Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor

doi: 10.3791/55020 Published: January 25, 2017

Introduction

Celler i flercelliga organismer har många enskilda funktioner som kan vara antingen unika för en särskild cell eller åtminstone tillhör unika grupper av celler. Även odlade klonade celler visar individuella egenskaper som framgår av deras varierande morfologi. Dessutom är en cell individualitet återspeglas i de produkter som utsöndrar. I fallet med virusinfektion kan viruspartiklar bär proteiner från de celler som producerade dem. Till exempel, för HIV många värdcellproteiner är inbäddade i det virala höljet och virus som genereras av olika celler kan bära dessa karakteristiska proteiner en, två eller "cell signaturer".

Även utan infektion, celler släpper in de omgivande media små extracellulära blåsor (EVS). Biogenes av dessa blåsor och deras struktur i många fall likna virus, särskilt retrovirus. Under de senaste åren har det blivit tydligtatt elbilar, som från början ansågs vara "blodplätts damm" 3, utgör en viktig fysiologisk system för cell-cellkommunikation. Tillsammans med två andra system för intercellulär kommunikation, nämligen cell-cell kontakt interaktioner och släpptes lösliga molekyler, elbilar samordna normal fysiologi och förändras i olika patologier 4, 5 inklusive virusinfektioner 6, 7.

Även om båda släpptes viruspartiklar och extracellulära blåsor är mycket olika, kännetecknas de huvudsakligen av bulk analys där deras individuella egenskaper går förlorade. En metod som liknar flödescytometri, som fenotyper celler baserat på deras olika ytantigener, behövs för att karaktärisera enskilda virala och virala liknande partiklar. Tyvärr kan elbilar eller små virioner inte analyseras med hjälp av standardflödes cytoMetry metoder eftersom de är för små för att generera den ljusspridande signal på vilken de flesta cytometrar förlitar för triggning. För att kringgå denna begränsning kan fluorescens utlösande tillämpas. Emellertid är det svårt att skilja dem från fria antikroppar och deras aggregat på grund av deras liknande fluorescens och jämförbara storlekar om elbilar eller virioner färgas med fluorescerande antikroppar.

Nyligen har vi utvecklat en nanoteknikbaserade hög genomströmning metod som gör det möjligt för karakterisering av antigener på enskilda små partiklar med hjälp av vanliga flödescytometrar 8, 9. Vi använder MNP till immunocapture partiklar av intresse, såsom har beskrivits av andra grupper för olika tillämpningar 10, 11, 12, 13; Men, gör att våra nya teknik för avskiljning av enskilda specific mål följt av fenotypning av dessa infångade partiklar genom flödescytometri med användning av fluorescens utlösande snarare än ljusspridning, utan inblandning från fritt flytande antikroppar. Denna metod har breda användningsområden och kan användas för att karakterisera den antigena kompositionen enligt något viral- och icke-virala liten partikel alstras av celler in vivo och in vitro förutsatt tillgängligheten av specifika fluorescerande antikroppar mot ytantigener. Vi har redan tillämpat denna teknik för att studera flera biologiska problem.

Framför allt har vi utvärderat fördelningen av värdcellmarkörer på enskilda HIV-1-partiklar 9, studerade vi mognaden av enskilda dengue-virus (DENV) baserat på en analys av deras ytproteiner 14 och undersökte elfordon släpps ut i blodomloppet av friska frivilliga och patienter med akut kranskärlssjukdom (ACS). Även om baserat på en liknande princip, dentillämpning av den nya tekniken krävs utveckling av specifika protokoll som beskrivs nedan.

Protocol

1. Koppling av magnetiska nanopartiklar (MNP)

  1. Använd kommersiella kopplingsförfarande och reagens för att koppla MNP med antikroppar (Abs) (typiskt 1 mg). Järnoxidnanopartiklar med karboxylsyra som reaktiva grupper används.
    1. Om antikroppar är i en volym större än 0,5 ml, koncentrat med användning av en 100K anrikningsverk. Snurra vid 2000 xg under 3-5 min.
  2. I slutet av förfarandet, efter tillsats av 10 pl av släckningsbuffert, överföra MNP till en 12 mm x 75 mm rör och tillsätt 3 ml tvätt / lagringsbuffert. Placera röret i centrumhålet på en magnetisk separator och lämna över natten vid 4 ° C.
  3. Kontrollera att MNP har alla samlats vid sidan av röret, och sedan försiktigt pipettera ut all vätska. Tillsätt 3 ml färsk tvätt / lagringsbuffert och placera tillbaka i magneten.
  4. Efter flera timmar, kontrollera om MNP samlas vid sidan av röret och sedan pipettera bort vätskan. Använd 2 ml tvätt / lagringsbuffert tillresuspendera MNP och förvara vid 4 ° C.
  5. Kontrollera att Abs är kopplade till MNP genom att märka dem med en relevant fluorescerande Fab-antikroppsfragment (t.ex. get-anti-mus om du använder en mus monoklonal Ab för infångning som beskrivs i avsnitt 2) och kördes på en flödescytometer.

2. Märkning antikroppar kopplade till MNP

  1. Kombinera 60 ^ (3,9 x 10 12 partiklar) av MNP (per betingelse) och 5 | j, l (av en 200 | ig / ml kommersiell lösning) märkt Fab-fragment, som är specifika för den isotyp av infångnings Ab i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
  2. Inkubera vid rumstemperatur (RT) under 30 min med kontinuerlig blandning.
  3. Pre-våt en 100K koncentrator med 300 ul av fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och snurra i en mikrocentrifug vid 1500 x g under 5 min.
  4. Rena märkta komplex på 100K kolonn. Spin av blandningen från steg 2,2 i en mikrocentrifug vid 1500 x g under 5 min, tvätta med 200 pl PBS, och återhämta sig iursprungliga volymen.

3. Användning av märkt Ab-MNP komplex att fånga partiklar av intresse (virus eller EO)

  1. Inkubera pre-märkt MNP 60 pl (3,9 x 10 12 partiklar) med HIV (60 l) eller beredning EO (100 l).
    1. Förbered EV preparat med olika metoder. Här, rena elbilar på sackarosgradienter, samla dem från blodplättsfattig plasma med hjälp av Exosome fällningsreagens eller isolera direkt från plasma 8.
      OBS: Optimala förhållanden måste bestämmas för varje experiment och är beroende av koncentrationen av virus / EV i beredningen. MNP-Ab fraktion bör vara ~ 10 6 i överskott jämfört med koncentrationen av virus / EV-fraktionen.
  2. Inkubera 40 min vid 37 ° C med försiktig blandning under virus, eller en timme vid 4 ° C i elbilar.
  3. Tillsätt 2,5% mus-IgG / humant IgG att blockera Fc-bindning försiktigt virvel, inkubera 3-5 min vid RT.
  4. Lägg tillverkaren rekommenderade eller titrerades koncentrationer av varje detektions Abs och inkubera ytterligare 20 min vid RT.

4. Separation av MNP-tagna Virioner (eller EO) från obunden antikroppar med användning av magnetiska kolumner

  1. Förbered magnetisk separationskolonn för användning genom att placera den i en separator magnet.
  2. Pre-väta kolonnen med 500 pl tvättbuffert (2 mM etylendiamintetraättiksyra (EDTA), 0,5% bovint serumalbumin (BSA) i PBS). Göra det möjligt för tvättbuffert för att strömma genom kolonnen.
  3. Tillsätt MNP-virus / MNP-EV-komplex till kolonnen och låt all vätska att rinna igenom. Tillsätt 500 pl av tvättbuffert till kolonnen, vilket gör att hela volymen för att passera igenom.
  4. Upprepa tvätt med tvättbuffert 2 gånger.
  5. Ta bort kolumnen från magneten och placera i 12 mm x 75 mm rör för uppsamling av de kvarhållna MNP-virus / MNP-EV-komplex. Låt kolonnen stå i röret utanför magnet för 3 min. Tillsätt 200 | il av PBS och låtpärlorna rinna ner av gravitationen, lägga till ytterligare 200 pl PBS och fixa med 200 pl 4% paraformaldehyd efter eluering.
    OBS: Paraformaldehyd är ett misstänkt cancerframkallande och bör hanteras i ett dragskåp och handskar.
  6. För att kvantifiera enskilda virioner / elbilar använder volyminställningar på hög genomströmning Sampler (HTS) eller strax före förvärvet lägga välblandad flödescytometri räkna pärlor.

5. Analys av MNP-tagna virus / elbilar med en flödescytometer

  1. Värma upp flödescytometer under 30 min.
  2. Kör kvalitetskontroll pärlor.
  3. Ställ tröskel på fluorescens av antingen MNP eller märkta virus / elbilar. Använd 0,22 um filtrerad PBS för tröskeln för att minska bakgrunds "brus". Ställ in tröskelvärdet genom justering av PMT spänningen på den nivå där filtrerad PBS ger inga eller mycket få, händelser.
  4. Kör prov på låg. (Använd en extra 0,04 um inline filter för omslutande vätska placeras i serie bakomstandard 0,2 um slida filter för att ytterligare eliminera falska händelser).

6. Utvärdering av Capture Effektivitet

  1. Fånga fluorescensmärkta elbilar eller HIV med MNP-Abs som beskrivs i 3.1, 3.2. (EVS kan märkas antingen med ett membran färgämne eller genom deras last 15; HIV kan märkas antingen genom gen-kodad färgämne 16, eller med ett membran färgämne 12, 17).
  2. Förbereda magnetisk separationskolonn såsom beskrivits i (4,1-4,2).
  3. Tillsätt MNP-virus / MNP-EV-komplex till kolonnen och låt all vätska att strömma genom (flöde genom fraktion). Samla flödet genom fraktionen i röret.
  4. Fortsätt med fraktion som hölls kvar på kolonnen som beskrivits i (4,4-4,5).
  5. Upprepa fånga proceduren på flödet genom fraktion från 6,3 med efterföljande separation (4,1-4,5).
  6. Analysera de kvarhållna fraktioner från första capture och andra fånga genom att köra dem på cytometer som är inställd på triggning på fluorescerande märkning av elbilar eller HIV. För att utvärdera effektiviteten, jämföra antalet händelser i båda fraktionerna.

7. Anpassning av protokollet för specifika uppgifter

OBS: Även om protokollet kan tillämpas på analys av HIV och elfordon som beskrivits ovan, för analys av DENV följande ändringar bör införas:

  1. Inkubera virioner med 1 iM DII i mörker under 30 min vid RT. Efter inkubation rena färgade virus genom centrifugering i densitetsgradient-medium (10%, 20%, 25% och 35%) vid 240.000 xg under 1,5 h vid 4 ° C utan någon broms. Samla fraktion mellan 20% och 25% densitetsgradient medelskikt 14.
  2. Inkubera DII märkt DENV 1 x 10 7 (60 ul) med tillverkarens rekommenderade eller titreras koncentrationer av upptäckt Ab i närvaro av 2,5% mus-IgG i 20 minuter vid RT.
  3. Incubåt blandningen med pre-märkt 60 ^ (3,9 x 10 12 partiklar) MNP-capture Ab-komplex under 40 min vid 37 ° C med försiktig blandning.
  4. Separata resulterande komplexen från obundna Abs på magnetiska kolumner som beskrivits ovan och analysera på flödescytometer.

Representative Results

Selektiv fångst av cellulära antigener genom HIV-1-virioner

Med "flow virometry" det är nu möjligt att visualisera cellulära antigener på enskilda viruspartiklar. Som ett exempel har vi fokuserat på två cellulära antigener som bärs av HIV-1, LFA-1 och HLA-DR. Tidigare dessa två antigener identifierades i HIV-1 beredningar analyserats i bulk en. Vi framställde MNP i kombination med en av antikropparna mot Env HIV-protein, VRC01, och fångade med dessa MNP HIV-1-virioner (HIV-1 LAI.04 eller HIV-1 SF162 produceras i perifera mononukleära blodceller (PBMC)). Dessutom färgas vi dessa virioner med 2G12, en annan anti-ENV antikropp. Flödes virometry visade en hög heterogenitet av HIV-1-virioner beträffande närvaron av LFA-1 och HLA-DR. I genomsnitt 16,7 ± 2,0% (n = 6) och 8,6 ± 0,3% (n = 3) av HIV-1 LAI.04 virioner som genom LFA-1 och HLA-DR,respektive. Endast 4,8 ± 0,6% (n = 3) av alla virioner var positiva för båda antigenerna. Å andra HIV-1-stammen, HIV-1 SF162, dessa antigener var närvarande på 20,0 ± 4,4% (n = 6) och 10,8 ± 1,3% (n = 6) av virioner, respektive, medan båda antigenerna utfördes med 6,5 ± 0,4% (figur 1).

Fördelningen av de cellulära proteinerna var beroende av de celler som replikerade viruset. HIV-infekterade Jurkat-celler producerade virioner antigen skiljer sig från de som produceras av infekterade PBMC. Virioner av HIV-1 LAI 0,4 produceras av Jurkat-celler som genom 1,6 ± 1,4% (n = 3) och 1,6 ± 0,7% (n = 4) LFA-1 och HLA-DR respektive. För HIV-1 SF162 virioner produceras i Jurkatceller, dessa parametrar var 7,2 ± 2,5% (n = 3) och 5,6 ± 2,7% av (n = 4). Således antigenisk makeup (åtminstone för HLA-DR och LFA-1) var annorlunda för HIV-1 LAI.04 producerad av två annan celltyper (p <0,02).

Flow virometry som tillämpas för utvärdering av Dengue-virus

DENV mognad associeras med uttrycket av prM protein på virionema. Vi tillämpade flödes virometry att bedöma hur stor del av DENV produceras i BHK-1 och i LoVo celler utgör mogna virus. Virioner färgades med en lipidisk färgämne DII. Analys av enskilda infångade virioner avslöjade prM på 48,2 ± 5,3% (n = 8) av DENVs. I kontrast, 84,5 ± 3,4% (n = 4) av DENV produceras i LoVo-celler som genom prM. Resten av virioner, respektive 51,8 ± 5,3% (n = 8) och 15,5 ± 3,4% (n = 4) var prM negativa (Figur 2). Således kan flödes virometry användas för att skilja fullt mogna individen DENV från omogna (eller delvis mogna) DENV virioner.

Extracellulära blåsor släpps ut blodet friskaförsökspersoner och patienter med akut kranskärlssjukdom (ACS)

För att undersöka olika EV grupper hos patienter med ACS och friska kontroller, fångade vi elbilar från blodplättsfattig plasma (PPP) genom fluorescerande MNP kopplade med antikroppar mot CD31, CD41a, eller CD63. EV fångas upp av CD31-MNP färgades för CD41a och CD63, elbilar fångas upp av CD41a-MNP färgades för CD31 och CD63 och EVs fångas upp av CD63-MNP färgades för CD31 och CD41a (Figur 3).

Mängden EVs fångas av CD31-MNP och positiva för en eller två av de detektionsantikroppar i ACS-patienter var 3359 [2328; 5,472] EVS / ul i jämförelse med 1272 [714; 2157] EVS / l hos friska försökspersoner (p = 0,001). Den totala mängden av elbilar fångas av CD63 i ACS-patienter jämfört med friska frivilliga försökspersoner var 3541 [1318; 5,173] EV / l jämfört med 806 [488; 2,112] EVs / il (p = 0,007). Det fanns 4752 [3238; 7,173] EVS / ul i plasma från patienter med ACS fångas upp av CD41a-MNP, medan plasma från friska frivilliga försökspersoner var denna siffra betydligt lägre, 2623 [1927; 4,188] EVs / il (p = 0,015). I allmänhet, våra resultat tyder på att, medan EV belopp har mestadels ökat i ACS-patienter, storleken av ökningen var olika i olika subpopulationer av elbilar.

Figur 1
Figur 1: Selektiv inkorporering av cellulära antigener i HIV-1-virioner replikera i olika celltyper. HIV (HIV-1 LAI.04 eller HIV-1 SF162) virioner frigörs av PBMC eller Jurkat-celler infångades med VRC01-MNP och färgades med andra anti-gp120-antikroppen 2G12 och med specifika antikroppar mot HLA-DR och LFA-1. De färgade preparaten utsattes för flödesanalys för HLA-DR (vita staplar) och LFA-1 (svart bars). Medel ± SEM av tre till sex experiment 9. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2: Mognad delstaten DENV virioner. DENV produceras i BHK-21-celler (A, B) eller i LoVo celler (C, D) märktes med lipidiska färgämnet Dil och efter ultracentrifugering i densitetsgradient medium, färgades för prM protein med 2H2 antikroppar (A, C) eller med isotypkontroll IgG2a (B, D). De märkta virioner sedan fångas med 3H5-1-MNP och utsattes för flödesanalys 14. Klicka här för att se en större version av dennafigur.

Figur 3
Figur 3: Analys av elbilar från ACS-patienter och friska kontroller. Plasma elbilar fångades med CD31-MNP, CD63-MNP eller CD41a-MNP och färgades med antikroppar mot CD41a och CD63, mot CD31 och CD41a och mot CD31 och CD63, respektive. Tagna EVs, färgas med åtminstone ett av detekterings Abs, visualiserades och räknas upp i flödesanalys. Data presenteras som punktdiagram med median och kvartilavståndet (IQR). Gröna symboler: friska försökspersoner (kontroller), brun symboler: ACS-patienter. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 4
Figur 4: utvärdpå den del av flödes händelser som representerar individuella virioner. (A) HIV-1. Suspension av virioner delades upp i två delar och färgades antingen med gjorde (till vänster) eller DiO (mitten panel). Efter blandning, fjädring, som innehöll två differentiellt färgade virioner, fångades med VRC01-MNP och utsattes för flödes virometry (högra panelen). Aggregat (dubbelfärgade händelser) utgjorde mindre än 10% av den totala händelser. (B - D) DENV. Suspension av Dil-färgade virioner seriespäddes tvåfaldigt från 1: 2 till 1: 256 och förvärvade med HTS på en flödescytometer (B). Dil-DENVs märktes med 2H2 antikroppar (C) eller DII-DENVs fångades med 3H5-1-MNP (D). Förberedelser C och D seriespäddes sedan två gånger från 1: 2 till 1: 256 och förvärvade med HTS 14. Virioner verkar inte aggregera eftersom i samtliga fall därär en linjär korrelation mellan utspädningsfaktorn och antalet händelserna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 5
Figur 5: Detektion av enstaka partiklar genom flödescytometer. Dil-färgade DENV suspension serieutspäddes två gånger från 1: 2 till 1: 2048 och förvärvade med användning av en HTS på en flödescytometer. (A) Antal virus som detekteras som en funktion av utspädningsfaktorn. (B) Median fluorescensintensitet (MFI) av Dil-märkta DENV 14. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

"Bild Figur 6: Utvärdering av den del av virioner och extracellulära blåsor fångas med MNP kopplade till specifika antikroppar. Märkta HIV-1-virioner eller EVs fångades med MNP kopplade till specifika antikroppar och utsattes för flödes virometry. Efter separation på magnetiska kolonner, var genomflödet (inte kvar) fraktioner analyserades för närvaro av virioner eller elbilar av intresse som missades i den första körningen. (A) Märkta HIV-1 Bal virioner fångades med 2G12-MNP (till vänster). Genomflödesfraktionen recaptured och utsattes för flödes virometry (höger panel). I den första cykeln ca 95% av virioner av intresse fångades. (B) märkt EVs fångades med anti-CD81 MNP och isolerad på magnetiska kolumner (till vänster). Genomflödesfraktionen åter fångas och analyseras (höger panel). I den förstacykel ca 99% av vesiklarna av intresse fångades 8. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Konventionella flödescytometrar förblir viktigt verktyg för att analysera celler baserat på deras fysiska och kemiska egenskaper på individnivå 18. De grundläggande principerna för flödescytometri inte har ändrats sedan dess utveckling: en cell som passerar genom laserstrålen och sprider ljus utgör en händelse som utlöser inspelningen av fluorescerande spektra som avges av cellbundna fluorescerande antikroppar. Mindre partiklar under 300 nm kan inte upptäckas genom sidospridning av en cytometer eftersom de sprider mer ljus under större vinklar vid vilka de flesta Flödescytometer inte samla ljus 18. Tekniken beskrivs här, gör det möjligt att identifiera och analys av flera antigener på ett stort antal enskilda virus eller elbilar med konventionella flödescytometrar med fluorescens triggning.

De kritiska stegen i protokollet är kopplingen av antikroppar mot MNP. Våra experiment var utför litenMed användning av 15 nM järnoxidnanopartiklar med karboxylsyra som en reaktiv grupp såsom beskrivits tidigare 9. Enligt tillverkaren, kan varje 15 nm MNP binda högst 20 antikroppar; Vi binder cirka 10 antikroppar per 15 nm MNP. Denna beräkning bygger på mängden antikroppar före och efter kopplingen och antalet kulor / ml, mätt med nanopartiklar karakterisering och dimensionering instrumentering. I princip kan kopplingen förorsaka aggregation av partiklar och är icke önskvärt. För att kontrollera att aggregation inte händer med våra protokoll, vi kontrollerat detta med nanopartiklar karakterisering och dimensionering instrumentering. Detta instrument mäter den hydrodynamiska diametern för partiklarna, som inkluderar beläggnings och antikroppsskikten snarare än 15 nm bara kärnan. Vi fann att majoriteten av kopplade pärlor är belägna vid en enda topp (medelvärde topp vid 64,7 ± 4,2 nm med 90% av alla händelser under 73 ± 7,3 nm). Blandning av Ab-MNP complexes med virioner eller EVs i rätt proportion är viktigt så att MNP är i koncentrationen av ett flertal order högre än EVs / virioner. Detta är avgörande för att säkerställa att enstaka EO / virioner analyseras. Undvika sammanträffanden av händelserna genom att köra cytometer vid lågt flöde. Säkerställa att utlösa förvärvet den fluorescens och använda volymetriska kontroller för att mäta koncentrationen av de infångade enheter.

Emellertid kan MNP aggregera elbilar eller virioner genom tvärbindning eller genom bindning av två eller flera virioner till samma nanopartikel. För att kontrollera detta, har ett test för sammanläggning enligt beskrivningen i figur 4 som ska utföras. Även individuellt fångade virioner eller EVs kan samtidigt komma in i laserstrålen i flödescytometern. Detta skulle skapa falska positivitet för två olika antigener. För att undvika detta bör flödescytometern ställas in enligt beskrivningen och förberedelserna bör spädas. Man kan kontrollera om tillfällighet som händer genom att använda sammastrategi som beskrivs i föregående punkt. Dessutom kan avsaknaden av sammanträffande verifieras genom att analysera serieutspädningar av preparatet och bevisar att antalet händelser minskar linjärt med utspädnings medan den genomsnittliga fluorescensintensiteten av en fluorescens målat antigen förblir konstant i alla utspädningar (Figur 5). En annan fråga är att alltför få virus / elbilar kan fångas. Detta kan bero på att den verkliga bristen på virus / elbilar som bär antigener genom vilka de fångas upp av specifik MNP. Alternativt, är effektiviteten för fångst låg på grund av olika anledningar (t.ex. ineffektiv koppling av antikroppar mot MNP, avvikelse från förhållandena mellan MNP till virioner / elbilar som utvecklats för detta protokoll, etc.). För att undvika den sistnämnda möjligheten, bör effektiviteten hos infångnings vara specifikt utvärderas. Normalt bör verkningsgraden vara ca 90% som i figur 6.

Olika antikroppar kan störa på grund avsteriskt hinder med varandra eller med de antikroppar kopplade till MNP. För att kontrollera att det inte skedde en omvänd fånga protokoll måste testas (som beskrivs i avsnitt 7. Kortfattat, virioner eller EVs bör först färgas med fluorescerande upptäckt Abs och sedan fångas upp av Ab-MNP komplex med efterföljande separation från fritt flytande Abs på magnetiska kolumner.

Flödes virometry har betydande fördelar i förhållande till existerande metoder för analys av den antigena kompositionen av virioner eller elbilar. Rutin biokemiska metoder rapportera om den allmänna förekomsten av vissa proteiner i förberedelserna, men ger ingen information om heterogenitet av virioner eller EVs. Detta inkluderar immunocapture av virioner eller elbilar på stora kommersiellt tillgängliga partiklar. Sådana partiklar är typiskt av flera mikrometer i diameter och var och en av dem kan fånga hundratals eller tusentals virioner eller EVs. Därför alla efterföljande analys genomsnitt Egenskaperna hos virioner / EVsfångas av en partikel. I motsats härtill använder flödes virometry MNP av 10-15 nm i diameter och med det beskrivna protokollet minst 90% av händelser representera en enda virion eller enkel EV.

Den största begränsningen är att hela befolkningen i virioner eller elbilar i preparatet inte kan analyseras, utan bara de som fångas. Således, blir valet av antigenet genom vilken virioner eller EVs fångas kritisk. Dessutom är till skillnad från flödescytometri antalet olika antigener (antalet fluorescerande antikroppar mot olika antigener) begränsas av den lilla ytan av virioner eller EVs. Slutligen kan olika antikroppar steriskt störa varandra igen på grund av de små (jämfört med celler) yta.

Det nuvarande protokollet kan anpassas för analys av virus eller EV av vilket ursprung som helst, under förutsättning att de specifika antikroppar genom vilka de kan fångas finns tillgängliga. Analys av antigener på individuella virioner tillstånds forskare att ta itu med patogenesen av olika fraktioner av viruspopulationer. Vidare kan identifiering av enskilda elbilar i plasma gör det möjligt att spåra ursprunget till elbilar till särskilda celler och rapportera om normala eller patologiska tillstånd hos dessa celler och organ där de är bosatta.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Materials
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits Ocean Nanotech ICK-15-005
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane Millipore UFC810024
5 ml Round Bottom PP Test Tube, without Cap Falcon 352002
DEPC treated water Quality Biological  351-068-131
SuperMAG-01 magnetic separator  Ocean Nanotech SuperMAG-01
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit Thermo Fisher Scientific Z25055
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k Pall Corp OD100C34
EDTA 0.5 M Corning Cellgro 46-034-CI
Bovine Serum Albumin solution Sigma-Aldrich A9576-50ML
PBS Gibco 10010-23
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified EMS 15710
123 count eBeads  eBioscience 01-1234-42
CytoCount beads Dako S2366
AccuCheck count beads Invitrogen PCB100
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) BD Bioscience 642412
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution Thermo Fisher Scientific V22885
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
µMACS column  Miltenyi Biotec 130-042-701
OctoMACS Separator magnet Miltenyi Biotec 130-042-108
Nanodrop ThermoFisher none
NanoSight NS300 Malvern none
BD LSRII flow cytometer BD Bioscience none
Name Company Catalog Number Comments
Software
Flowjo software Flowjo
BD FACSDiva software BD

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tremblay, M. J., Fortin, J. F., Cantin, R. The acquisition of host-encoded proteins by nascent HIV-1. Immunol Today. 19, (8), 346-351 (1998).
  2. Santos, S., Obukhov, Y., Nekhai, S., Bukrinsky, M., Iordanskiy, S. Virus-producing cells determine the host protein profiles of HIV-1 virion cores. Retrovirology. 9, 65 (2012).
  3. Wolf, P. The nature and significance of platelet products in human plasma. Br J Haematol. 13, (3), 269-288 (1967).
  4. Piccin, A., Murphy, W. G., Smith, O. P. Circulating microparticles: pathophysiology and clinical implications. Blood Rev. 21, (3), 157-171 (2007).
  5. Bernal-Mizrachi, L., et al. High levels of circulating endothelial microparticles in patients with acute coronary syndromes. Am Heart J. 145, (6), 962-970 (2003).
  6. Rozmyslowicz, T., et al. Platelet- and megakaryocyte-derived microparticles transfer CXCR4 receptor to CXCR4-null cells and make them susceptible to infection by X4-HIV. Aids. 17, (1), 33-42 (2003).
  7. Bhattarai, N., et al. GB virus C particles inhibit T cell activation via envelope E2 protein-mediated inhibition of TCR signaling. J Immunol. 190, (12), 6351-6359 (2013).
  8. Arakelyan, A., Ivanova, O., Vasilieva, E., Grivel, J. C., Margolis, L. Antigenic composition of single nano-sized extracellular blood vesicles. Nanomedicine. 11, (3), 489-498 (2015).
  9. Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Margolis, L., Grivel, J. C. Nanoparticle-based flow virometry for the analysis of individual virions. J Clin Invest. 123, (9), 3716-3727 (2013).
  10. Yang, H., Liang, W., He, N., Deng, Y., Li, Z. Chemiluminescent labels released from long spacer arm-functionalized magnetic particles: a novel strategy for ultrasensitive and highly selective detection of pathogen infections. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (1), 774-781 (2015).
  11. Tang, Y., et al. Highly sensitive and rapid detection of Pseudomonas aeruginosa based on magnetic enrichment and magnetic separation. Theranostics. 3, (2), 85-92 (2013).
  12. Borlido, L., Azevedo, A. M., Roque, A. C., Aires-Barros, M. R. Magnetic separations in biotechnology. Biotechnol Adv. 31, (8), 1374-1385 (2013).
  13. Xi, Z., et al. Selection of HBsAg-Specific DNA Aptamers Based on Carboxylated Magnetic Nanoparticles and Their Application in the Rapid and Simple Detection of Hepatitis B Virus Infection. ACS Appl Mater Interfaces. 7, (21), 11215-11223 (2015).
  14. Zicari, S., et al. Evaluation of the maturation of individual Dengue virions with flow virometry. Virology. 488, 20-27 (2016).
  15. Lai, C. P., et al. Visualization and tracking of tumour extracellular vesicle delivery and RNA translation using multiplexed reporters. Nat Commun. 6, 7029 (2015).
  16. McDonald, D., et al. Visualization of the intracellular behavior of HIV in living cells. J Cell Biol. 159, (3), 441-452 (2002).
  17. Morcock, D. R., et al. Elimination of retroviral infectivity by N-ethylmaleimide with preservation of functional envelope glycoproteins. J Virol. 79, (3), 1533-1542 (2005).
  18. Shapiro, H. M. Practical Flow Cytometry. John Wiley & Sons, Inc. 101-223 (2005).
Flöde Virometry Analysera Antigen Spectra virioner och extracellulär Blåsor
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).More

Arakelyan, A., Fitzgerald, W., Zicari, S., Vagida, M., Grivel, J. C., Margolis, L. Flow Virometry to Analyze Antigenic Spectra of Virions and Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (119), e55020, doi:10.3791/55020 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter