Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles coupled to antibodies recognizing surface antigens. The captured virions or vesicles were labeled with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated in high magnetic field and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence.
Cells release small extracellular vesicles (EVs) into the surrounding media. Upon virus infection cells also release virions that have the same size of some of the EVs. Both virions and EVs carry proteins of the cells that generated them and are antigenically heterogeneous. In spite of their diversity, both viruses and EVs were characterized predominantly by bulk analysis. Here, we describe an original nanotechnology-based high throughput method that allows the characterization of antigens on individual small particles using regular flow cytometers. Viruses or extracellular vesicles were immunocaptured with 15 nm magnetic nanoparticles (MNPs) coupled to antibodies recognizing one of the surface antigens. The captured virions or vesicles were incubated with fluorescent antibodies against other surface antigens. The resultant complexes were separated on magnetic columns from unbound antibodies and analyzed with conventional flow cytometers triggered on fluorescence. This method has wide applications and can be used to characterize the antigenic composition of any viral- and non-viral small particles generated by cells in vivo and in vitro. Here, we provide examples of the usage of this method to evaluate the distribution of host cell markers on individual HIV-1 particles, to study the maturation of individual Dengue virions (DENV), and to investigate extracellular vesicles released into the bloodstream.
çok hücreli organizmalarda hücreler, belirli bir hücre için özel olarak mevcut ya da en azından hücre özel gruplarına ait olabilir birçok bireysel özelliklere sahiptir. onların çeşitli morfoloji ile kanıtlandığı gibi, hatta kültürlü klonlanmış hücreler bireysel özellikleri göstermektedir. Ayrıca, bir hücrenin bireysellik o salgılar ürünlerde yansımaktadır. viral enfeksiyon durumunda, viral partiküller onları üreten hücrelerden proteinlerin taşıyabilir. Örneğin, HIV için birçok konakçı hücre proteinleri viral zarf gömülür ve farklı hücreler tarafından üretilen virüs, bu karakteristik proteinleri, 1, 2 ya da "hücre imza" taşıyabilir.
Hatta enfeksiyon olmadan, hücreler çevredeki medya, küçük hücre dışı veziküller (AGH) içine bırakın. Bu veziküller ve birçok durumda da yapının Biogenesis, virüsler, özellikle retrovirüsler bu benzerler. Son yıllarda netleştiBaşlangıçta "trombosit toz" 3 olarak kabul edildi AGH, hücre-hücre iletişim önemli bir fizyolojik sistem oluşturduğunun. Birlikte arası iletişim, yani hücre-hücre temas etkileşimlere ve serbest çözünür moleküllerin iki diğer sistemlerle EVS normal fizyoloji koordine etmek ve çeşitli patolojilerin viral enfeksiyonlar 6, 7 de dahil olmak üzere 4, 5 değiştirilir.
serbest viral partiküller ve hücre dışı kesecikler hem oldukça çeşitli olmasına rağmen, onların bireysel özellikleri kaybolur hangi toplu analizi ile ağırlıklı olarak karakterize edilir. Farklı yüzey antijenleri göre hücreler fenotip akış sitometrisi benzer bir yöntem olup, ayrı ayrı, viral ve viral-benzeri partiküller karakterize etmek için gereklidir. Ne yazık ki, AGH veya küçük virionlar standart akış CYTO kullanılarak analiz edilemezmetry yöntemler onlar en sitometrelerinde tetiklenmesi için dayandığı ışık saçılım sinyali üretmek için çok küçük olduğu için. Bu sınırlamayı aşmak için, tetikleme floresans uygulanabilir. AGH veya virionlar floresan antikor ile boyandı eğer Ancak, çünkü onların benzer floresan ve karşılaştırılabilir boyutlarda serbest antikorlar ve onların agrega ayırt etmek zordur.
Son zamanlarda, düzenli akış sitometre 8, 9 kullanarak bireysel küçük parçacıkların üzerindeki antijenlere karakterizasyonu sağlayan bir nanoteknoloji tabanlı yüksek verimlilik yöntem geliştirdi. Muhtelif uygulamalar 10, 11, 12, 13, diğer gruplar tarafından tarif edilmiş gibi, ilgi konusu Immunocapture partiküllerine MNPS kullanır; Ancak, bizim yeni teknik bireysel speci yakalanması için izin verirfic hedefleri serbest dalgalı antikorlar müdahalesi olmaksızın, ışık saçılması yerine tetikleme floresan kullanılarak flow sitometri ile bu yakalanan parçacıkların feno izledi. Bu yöntem geniş bir uygulama alanı vardır ve in vivo olarak hücreler tarafından üretilen herhangi bir vira- ve viral olmayan küçük bir parçacık antijenik bileşimi karakterize etmek için kullanılabilir ve in vitro olarak bir yüzey antijenine karşı spesifik floresan antikorlar durumu Resim. Biz zaten birkaç biyolojik sorunları incelemek için bu tekniği uyguladık.
Özellikle, bireysel HIV-1 parçacıkların 9 konak hücre belirteçleri dağılımını değerlendirdi, biz onların yüzey proteinleri 14 analizine dayanan bireysel Dang virüsleri (DENV) olgunlaşmasını okudu ve sağlıklı gönüllüler ve hastalar kan dolaşımına salınır AGH araştırıldı akut koroner sendrom (AKS). benzer prensiplere göre, ancakYeni yöntemin uygulanması aşağıda açıklanmaktadır özel protokoller geliştirilmesini gerektirmiştir.
Geleneksel akış sitometrelerinde bireysel düzeyde 18 fiziksel ve kimyasal özelliklerine göre hücrelerin analiz etmek için önemli bir araçtır kalır. akış temel ilkeleri sitometri gelişimi beri değişmiş değil: Lazer ışınına geçer ve ışık dağıtır hücre hücre bağlı floresan antikorlar tarafından yayılan floresan spektrumları kayıt tetikleyen bir olay oluşturur. Onlar en 18 ışık toplamak yok akış sitometresi hangi büyük açılar altında daha fazla ışık dağılım olarak 300 nm altında daha küçük parçacıkların bir Sitometre yan dağılım ile tespit edilemez. Burada anlatılan teknik, tanımlama ve floresan tetikleme geleneksel akış sitometrelerinde sayısız bireysel virüs ya da AGH birden antijenlerin analizi sağlar.
protokolü içinde kritik adımlar MNPS antikorların bağlantı vardır. Bizim deneyler performan- edildiMed bir reaktif grup karboksilik asit ile 15 mil demir oksit nano-tanecikleri kullanılarak, daha önce tarif edildiği gibi 9. Üreticiye göre, her bir 15 mil MNP 20 antikorlarının fazla bağlanırlar; Biz yaklaşık 15 nm MNP başına 10 antikorları bağlarlar. Bu tahmin önce ve birleştirme sonrası antikor miktarı ve nanoparçacık karakterizasyonu ve boyutlandırma cihazlarla ölçülerek boncuk / mL sayısına dayanır. Prensip olarak, birleştirme partiküllerinin agregasyonunu neden olabilir ve istenmeyen olabilir. Bu toplama bizim protokol ile olmuyor kontrol etmek için, biz nanoparçacık karakterizasyonu ve boyutlandırma enstrümantasyon ile bu doğrulandı. Bu cihaz kaplama ve antikor katmanları ziyade sadece 15 nm çekirdek içeren parçacıklar için hidrodinamik çap ölçer. Biz birleştiğinde boncuk çoğunluğu tek bir zirvede yer aldığını (73 ± 7.3 nm altındaki tüm olayların% 90 ile 64.7 ± 4.2 nm zirveye demek) bulundu. Ab-MNP co karıştırmaSağ orantılı virionlar ya AGH mplexes MNPS EVs / virionlar daha yüksek birkaç emir konsantrasyonunda yani çok önemlidir. Bu tek EVs / virionlar analiz olduğundan emin olmak için önemlidir. Düşük debide sitometresinde çalıştırarak olayların tesadüfler kaçının. floresan üzerinde edinimi tetikleyebilir ve yakalanan kişilerin konsantrasyonunu ölçmek için hacimsel denetimlerini kullanmak için emin olun.
Bununla birlikte, çapraz bağlama MNPS veya aynı nanopartikül iki veya daha fazla virion arasında bağlanarak EVs veya virionlar burada toplayabilir. Bunu kontrol etmek için, Şekil 4'te tarif edildiği gibi toplama için bir test gerçekleştirilmelidir. Hatta tek tek yakalanan virionlar veya AGH aynı anda akış sitometresinin lazer ışınını girebilir. Bu iki farklı antijen için yanlış pozitif yaratacak. Bunu önlemek için, tarif edildiği gibi akış sitometrisi ayarlanmalıdır ve preparasyonlar seyreltilmelidir. Bir aynı kullanarak tesadüf oluyor olmadığını kontrol edebilirsinizBir önceki nokta açıklandığı gibi strateji. Ayrıca, rastlantı olmaması hazırlama seri dilüsyonları analiz etmek ve floresan lekeli antijenin ortalama florasan yoğunluğu tüm seyreltileri (Şekil 5) sabit kalırken olay sayısı dilüsyonu ile doğrusal olarak azalmaktadır ispatlanması belirlenebilir. Başka bir sorun çok az virüs / AGH yakalanabilir olmasıdır. Bunun nedeni virüsler / spesifik MNPS tarafından yakalanır hangi aracılığıyla antijenleri taşıyan AGH gerçek kıtlığı olabilir. Alternatif olarak, yakalama etkinliği çeşitli nedenlerden dolayı düşüktür (örneğin, MNPS, bu protokol için geliştirilen virionlar / AGH ile MNPS oranları sapma, vb antikorların verimsiz bağlantı). İkinci olasılığını önlemek için, yakalama etkinliği özellikle değerlendirilmelidir. Tipik haliyle, verimlilik, Şekil 6'daki gibi yaklaşık% 90 olmalıdır.
Farklı antikorlar nedeniyle engelleyebilirbirbirleriyle veya MNPS bağlı antikorlar ile sterik engelleme. Bunun üzerine serbest dalgalı Abs Daha sonraki ayrılığı Ab-MNP kompleksleri ilk floresan algılama Abs ile boyanmış olmalıdır Bölüm 7. Kısaca, virionlar veya AGH açıklanan ve daha sonra yakalanan bir ters yakalama protokolü (test edilmelidir olmadı kontrol etmek için manyetik sütunlar.
Akış virometry virionlar ya EVs antijenik bileşimi analizi, mevcut yöntemlere göre önemli avantajlara sahiptir. Rutin biyokimyasal yöntemler hazırlıklarında belirli proteinlerin genel varlığına rapor, ancak virionlar veya EVs heterojenliği hiçbir bilgi sağlar. Bu büyük ticari olarak temin edilebilen parçacıkları üzerinde virionlar ya EVs Immunocapture içerir. Bu parçacıklar çapı birkaç mikron arasında tipik olarak ve her biri virionlar ya EVs yüzlerce ya da binlerce yakalayabilir. Bu nedenle, herhangi bir sonraki analiz ortalamalara virionlar / AGH özellikleribir parçacık tarafından yakalanan. Bunun aksine, akış virometry olayların en az% 90 tek bir virion, ya da tek bir EV temsil çapında ve tarif edilen protokol ile 10-15 nm MNPS kullanır.
Ana sınırlama hazırlık virionlar veya EVs tüm nüfus analiz olmayabilir, ama sadece o yakalanır söyledi. Bu nedenle, virionlar ya EVs yakalanır, üzerinden antijen seçimi kritik hale gelir. Ayrıca farklı antijenlerin sayısı (çeşitli antijenlere karşı floresan antikorlar sayısı) sitometrisi farklı akış virionlar ya EVs küçük bir yüzey ile sınırlandırılmıştır. Son olarak, farklı antikorlar sterik nedeniyle küçük (hücrelere kıyasla) yüzeye tekrar birbirleri ile etkileşime girebilir.
Mevcut protokolü de yakalanabilir nedeniyle, özel antikorlar mevcut olduğu sürece, herhangi bir virüs ya da herhangi bir kökenli EV analizi için adapte edilebilir. Bireysel virionlar izin üzerindeki antijenlere Analizis araştırmacılar, viral popülasyonların farklı fraksiyonları patogenezi ele. Ayrıca, plazma bireysel EVs tanımlanması mümkün özellikle hücrelere EVs izini ve normal veya patolojik bu hücrelerin koşulları ve içinde bulundukları organ hakkında rapor yapabilir.
The authors have nothing to disclose.
This work of AA, SZ, WF, J-C.G, and LM was supported by the NICHD Intramural Program. The work of MV was supported by the Russian Federation Government grant #14.B25.31.0016.
Materials | |||
Carboxyl Magnetic Iron Oxide Nanoparticles Conjugation Kits | Ocean Nanotech | ICK-15-005 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-100 membrane | Millipore | UFC810024 | |
5mL Round Bottom PP Test Tube, without Cap | Falcon | 352002 | |
DEPC treated water | Quality Biological | 351-068-131 | |
SuperMAG-01 magnetic separator | Ocean Nanotech | SuperMAG-01 | |
Zenon R-Phycoerythrin Mouse IgG1 Labeling Kit | Thermo Fisher Scientific | Z25055 | |
Nanosep Centrifugal Devices with Omega Membrane 100k | Pall Corp | OD100C34 | |
EDTA 0.5M | Corning Cellgro | 46-034-CI | |
Bovine Serum Albumin solution | Sigma-Aldrich | A9576-50ML | |
PBS | Gibco | 10010-23 | |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified | EMS | 15710 | |
123count eBeads | eBioscience | 01-1234-42 | |
CytoCount beads | Dako | S2366 | |
AccuCheck count beads | Invitrogen | PCB100 | |
Cytometer Setup & Tracking Beads Kit (CST) | BD Bioscience | 642412 | |
Vybrant DiI Cell-Labeling Solution | Thermo Fisher Scientific | V22885 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
µMACS column | Miltenyi Biotec | 130-042-701 | |
OctoMACS Separator magnet | Miltenyi Biotec | 130-042-108 | |
Nanodrop | ThermoFisher | none | |
NanoSight NS300 | Malvern | none | |
BD LSRII flow cytometer | BD Bioscience | none | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Software | |||
Flowjo software | Flowjo | ||
BD FACSDiva software | BD |