Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
Las células en los organismos multicelulares tienen muchas características individuales que pueden ser ya sea única para una célula particular o por lo menos pertenecen a grupos particulares de células. Incluso células clonadas cultivadas muestran características individuales como se evidencia por su morfología diversa. Además, la individualidad de una célula se refleja en los productos que se segrega. En el caso de la infección viral, partículas virales pueden llevar a las proteínas de las células que los producen. Por ejemplo, para el VIH muchas proteínas de la célula huésped se incrustan en la envoltura viral y virus que son generados por diferentes células pueden llevar estas proteínas características 1, 2 o "firmas de células".
Incluso sin la infección, las células liberan en el medio circundante pequeñas vesículas extracelulares (EVs). Biogénesis de estas vesículas y su estructura en muchos casos parece a la de los virus, especialmente retrovirus. En los últimos años se ha hecho evidenteque los vehículos eléctricos, los cuales fueron considerados inicialmente como "polvo de plaquetas" 3, constituyen un importante sistema fisiológico de la comunicación de célula a célula. Junto con otros dos sistemas de comunicación intercelular, es decir, las interacciones de contacto célula-célula y moléculas solubles liberados, los vehículos eléctricos coordinan la fisiología normal y se alteran en diversas patologías 4, 5 incluyendo infecciones virales 6, 7.
Aunque ambas partículas virales liberadas y vesículas extracelulares son muy diversos, que se caracterizan predominantemente por análisis de mayor en la que se pierden sus características individuales. Un método similar a la citometría de flujo, que fenotipos células en base a sus diferentes antígenos de superficie, es necesaria para caracterizar las partículas virales y similares a virus individuales. Desafortunadamente, los vehículos eléctricos o pequeños viriones no se pueden analizar utilizando cito flujo estándarmetría métodos porque son demasiado pequeños para generar la señal de dispersión de luz en la que la mayoría de los citómetros se basan para el disparo. Para evitar esta limitación, la fluorescencia de disparo se puede aplicar. Sin embargo, si los vehículos eléctricos o viriones se tiñen con anticuerpos fluorescentes es difícil para distinguirlos de los anticuerpos libres y sus agregados, debido a su fluorescencia similar y tamaños comparables.
Recientemente, hemos desarrollado un método de alto rendimiento basados en la nanotecnología que permite la caracterización de antígenos en pequeñas partículas individuales utilizando citómetros de flujo regular de 8, 9. Empleamos los micronutrientes en polvo a las partículas de inmunocaptura de interés, tal como ha sido descrito por otros grupos para diversas aplicaciones 10, 11, 12, 13; Sin embargo, nuestra nueva técnica permite la captura de especí individuoFIC objetivos seguidos por el fenotipo de estas partículas capturadas por citometría de flujo utilizando fluorescencia de disparo en lugar de dispersión de la luz, sin la interferencia de anticuerpos flotantes libres. Este método tiene amplias aplicaciones y se puede utilizar para caracterizar la composición antigénica de cualquier partícula pequeña viral- y no viral generada por las células in vivo e in vitro siempre que la disponibilidad de anticuerpos fluorescentes específicos contra los antígenos de superficie. Ya hemos aplicado esta técnica para estudiar varios problemas biológicos.
En particular, se evaluó la distribución de marcadores de células anfitrionas sobre el VIH-1 partículas individuales 9, se estudió la maduración del virus del dengue individuales (DENV) basados en el análisis de sus proteínas de superficie 14 y se investigaron los vehículos eléctricos liberadas en el torrente sanguíneo de voluntarios sanos y pacientes con síndrome coronario agudo (SCA). Aunque se basa en un principio similar, laaplicación de la nueva técnica requiere el desarrollo de protocolos específicos que se describen a continuación.
Citómetros de flujo convencionales siguen siendo la principal herramienta para el análisis de las células en función de sus características físicas y químicas a nivel individual 18. Los principios básicos de la citometría de flujo no se han modificado desde su desarrollo: una célula que pasa a través del haz de láser y dispersa la luz constituye un evento que desencadena la grabación de los espectros de fluorescencia emitida por anticuerpos fluorescentes unidos a las células. Las partículas más pequeñas por debajo de 300 nm no pueden ser detectados por la dispersión lateral de un citómetro ya que dispersan más luz bajo ángulos mayores a la que más citómetro de flujo no recoger la luz 18. La técnica descrita aquí, permite la identificación y el análisis de múltiples antígenos en numerosas virus o vehículos eléctricos individuales por los citómetros de flujo convencionales con fluorescencia de disparo.
Los pasos críticos en el protocolo son el acoplamiento de anticuerpos a MNPs. Nuestros experimentos se PERFORmed utilizando 15 nanopartículas de óxido de hierro nm con ácido carboxílico como un grupo reactivo como se describe anteriormente 9. Según el fabricante, cada 15 nm MNP se puede unir un máximo de 20 anticuerpos; ligamos aproximadamente el 10 por anticuerpos 15 nm MNP. Esta estimación se basa en la cantidad de anticuerpos antes y después del acoplamiento y el número de cuentas / ml, según lo determinado por la caracterización de nanopartículas y la instrumentación de encolado. En principio, el acoplamiento puede causar la agregación de partículas y no es deseable. Para comprobar que la agregación no está sucediendo con nuestro protocolo, se verificó esto con la caracterización de nanopartículas y la instrumentación de tamaño. Este instrumento mide el diámetro hidrodinámico de las partículas, que incluye las capas de revestimiento y de anticuerpos en lugar de sólo el núcleo 15 nm. Se encontró que la mayoría de perlas acopladas se encuentran en un único pico (media de pico a 64,7 ± 4,2 nm con 90% de todos los eventos siguientes 73 ± 7,3 nm). La mezcla de Ab-MNP complexes con viriones o los vehículos eléctricos en la proporción adecuada es importante para que los micronutrientes en polvo se encuentran en la concentración de varios pedidos superiores a EVs / viriones. Esto es fundamental para garantizar que los vehículos eléctricos individuales / viriones se analizan. Evitar coincidencias de los eventos mediante la ejecución de citómetro de flujo a baja. Asegurar para activar la adquisición de fluorescencia y el uso de controles volumétricos para medir la concentración de las entidades capturadas.
Sin embargo, MNPs puede agregar vehículos eléctricos o viriones por reticulación o por la unión de dos o más viriones a la misma nanopartícula. Para comprobar esto, una prueba para la agregación tal como se describe en la Figura 4 tiene que ser realizada. viriones o EVs Incluso capturados individualmente pueden entrar al mismo tiempo el haz de láser del citómetro de flujo. Esto crearía falsa positividad para dos antígenos diferentes. Para evitar esto, el citómetro de flujo debe establecerse como se describe y las preparaciones se debe diluir. Uno puede comprobar si la coincidencia está ocurriendo mediante el uso de la mismaestrategia que se describe en el punto anterior. Además, la falta de coincidencia podría ser verificado mediante el análisis de diluciones en serie de la preparación y que demuestra que el número de eventos disminuye linealmente con la dilución, mientras que la intensidad de fluorescencia media de un antígeno de fluorescencia de colores se mantiene constante en todas las diluciones (Figura 5). Otro problema es que muy pocos virus / vehículos eléctricos pueden ser capturados. Esto puede ser debido a la verdadera escasez de virus / vehículos eléctricos que transportan antígenos a través del cual son capturados por específico MNPs. Alternativamente, la eficacia de la captura es baja, debido a diversas razones (por ejemplo, acoplamiento ineficiente de los anticuerpos frente a MNPs, la desviación de las relaciones de MNPs a viriones / EVs desarrollados para este protocolo, etc.). Para evitar esta última posibilidad, la eficiencia de captura debe ser evaluado específicamente. Por lo general, la eficiencia debe ser aproximadamente el 90% como en la figura 6.
Diferentes anticuerpos pueden interferir debido aimpedimento estérico entre sí o con los anticuerpos acoplados a MNPs. Para comprobar que esto no ocurrió un protocolo de captura inversa debe ser probado (como se describe en la Sección 7. Brevemente, los viriones o los vehículos eléctricos deben ser primero teñidas con Abs detección fluorescente y luego capturado por los complejos Ab-MNP con posterior separación del ABS libre flotantes en columnas magnéticas.
virometry Flow tiene ventajas significativas con respecto a los métodos existentes de análisis de la composición antigénica de los viriones o los vehículos eléctricos. métodos bioquímicos de rutina informan de la presencia general de proteínas particulares en las preparaciones, pero no proporcionan información sobre la heterogeneidad de los viriones o los vehículos eléctricos. Esto incluye inmunocaptura de viriones o vehículos eléctricos en las partículas grandes disponibles en el mercado. Tales partículas son típicamente de varias micras de diámetro y cada uno de ellos pueden capturar cientos o miles de viriones o los vehículos eléctricos. Por lo tanto, ninguna de las medias de análisis posteriores las propiedades de los viriones / EVcapturado por una partícula. Por el contrario, virometry flujo utiliza MNPs de 10 a 15 nm de diámetro y con el protocolo descrito al menos 90% de los eventos representan un único virión o solo EV.
La principal limitación es que toda la población de viriones o los vehículos eléctricos en la preparación no puede ser analizado, pero sólo aquellos que son capturados. Por lo tanto, la elección del antígeno a través del cual se capturan los viriones o los vehículos eléctricos se vuelve crítica. También, a diferencia de flujo de citometría el número de diferentes antígenos (el número de anticuerpos fluorescentes contra diferentes antígenos) está limitada por la pequeña superficie de los viriones o los vehículos eléctricos. Por último, los diferentes anticuerpos pueden interferir estéricamente entre sí de nuevo debido a la pequeña superficie (en comparación con las células).
El protocolo actual puede ser adaptado para el análisis de cualquier virus o EV de cualquier origen, siempre que los anticuerpos específicos a través de la que pueden ser capturados están disponibles. El análisis de los antígenos de permiso de viriones individuos investigadores abordar la patogénesis de diferentes fracciones de las poblaciones virales. Por otra parte, la identificación de los vehículos eléctricos individuales en el plasma puede hacer que sea posible rastrear el origen de los vehículos eléctricos a las células y de informarles sobre las condiciones normales o patológicas de estas células y los órganos en los que residen.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |