 partikler 9, studerte vi modningen av individuelle Dengue virus (DENV) basert på analyse av deres overflateproteiner 14 og undersøkt elbiler slippes ut i blodet hos friske frivillige og pasienter med akutt koronarsyndrom (ACS). Selv basert på et lignende prinsipp,anvendelse av den nye teknikk som kreves utvikling av spesifikke protokoller som er beskrevet nedenfor.

Protocol

1. Kobling av Magnetic Nanopartikler (MNPS)

  1. Bruk kommersiell koblingsprosedyren og reagenser til par MNPS med antistoffer (Abs) (vanligvis 1 mg). Jernoksid nanopartikler med karboksylsyre som reaktive grupper anvendes.
    1. Hvis antistoffer er i et volum høyere enn 0,5 ml konsentrat ved hjelp av en 100K konsentrator. Spin ved 2000 xg i 3-5 min.
  2. På slutten av prosedyren, etter tilsetning av 10 ul av slukke buffer, overføre MNPS til et 12 mm x 75 mm rør og tilsett 3 ml vaske / lagringsbuffer. Plasser slangen i hullet i midten av en magnetisk separator og la over natten ved 4 ° C.
  3. Kontroller at MNPS ha alle samlet til siden av røret, og deretter forsiktig pipettér ut all væske. Tilsett 3 ml frisk vaske / lagringsbuffer, og plassere tilbake i magneten.
  4. Etter flere timer, sjekk om MNPS er samlet til siden av røret og deretter pipettér av væsken. Bruk 2 ml vask / oppbevaring buffer tilsuspendere MNPS og oppbevar ved 4 ° C.
  5. Kontroller at Abs er koplet til MNPS ved å merke dem med en relevant fluorescerende Fab antistoff fragment (f.eks geit anti-mus hvis du bruker en mus monoklonalt Ab for fangst som beskrevet i kapittel 2) og kjøre på et flowcytometer.

2. Merking antistoffer koblet til MNPS

  1. Kombiner 60 ul (3,9 x 10 12 partikler) av MNPS (pr tilstand) og 5 ul (fra en 200 ug / ml kommersiell løsning) merket Fab-fragmenter, spesifikke for isotypen av fangst Ab i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
  2. Inkuber ved romtemperatur (RT) i 30 minutter med kontinuerlig blanding.
  3. Pre-våte en 100K konsentrator med 300 ul av fosfatbufret saltvann (PBS) og sentrifugering i en mikrosentrifuge ved 1500 xg i 5 min.
  4. Rens merkete komplekser på 100K kolonne. Spinne blandingen fra trinn 2,2 i en mikrosentrifuge ved 1500 xg i 5 minutter, vask med 200 ul PBS, og komme iopprinnelige volum.

3. Bruk av merket Ab-MNP Komplekser for å fange partikler av interesse (virus eller elbiler)

  1. Inkuber forhåndsmerkede MNPS 60 ul (3,9 x 10 12 partikler) med HIV (60 ul) eller EV preparat (100 ul).
    1. Forbered EV forberedelser ved hjelp av ulike metoder. Her rense elbiler på sukrosegradienter, samle dem fra blodplatefattig plasma bruker exosome nedbørs reagenser eller isolere direkte fra plasma 8.
      MERK: Optimale forhold må bestemmes for hvert forsøk og er avhengig av konsentrasjonen av virus / EV i utarbeidelsen. MNP-Ab fraksjon bør være ~ 10 6 i overskudd i forhold til konsentrasjonen av virus / EV fraksjon.
  2. Inkuber 40 min ved 37 ° C med forsiktig blanding etter virus, eller en time ved 4 ° C i el-biler.
  3. Legg 2,5% muse-IgG / human IgG for å blokkere Fc-binding, forsiktig vortex, inkuber 3-5 min ved RT.
  4. Legg produsenten anbefalte eller titered konsentrasjoner av hver deteksjon Abs og inkuberes ytterligere 20 min ved RT.

4. Separasjon av MNP-fangede Virioner (eller elbiler) fra Ubundet Antistoffer Bruke Magnetiske kolonner

  1. Forbered magnetisk separasjon kolonne for bruk ved å plassere den i en separator magnet.
  2. Pre-våt-kolonnen med 500 ul vaskebuffer (2 mM Etylendiamintetraeddiksyre (EDTA), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS). Tillat vaskebufferen til å strømme gjennom kolonnen.
  3. Tilsett MNP-virus / MNP-EV-komplekser til kolonnen og la all væske kan strømme gjennom. Legg 500 ul vaskebuffer til kolonnen, slik at hele volumet kan passere gjennom.
  4. Gjenta vask med vaskebuffer 2 flere ganger.
  5. Fjern kolonnen fra magneten og plass i 12 mm x 75 mm rør for oppsamling av tilbakeholdt MNP-virus / MNP-EV komplekser. La kolonnen stå i røret av magnet i 3 min. Tilsett 200 ul PBS og laperlene strømme ned av tyngdekraften, tilsett ytterligere 200 mL PBS, og fikse med 200 mL 4% paraformaldehyde etter eluering.
    MERK: Paraformaldehyde er en mistenkt kreftfremkallende og bør håndteres i et ventilert hette og hansker bør brukes.
  6. For å kvantifisere enkeltviruspartikler / elbiler bruke volumetriske innstillingene på høy gjennomstrømning Sampler (HTS) eller rett før oppkjøpet legge godt blandet flowcytometri teller perler.

5. Analyse av MNPS-fangede virus / elbiler med en Flowcytometer

  1. Varm opp flowcytometer i 30 min.
  2. Kjør kvalitetskontroll perler.
  3. Sett terskelen på fluorescens av enten MNPS eller merket virus / elbiler. Bruk 0,22 um filtrert PBS for terskel for å redusere bakgrunns "støy". Sett terskelen ved å justere PMT spenning på det nivået der filtrert PBS gir ingen, eller svært få, hendelser.
  4. Kjør prøver på lav. (Bruke et ytterligere 0,04 um innebygd filter for skjermfluid plassert i serie bakstandard 0,2 mikrometer slire filter for ytterligere å eliminere falske hendelser).

6. Evaluering av Capture Efficiency

  1. Capture fluorescensmerkede elbiler eller HIV med MNP-Abs som beskrevet i 3.1, 3.2. (Elbiler kan merkes enten med en membran fargestoff eller gjennom sin last 15; Hiv kan merkes enten ved gen-kodede fargestoff 16, eller med en membran fargestoff 12, 17).
  2. Fremstille magnetisk separasjonskolonne som beskrevet i (4,1-4,2).
  3. Tilsett MNP-virus / MNP-EV-komplekser til kolonnen og la all væske til å strømme gjennom (flyte gjennom fraksjon). Samle strømmen gjennom fraksjonen i røret.
  4. Fortsett med fraksjon bibeholdt på kolonnen som beskrevet i (4,4-4,5).
  5. Gjenta innfangingsprosedyren på strømningen gjennom fraksjonen fra 6,3 med etterfølgende separasjon (04/01 til 04/05).
  6. Analyser tilbakeholdt fraksjoner fra første capture og andre fangst ved å kjøre dem på cytometer som er satt på utløser på fluorescerende etiketten av elbiler eller HIV. For å evaluere effektivitet, sammenligne antall hendelser i begge fraksjoner.

7. Tilpasning av protokollen for spesifikke oppgaver

MERK: Mens protokollen kan anvendes for analyse av HIV og el-biler som beskrevet ovenfor, for analyse av DENV følgende modifikasjoner bør innføres:

  1. Inkuber virioner med 1 uM DII i mørke i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubering rense flekker virus ved sentrifugering i tetthets-gradient-medium (10%, 20%, 25% og 35%) ved 240 000 xg i 1,5 timer ved 4 ° C uten brems. Samle brøkdel mellom 20% og 25% tettshetsgradient middels lag 14.
  2. Inkuber DII merket DENV 1 x 10 7 (60 ul) med fabrikantens anbefalte eller titrert konsentrasjoner av Ab påvisning i nærvær av 2,5% muse-IgG i 20 minutter ved RT.
  3. Incubspiste blanding med pre-merkede 60 ul (3,9 x 10 12 partikler) MNP-capture Ab komplekser i 40 minutter ved 37 ° C med forsiktig blanding.
  4. Separate resulterende komplekser fra ubundne Abs på magnetiske kolonner som beskrevet ovenfor, og analysere på flowcytometer.

Representative Results

Selektiv fangst av cellulære antigener av HIV-1 virioner

Med "flow virometry" er det nå mulig å visualisere cellulære antigener på individuelle viruspartikler. Som et eksempel, vi fokusert på to cellulære antigener båret av HIV-1, LFA-1 og HLA-DR. Tidligere disse to antigener ble identifisert i HIV-1 preparater analysert i bulk 1. Vi har fremstilt MNPS kombinert med en av de antistoffer mot env-proteinet av HIV, VRC01, og tatt med disse MNPS HIV-1-virioner (HIV-1 eller HIV-LAI.04 en SF162 produsert i perifere mononukleære blodceller (PBMC)). I tillegg farget vi disse viruspartikler med 2G12, en annen anti-konvolutt antistoff. Strømnings virometry viste en høy heterogenitet av HIV-1 viruspartikler med hensyn til tilstedeværelsen av LFA-1 og HLA-DR. I gjennomsnitt 16,7 ± 2,0% (n = 6) og 8,6 ± 0,3% (n = 3) av HIV-1 viruspartikler LAI.04 gjennomført LFA-1 og HLA-DR,henholdsvis. Bare 4,8 ± 0,6% (n = 3) av alle viruspartikler var positive for begge antigener. På den andre HIV-1-stamme, HIV-1 SF162, disse antigenene var til stede på 20,0 ± 4,4% (n = 6) og 10,8 ± 1,3% (n = 6) av virioner, henholdsvis, mens begge antigener ble utført ved 6,5 ± 0,4% (figur 1).

Fordelingen av de cellulære proteiner var avhengig av de cellene som replikert virus. HIV-infiserte Jurkat-celler som produseres virioner antigent forskjellige fra de som produseres av infiserte PBMC. Virioner av HIV-1-LAI 0,4 produseres av Jurkat-celler gjennomføres 1,6 ± 1,4% (n = 3) og 1,6 ± 0,7% (n = 4) henholdsvis LFA-1 og HLA-DR. For HIV-1 SF162 virioner fremstilt i Jurkat-celler, disse parametrene var 7,2 ± 2,5% (n = 3) og 5,6 ± 2,7% av (n = 4). Dermed antigen sminke (minst for HLA-DR og LFA-1) var annerledes for HIV-1 LAI.04 produsert av to forskjellige celletyper (p <0,02).

Flow virometry som brukes til evaluering av Dengue virus

DENV modning er assosiert med ekspresjon av PRM protein på virioner. Vi søkte flyt virometry å vurdere hva brøkdel av DENV produsert i BHK-en og i LoVo celler utgjør modne virus. Virioner ble farget med en lipidic fargestoff DII. Analyse av de enkelte fangede virioner avslørte PRM på 48,2 ± 5,3% (n = 8) av DENVs. I motsetning til dette, 84,5 ± 3,4% (n = 4) av DENV produsert i LoVo-celler utført PRM. Resten av virioner, henholdsvis 51,8 ± 5,3% (n = 8) og 15,5 ± 3,4% (n = 4) ble PRM negativ (figur 2). Således kan strømnings virometry brukes for å skille fullstendig modne individuell DENV fra umoden (eller delvis modne) DENV virioner.

Ekstracellulære vesikler utgitt i blodet av sunnfrivillige og pasienter med akutt koronarsyndrom (ACS)

For å undersøke ulike EV undergrupper av pasienter med ACS og friske kontroller, fanget vi elbiler fra blodplatefattig plasma (PPP) med fluorescerende MNPS-kombinert med antistoffer mot CD31, CD41a eller CD63. Elbiler fanget av CD31-MNPS ble farget for CD41a og CD63, elbiler fanget av CD41a-MNPS ble farget for CD31 og CD63, og elbiler fanget av CD63-MNPS ble farget for CD31 og CD41a (figur 3).

Mengden av elbiler fanget av CD31-MNPS og positivt for en eller to av deteksjons antistoffer i ACS pasienter var 3359 [2328; 5,472] elbiler / mikroliter i sammenligning med 1272 [714; 2,157] elbiler / ul hos friske frivillige (p = 0,001). Den totale mengden av elbiler fanget av CD63 i ACS pasienter sammenlignet med friske frivillige var 3541 [1318; 5,173] elbiler / mikroliter vs. 806 [488; 2.112] elbiler / ul (p = 0,007). Det var 4752 [3238; 7,173] elbiler / mikroliter i plasma fra pasienter med ACS fanget av CD41a-MNPS, mens i plasma fra friske frivillige var dette tallet betydelig lavere, 2623 [1927; 4,188] elbiler / mikroliter (p = 0,015). Generelt våre resultater viser at, mens EV beløp ble stort sett økt i ACS pasienter, omfanget av økningen var forskjellig i forskjellige sub-populasjoner av elbiler.

Figur 1
Figur 1: Selektiv inkorporering av cellulære antigener i HIV-1 virioner replikerende i forskjellige celletyper. HIV (HIV-1 LAI.04 eller HIV-1 SF162) virioner utgitt av PBMC eller Jurkat-celler ble tatt med VRC01-MNPS og farget med andre anti-gp120 antistoff 2G12 og med spesifikke antistoffer mot HLA-DR og LFA-1. De fargede forberedelser ble utsatt for flyt analyse for HLA-DR (hvite søyler) og LFA-en (svart bars). Betyr ± SEM av tre til seks eksperimenter 9. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2: Modning tilstand av DENV viruspartikler. DENV fremstilt i BHK-21-celler (A, B) eller i LoVo-celler (C, D) ble merket med den lipide fargestoff DII, og etter ultrasentrifugering i tetthetsgradient medium, farget for PRM protein med 2H2 antistoffer (A, C) eller med IgG2a-isotypekontroll (B, D). De merkede virioner ble deretter tatt med 3H5-1-MNPS og utsatt for strømningsanalyse 14. Klikk her for å se en større versjon av dennefigur.

Figur 3
Figur 3: Analyse av elbiler fra ACS pasienter og friske kontroller. Plasma elbiler ble tatt med CD31-MNPS, CD63-MNPS eller CD41a-MNPS og farget med antistoffer mot CD41a og CD63, mot CD31 og CD41a og mot henholdsvis CD31 og CD63,. Captured elbiler, farget med minst ett av deteksjons Abs, ble visualisert og nummerert i strømningsanalyse. Data presentert som prikkplott med median og interkvartilt område (IQR). Grønne symboler: friske frivillige (kontroller), brune symboler: ACS pasienter. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4: evaluering,på av fraksjonen av strømnings hendelser som representerer individuelle viruspartikler. (A) HIV-1. Suspensjon av viruspartikler ble delt inn i to deler og farget enten med DID (venstre panel) eller Dio (midtre panelet). Etter blanding, suspensjon, som inneholdt to forskjellig farget viruspartikler, ble tatt med VRC01-MNPS og utsatt for strømme virometry (høyre panel). Aggregater (dual-fargede hendelser) utgjorde mindre enn 10% av totale hendelser. (B - D) DENV. Suspensjon av DII-farget viruspartikler ble seriefortynnet to ganger fra 1: 2 til 1: 256 og kjøpte med HTS på et flowcytometer (B). DII-DENVs ble merket med 2H2 antistoffer (C) eller Dil-DENVs ble tatt med 3H5-1-MNPS (D). Preparater C og D ble deretter seriefortynnet to ganger fra 1: 2 til 1: 256 og ervervet med HTS 14. Virioner ser ikke ut til å aggregere da det i alle tilfeller derer en lineær korrelasjon mellom fortynningsfaktoren og antallet av hendelsene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 5
Figur 5: Påvisning av enkeltpartikler av Strømningscytometer. DII-farget DENV suspensjon ble seriefortynnet to ganger fra 1: 2 til 1: 2048 og skaffes ved hjelp av en HTS på et strømningscytometer. (A) Antall virus oppdaget som en funksjon av fortynningsfaktoren. (B) Median fluorescens intensitet (MFI) av DII merket DENV 14. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

"Figur Figur 6: Evaluering av brøkdel av viruspartikler og ekstracellulære vesikler tatt med MNPS koblet til spesifikke antistoffer. Merkede HIV-1 virioner eller elbiler ble tatt med MNPS koblet til spesifikke antistoffer og utsatt å flyte virometry. Etter separasjon på magnetiske søyler, ble gjennomstrømning (ikke beholdt) fraksjoner analysert for tilstedeværelse av viruspartikler eller elbiler av interesse som var savnet i første løp. (A) merket HIV-1 Bal virioner ble tatt med 2G12-MNPS (venstre panel). Gjennomstrømnings fraksjon ble gjenfanget og underkastet strømnings virometry (høyre panel). I den første syklusen ca 95% av virioner av interesse ble tatt til fange. (B) merket elbiler ble tatt med anti-CD81 MNPS og isolert på magnetiske kolonner (venstre panel). Gjennomstrømningsfraksjonen ble på nytt tatt og analysert (høyre panel). I det førstesyklus omtrent 99% av vesiklene av interesse ble tatt åtte. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Konvensjonelle flowcytometere forbli den viktigste verktøy for å analysere celler basert på deres fysiske og kjemiske egenskaper på individuelt nivå 18. De grunnleggende prinsippene for flowcytometri ikke har blitt endret siden sin utvikling: en celle som passerer gjennom laserstrålen og sprer lys utgjør en hendelse som utløser opptak av fluorescerende spektra slippes ut av cellebundet fluorescerende antistoffer. Mindre partikler under 300 nm kan ikke oppdages ved side scatter av en cytometer som de sprer mer lys under større vinkler som mest Flowcytometer samler ikke lys 18. Teknikken som er beskrevet her, muliggjør identifisering og analyse av multiple antigener på en rekke individuelle virus eller el-biler ved konvensjonelle væskestrømsfotometere med fluorescens utløser.

De kritiske trinnene i protokollen er koblingen av antistoffer mot MNPS. Våre eksperimenter ble PERFORMed hjelp av 15 nm jernoksid nanopartikler med karboksylsyre som en reaktiv gruppe som beskrevet tidligere 9. Ifølge produsenten, kan hver 15 nm MNP binde maksimalt 20 antistoffer; vi binder cirka 10 antistoffer per 15 nm MNP. Dette anslaget er basert på mengden av antistoffer før og etter kobling og antallet kuler / ml som målt ved nanopartikkel karakterisering og dimensjonering instrumentering. I prinsippet kan kopling forårsake aggregering av partikler og er uønsket. For å sjekke at aggregering ikke skjer med vår protokoll, vi bekreftet dette med nanopartikkel karakterisering og dimensjonering instrumentering. Dette instrument måler den hydrodynamiske diameter til partiklene, som inneholder belegget og antistoff sjikt i stedet for 15 nm kjerne bare. Vi fant at flertallet av kombinert perler er plassert på en enkel topp (gjennomsnittlig topp på 64,7 ± 4,2 nm med 90% av alle hendelser under 73 ± 7,3 nm). Blandingen av Ab-MNP complexes med viruspartikler eller elbiler i riktig forhold er viktig slik at MNPS er i konsentrasjonen av flere bestillinger høyere enn EVS / viruspartikler. Dette er avgjørende for å sikre at enkelt elbiler / virions analyseres. Unngå tilfeldigheter av hendelsene ved å kjøre cytometer ved lav vannføring. Sørg for å utløse kjøpet på fluorescens og bruke volumetriske kontroller for å måle konsentrasjonen av de fangede enheter.

Imidlertid kan MNPS aggregere el-biler eller virioner ved tverrbinding, eller ved binding av to eller flere virioner til den samme nanopartikkel. For å sjekke dette, har en test for aggregering som beskrevet i figur 4 som skal utføres. Selv individuelt tatt viruspartikler eller elbiler samtidig kan gå inn i laserstrålen av strømningscytometeret. Dette ville skape falsk-positivitet for to forskjellige antigener. For å unngå dette, bør strømningscytometeret settes som beskrevet og forberedelsene bør fortynnes. Man kan kontrollere om tilfeldighet som skjer ved hjelp av den sammestrategi som er beskrevet i det foregående punkt. Dessuten kan den manglende samsvar verifiseres ved analyse av seriefortynninger av preparatet, og beviser at det antall hendelser avtar lineært med fortynningen mens den midlere fluorescensintensitet av et fluorescensmerket farget antigen forblir konstant i alle fortynninger (figur 5). En annen sak er at for få virus / elbiler kan fanges. Dette kan være på grunn av den sanne knapphet på virus / elbiler som bærer antigener der de blir tatt til fange av spesifikke MNPS. Alternativt, er effektiviteten av fangst lav på grunn av ulike årsaker (f.eks ineffektiv kobling av antistoffer mot MNPS, avvik fra prosenter av MNPS til Virioner / elbiler utviklet for denne protokollen, etc.). For å unngå den sistnevnte mulighet, bør effektiviteten av fangst være spesielt evaluert. Typisk bør effektivitet være omtrent 90% som i figur 6.

Ulike antistoffer kan forstyrre grunnsterisk hindring med hverandre eller med antistoffer koblet til MNPS. For å sjekke at dette ikke skjedde en omvendt-fangst protokollen må testes (som beskrevet i § 7. Kort oppsummering, viruspartikler eller elbiler bør først farget med fluorescerende deteksjon Abs og deretter tatt til fange av Ab-MNP komplekser med påfølgende separasjon fra frittflytende Abs på magnetiske kolonner.

Flow virometry har betydelige fordeler med hensyn til eksisterende metoder for analyse av antigene sammensetningen av viruspartikler eller elbiler. Rutine biokjemiske metoder rapportere om den generelle tilstedeværelsen av bestemte proteiner i forberedelsene, men gir ingen informasjon om heterogenitet av viruspartikler eller elbiler. Dette inkluderer immunocapture av viruspartikler eller elbiler på store kommersielt tilgjengelige partikler. Slike partikler er vanligvis av flere mikron i diameter, og hver av dem kan ta hundrevis eller tusenvis av viruspartikler eller EV. Derfor eventuelle senere analyse gjennomsnitt egenskapene til viruspartikler / elbilerfanget av en partikkel. I motsetning til dette, benytter strømnings virometry MNPS på 10-15 nm i diameter og med den beskrevne protokoll i det minste 90% av hendelser som representerer en enkelt virion eller enkelt EV.

Den største begrensningen er at hele befolkningen i viruspartikler eller elbiler i utarbeidelsen kanskje ikke analysert, men bare de som er fanget. Dermed blir valget av antigenet gjennom hvilke virioner eller EV fanges kritisk. Dessuten er i motsetning flowcytometri antall forskjellige antigener (antallet fluorescerende antistoffer mot forskjellige antigener) er begrenset av den lille overflate av virioner eller el-biler. Endelig kan forskjellige antistoffer sterisk forstyrre hverandre igjen på grunn av de små (sammenlignet med cellene) overflate.

Den nåværende protokollen kan tilpasses for analyse av virus eller EV av hvilken som helst opprinnelse, forutsatt at de spesifikke antistoffer som de kan fanges er tilgjengelige. Analyse av antigener på enkelte viruspartikler tillatelses forskere til å ta patogenesen av ulike fraksjoner av virus populasjoner. Videre kan identifisering av enkelt elbiler i plasma gjør det mulig å spore opprinnelsen til elbiler til bestemte celler og rapportere om normale eller patologiske tilstander av disse cellene og organene der de bor.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5 M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123 count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19, (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65 (2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13, (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21, (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145, (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17, (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190, (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11, (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123, (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3, (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31, (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029 (2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159, (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79, (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).
Flow Virometry å analysere Antigen Spectra av Virioner og ekstracellulære vesikler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).More

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter